一种负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统的制备方法及其应用，可有效解决现有抗肿瘤药物用于肿瘤治疗的靶向性差、毒副作用大、半衰期短、给药剂量大、功能单一等问题，阿霉素通过二硫键作为连接臂与羟基氯喹相连形成自组装纳米粒，然后将吲哚菁绿物理吸附到此纳米粒中，再用磷脂聚乙二醇叶酸包裹纳米粒形成负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统，所述的二硫键为3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸，磷脂聚乙二醇叶酸的分子量为1~4kDa，本发明合成工艺简单方便，具有良好的生物相容性、高靶向性、还原敏感性、低毒性等优点，是肿瘤诊断治疗用药物制剂上的创新。

说明书

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，恶性肿瘤的发病率呈现上升趋势。据有关数据显示，我国居民恶性肿瘤死亡率比70年代中期增加了82.3％。随着社会经济发展和人民生活水平提高，饮食结构改变以及人口老龄化、城市化，慢性非传染性疾病已经成为导致死亡的主要原因。其中，恶性肿瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已经成为严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病。

阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，如乳腺癌、肺癌、软组织肿瘤、骨肉瘤、膀胱癌等，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。目前已上市的盐酸阿霉素注射剂在临床上使用时由于缺乏靶向性产生许多毒性反应，如心脏毒性、抑制骨髓造血功能以及胃肠道反应等。

羟基氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)是一种4-氨基喹啉衍生物类抗疟药，主要用于控制疟疾临床症状和疟疾的抑制性预防。但有研究表明，羟基氯喹通过抑制肿瘤细胞溶酶体功能而抑制自噬，自噬是细胞在各种应激下维持自身内环境稳态的代谢过程，许多研究表明化疗诱导的自噬对肿瘤具有保护作用，因而抑制自噬将逆转肿瘤对化疗的耐受，具有抗肿瘤作用。因而羟基氯喹与化疗药物如阿霉素联合可增加其对肿瘤细胞的毒性作用。

吲哚菁绿(IndocyanineGreen,ICG)是一类近红外染料，其作为近红外荧光染料在生命科学和生物医学研究中具有重要的研究价值，是药物研究中常用的荧光标记物。基于它独特的性质,吲哚菁绿是美国FDA批准的唯一的具有近红外特性的光学诊断因子,同时也是一种理想的光吸收剂用来进行激光介导的光热治疗。这种近红外的染料可以作为一种理想的对比剂来发展集光学成像和光热治疗于一体的双功能靶向探针。

但到目前为止，临床上应用的给药系统具有缺乏靶向性、半衰期短、给药剂量大、毒副作用大、功能单一的缺点。因此发明一种具有靶向性强、长循环、给药量小、毒副作用小、多功能的给药系统是亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统的制备方法及其应用，可有效解决现有抗肿瘤药物用于肿瘤治疗的靶向性差、毒副作用大、半衰期短、给药剂量大、功能单一等问题。

本发明解决的技术方案是，阿霉素(DOX)通过二硫键作为连接臂与羟基氯喹(HCQ)相连形成自组装纳米粒，然后将吲哚菁绿(ICG)物理吸附到此纳米粒中，再用磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)包裹纳米粒形成负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统，所述的二硫键为3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸，磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)的分子量为1～4kDa(即1000-4000道尔顿)，具体步骤是：

(1)合成自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)：

①取作为连接臂的3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸10mg～1g和二氯亚砜1.0～10.0ml置于烧瓶中，加入15μlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，85℃搅拌回流4h，颜色由浅黄色变为橘黄色；用旋转蒸发仪除去多余的二氯亚砜，再加入0.5～5.0mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，得酰氯溶液；

②取羟基氯喹0.1～1.0mmol溶于0.5～5.0ml反应溶剂中，加入20～200μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加到酰氯溶液中，35～85℃油浴下反应2～8h，得酰氯化的羟基氯喹溶液；

③将0.1～1.0mmol阿霉素(DOX)溶于1.0～5.0ml反应溶剂中，加入20～200μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加入酰氯化的羟基氯喹溶液中，35～85℃油浴下搅拌3～12h，得反应物，反应物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3小时换一次水，冷冻干燥，得自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)；

所述的反应溶剂为甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂，或其它类似溶剂以及其它类似溶剂的混合物；

(2)自组装纳米粒负载吲哚菁绿(ICG/DOX-S-S-HCQ)的制备：

①称取0.5～10.0mg自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)溶于0.5～5.0ml二甲基亚砜(DMSO)或乙醇中；

②称取吲哚菁绿(ICG)0.1～5.0mg，溶于10～100ml超纯水中，成吲哚菁绿溶液；

③搅拌下将自组装纳米粒溶液滴加到吲哚菁绿溶液中，冰浴下探头超声5～30min，得包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒；

(3)磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)包裹负载吲哚菁绿的纳米粒(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制备：

称取磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)0.1～5.0mg溶于浓度为1～8wt％的乙醇水溶液2～10ml中，加热到45～85℃至完全溶解，成磷脂聚乙二醇叶酸溶液；然后将包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒滴加到磷脂聚乙二醇叶酸溶液中，涡旋1～5min，室温下搅拌3～8h，将溶液用截留分子量3500的透析袋透析6～12h，每2小时换一次水，即得负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)。

本发明制备的负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)可有效用于对肿瘤的治疗，实现在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明合成工艺简单方便，具有良好的生物相容性、高靶向性、还原敏感性、低毒性等优点，是肿瘤诊断治疗用药物制剂上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：

(1)合成自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)：

①取作为连接臂的2，2’-二硫代二乙酸54.6mg和二氯亚砜1.8ml置于圆底烧瓶中，加入15μlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，85℃搅拌回流4h，颜色由浅黄色变为橘黄色；用旋转蒸发仪除去多余的二氯亚砜，再加入1mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，得酰氯溶液；

②取羟基氯喹0.3mmol溶于0.9mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入60μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加到酰氯溶液中，45℃油浴下反应8h，得酰氯化的羟基氯喹溶液；

③将0.3mmol阿霉素(DOX)溶于1.8mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入60μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加入酰氯化的羟基氯喹溶液中，55℃油浴下搅拌8h，得反应物，反应物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3小时换一次水，冷冻干燥，得自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)；

(2)自组装纳米粒负载吲哚菁绿(ICG/DOX-S-S-HCQ)的制备：

①称取4mg自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)溶于0.6ml二甲基亚砜中；

②称取吲哚菁绿0.6mg，溶于12ml超纯水中，成吲哚菁绿溶液；

③搅拌下将自组装纳米粒溶液滴加到吲哚菁绿溶液中，冰浴下探头超声20min，得包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒；

(3)磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)包裹负载吲哚菁绿的纳米粒(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制备：

称取磷脂聚乙二醇叶酸0.6mg溶于浓度为4wt％的乙醇水溶液3ml中，加热到55℃至完全溶解，成磷脂聚乙二醇叶酸溶液；然后将包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒滴加到磷脂聚乙二醇叶酸溶液中，涡旋3min，室温下搅拌6h，将溶液用截留分子量3500的透析袋透析6h，每2小时换一次水，即得负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)。

实施例2

本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：

(1)合成自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)：

①取作为连接臂的3，3’-二硫代二丙酸84mg和二氯亚砜2.4ml置于烧瓶中，加入15μlN,N-二甲基甲酰胺，85℃搅拌回流4h，颜色由浅黄色变为橘黄色；用旋转蒸发仪除去多余的二氯亚砜，再加入1.5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，得酰氯溶液；

②取羟基氯喹0.4mmol溶于1.2mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入80μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加到酰氯溶液中，55℃油浴下反应6h，得酰氯化的羟基氯喹溶液；

③将0.4mmol阿霉素(DOX)溶于2.4mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入80μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加入酰氯化的羟基氯喹溶液中，45℃油浴下搅拌10h，得反应物，反应物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3小时换一次水，冷冻干燥，得自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)；

(2)自组装纳米粒负载吲哚菁绿(ICG/DOX-S-S-HCQ)的制备：

①称取6mg自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)溶于0.8ml二甲基亚砜中；

②称取吲哚菁绿(ICG)0.8mg，溶于16ml超纯水中，成吲哚菁绿溶液；

③搅拌下将自组装纳米粒溶液滴加到吲哚菁绿溶液中，冰浴下探头超声20min，得包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒；

(3)磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)包裹负载吲哚菁绿的纳米粒(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制备：

称取磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)0.9mg溶于浓度为5wt％的乙醇水溶液4ml中，加热到65℃至完全溶解，成磷脂聚乙二醇叶酸溶液；然后将包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒滴加到磷脂聚乙二醇叶酸溶液中，涡旋4min，室温下搅拌5h，将溶液用截留分子量3500的透析袋透析8h，每2小时换一次水，即得负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)。

实施例3

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

(1)合成自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)：

①取作为连接臂的3，3’-二硫代二丙酸105mg和二氯亚砜3ml置于烧瓶中，加入15μl二甲基甲酰胺(DMF)，85℃搅拌回流4h，颜色由浅黄色变为橘黄色；用旋转蒸发仪除去多余的二氯亚砜，再加入2ml二甲基甲酰胺(DMF)，得酰氯溶液；

②取羟基氯喹0.5mmol溶于1.5ml甲酰胺中，加入100μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加到酰氯溶液中，75℃油浴下反应4h，得酰氯化的羟基氯喹溶液；

③将0.5mmol阿霉素(DOX)溶于3ml甲酰胺中，加入100μl三乙胺，冰浴搅拌下滴加入酰氯化的羟基氯喹溶液中，35℃油浴下搅拌12h，得反应物，反应物用截留分子量1000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3小时换一次水，冷冻干燥，得自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)；

(2)自组装纳米粒负载吲哚菁绿(ICG/DOX-S-S-HCQ)的制备：

①称取8mg自组装纳米粒(DOX-S-S-HCQ)溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；

②称取吲哚菁绿(ICG)1mg，溶于20ml超纯水中，成吲哚菁绿溶液；

③搅拌下将自组装纳米粒溶液滴加到吲哚菁绿溶液中，冰浴下探头超声20min，得包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒；

(3)磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)包裹负载吲哚菁绿的纳米粒(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)的制备：

称取磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA)1.2mg溶于浓度为6wt％的乙醇水溶液5ml中，加热到75℃至完全溶解，成磷脂聚乙二醇叶酸溶液；然后将包载吲哚菁绿(ICG)的自组装纳米粒滴加到磷脂聚乙二醇叶酸溶液中，涡旋5min，室温下搅拌3h，将溶液用截留分子量3500的透析袋透析10h，每2小时换一次水，即得负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA)。

由上述可知，本发明选用3，3’-二硫代二丙酸(或2，2’-二硫代二乙酸等类似物)为连接臂，连接含有氨基的阿霉素(DOX)和含有羟基的羟基氯喹(HCQ)；DOX-S-S-HCQ在水中可以自组装形成纳米粒，粒径在100～200nm之间，与吲哚菁绿(ICG)混合后可以形成包载ICG的纳米粒。然后将此纳米粒包载于磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA，1～4kDa)中：二硫键为还原响应型化学键，通过肿瘤细胞中高表达的谷胱甘肽的作用，迅速断裂，使得抗肿瘤药物高效释放；羟基氯喹具有抗肿瘤细胞自噬作用，能协同增强阿霉素的抗肿瘤毒性；吲哚菁绿具有荧光成像和光热治疗作用；此外，在药物表面进行磷脂聚乙二醇叶酸(DSPE-PEG-FA，1～4kDa)修饰后，可以延长给药系统的半衰期和提高它在血液循环中的稳定性、改变给药系统的生物学分布,并具有靶向性。本发明是一种兼具肿瘤靶向，荧光成像，热疗与化疗相结合，诊断与治疗为一体的新型药物体系ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA。并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：

1、负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统(负载吲哚菁绿的自组装多功能纳米靶向系统又称ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂)中DOX的含量测定：

采用紫外分析法测定DOX的含量，以公式(1)计算样品的载药量，载药量达到36.0％，

2、ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂的粒径和电位表征：

取适量ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂用水稀释至适宜浓度后，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为130.2nm和-23.2±0.30mv。

3、ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂对MCF-7细胞的增殖抑制试验：

按照细胞传代的步骤将MCF-7细胞处理到单细胞悬液，计数后每孔接种5×10³个细胞于96孔板上，培养箱培养(37℃，5％CO₂)24h，待细胞贴壁完全后弃去原培养基后加药，ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA组，DOX-S-S-HCQ组，以及DOX组，所加药物浓度以阿霉素(DOX)浓度呈一系列梯度用不含血清的培养基配制而成，DOX的浓度梯度依次为0,0.039,0.078,0.156,0.313,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml，ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA组设有808nm激光对照组，并于加药后一段时间照射808nm激光3min(功率2.0)，继续培养48h后取出培养板，每孔加入50μl预冷的50％三氯乙酸，终浓度为10％，静置5min；移至4℃冰箱中静置1h，取出，用超纯水洗5遍，室温空气中干燥完全后，每孔中加入1％乙酸配制的SRB50μl，室温下染色20min，倒掉染液，用1％乙酸洗5遍，除去孔中未结合的染料，室温空气干燥后用pH10.5的10mmol/lTris碱液150μl溶解，在空气加热摇床中震荡10min，于酶联免疫检测仪上测定各孔在515nm处的光吸收度值。计算抑制率(％)＝(1-实验组A/对照组A)×100％，由此得出上述样品的半数抑制浓度(IC50)依次为：ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA热疗组，ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA非热疗组，DOX-S-S-HCQ组，DOX组分别为0.5249,1.0132,1.0182,1.613μg/ml。

4、ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂对MCF-7细胞流式摄取试验：

将实验分为DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA组，DOX-S-S-HCQ组，DOX组，另设有空白细胞组。取对数生长期的MCF-7细胞按照细胞传代的步骤处理成单细胞悬液，计数之后铺上六孔板，每孔细胞数为3×10⁵个/孔，培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h，贴壁完全后，弃去培养基，加入用不含血清的培养基配制的药物，分别设置0.5h，1h，2h，4h，6h的时间段进行后期处理，药液吸入对应EP管中，用PBS洗2遍，然后用0.5ml的不含EDTA的胰酶消化处理1min，加入培养基1ml，吸入对应的EP管，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中加入2mlPBS吹打均匀，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中，加入0.5mlPBS吹打均匀后转移到1.5mlEP管中置于冰盒，等待流式上机检测，测得时间点6h对MCF-7的流式摄取量依次为：59.4％,75.2％,90.3％。

5、ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂的药效学试验：

准备10只雌性小鼠进行S-180肉瘤腹水培养，两周后抽取腹水，用于小鼠实体瘤的种植，当肿瘤的体积达到100mm³以上时，肿瘤模型接种成功，将荷瘤小鼠随机分为八组，每组八只，分组情况如下：(1)空白组；(2)空白-激光组；(3)DOX组；(4)DOX-激光组；(5)DOX-S-S-HCQ组；(6)DOX-S-S-HCQ激光组；(7)ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA组；(8)ICG/DOX-S-S-HCQ/DSPE-PEG-FA激光组。然后进行隔日给药，给药剂量按人鼠剂量换算为4mg/kg，尾静脉注射给药。每天观察小鼠的生存状况并且称体重量瘤体积(肿瘤体积V＝A×B²/2)，然后通过相对瘤体积R＝V/V₀的变化(V₀为给药前一天瘤体积的大小)评价药物抗肿瘤活性。记录的数据表明，给药结束时和给药前相比，各组瘤体积抑制率依次为0.02％、2.59％、47.36％、53.56％、70.23％、74.62％、74.03％、86.45％，具有显著抑制肿瘤体积之效果，可用于制备抗肿瘤药物。

实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益效果：

1、本发明基于高浓度的生物还原性谷胱甘肽提供了肿瘤组织还原性微环境，选择含有二硫键的连接臂连接抗肿瘤药阿霉素和羟基氯喹，利用此触发机制可以实现抗肿瘤药物在生物体内快速、靶向释放药物和减少抗肿瘤药物的毒副作用；此外，羟基氯喹的抗自噬作用与阿霉素的抗肿瘤作用协同，可显著增强阿霉素对肿瘤组织的杀伤力；

2、本发明集光学成像和光热治疗于一体，疗效好，可提高10-30％；

3、本发明所形成的载体具有生物相容性好、长循环、载药形式多样、肿瘤靶向性好等，非常有利于肿瘤的治疗，有效率可提高到80％以上，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。