一种调节厌氧食气微生物发酵产物中酸醇比例的方法

摘要

本发明的目的是提供一种调节厌氧食气微生物发酵产物中酸醇比例的培养方法，即通过改变培养条件，实现调节发酵产物中酸醇比例的目的。具体是通过对培养基条件的改变，在振荡培养体系中调整发酵产物醇类物质比例的目的。本发明的提高厌氧食气微生物发酵产物中醇类物质比例的方法，是调节体系的初始pH和mes浓度，较高的初始pH和较低的mes浓度可以显著提高发酵产物中酸类物质的比例；略低的初始pH和mes浓度可以显著提高发酵产物中醇类物质的比例。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种调节厌氧食气微生物发酵产物中酸醇比例的方法。

技术背景

作为世界资源消费大国，我国正面临化石资源逐渐耗竭、碳排放量日益增加的严峻形势，石油、天然气等化石资源的过度使用带来了能源和化学品的可持续开发利用以及环境污染等诸多社会热点问题。调整能源结构、开发可再生资源成为我国实现可持续发展的必然选择。含碳气体是指由CO为主要组分的一类混合气体。这类气体组成多为CO，CO₂和H₂，是一类极具开发价值的制造石化类化学品的廉价原料。厌氧食气微生物可以将气体中的含碳成分转化为具有较高价值的化学品，如乙醇、丁醇、PHA等重要化合物，可以作为石化产品的优良替代。在这类微生物的发酵产物中，不仅含有醇类物质，同时也含有很多小分子有机酸类物质，根据产品需求和下游工艺要求不同，需要的产物类别也不尽相同。然而，这类微生物的发酵特征复杂，缺乏对发酵产物有目的性地生产调控手段，限制了厌氧食气微生物的应用。因此，如果能够有目的地调节厌氧食气菌气体发酵产物中酸醇比例，将会极大地扩展厌氧食气菌的发酵应用，实现绿色生物工艺的产业化发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种调节厌氧食气微生物发酵产物中酸醇比例的培养方法，即通过改变培养条件，，实现调节发酵产物中酸醇比例的目的。

本发明涉及的调节厌氧食气微生物发酵产物中酸醇比例的方法，是通过控制培养体系的初始pH值和2-吗啉乙磺酸MES用量来实现的；

为了提高厌氧食气微生物发酵产物中酸产物的比例，是提高体系的初始pH值，同时降低MES的用量；

其中所述的提高体系的初始pH值，作为优选，是将pH值调节为6

所述的降低MES的用量，作为优选，是指MES的添加浓度为0.1g/L

为了提高厌氧食气微生物发酵产物中醇产物的比例，是降低体系的初始pH值，同时降低MES的用量；

其中所述的提高体系的初始pH值，作为优选，是将pH值调节为5；

所述的降低MES的用量，作为优选，是指MES的添加浓度为0.1g/L

本发明还提供一种用于上述方法的培养基，所使用的培养基包括有2％-4％的矿物元素储液(mineralsolutionstock(V/V))，0.05％的酵母提取物(M/V)，，0.5％的还原剂储液(reducingagentStock(V/V))，0.1％的微量元素储存液(V/V)；

其中Mineralsolutionstock(M/V)的组成为：8％氯化钠，10％氯化铵，1％氯化钾，1％的磷酸二氢钾，2％的硫酸镁和0.4％的氯化钙；

ReducingAgentStock(M/V)的组成为0.9％的氢氧化钠，4％的L-半胱氨酸盐酸盐和4％的九水硫化钠。

微量元素液储存液(M/V)的组成为1％的氨三乙酸，0.5％的硫酸镁，0.4％的硫酸亚铁铵，0.1％的氯化钴，0.1％的硫酸锌，0.01％的氯化镍，0.01％的硒酸钠和0.01％的钨酸钠。

本发明的能够有效的调节厌氧食气微生物气体发酵产物中醇类物质的比例，有效的提高技术价值。

具体实施方式

厌氧食气菌的气体代谢过程非常复杂，涉及到多种发酵产物的产生和回用，以及能量ATP的产生与消耗的平衡。发酵体系条件的调控对最终的发酵结果影响很大。申请人发现，pH和pH缓冲剂MES可以显著影响发酵产物中有机酸与醇的比例。较高的pH和MES浓度有利于有机酸类物质的积累和ATP的产生，反之，较低的pH和MES浓度有利于醇类物质的积累，但会由于缺乏产酸阶段ATP的累积而导致总产量不高。因此如何平衡菌体发酵的过程，实现目的产物产率的最大化，是非常关键的。

其中本发明的厌氧食气微生物发酵产物中所述的酸产物为乙酸、正丁酸、正己酸，醇产物为乙醇、正丁醇、正己醇

本发明实施例中使用的微生物为厌氧食气微生物，例如Clostridiumcarboxidivorans菌株P7(DSM15243)和菌株ClostridiumautoethanogenumDSM10060,购买自德国布伦瑞克的莱布尼兹研究所的德国微生物与细胞培养物保藏中心。

所用的培养基，包括但不限于Clostridiumcarboxidivorans菌株和菌株Clostridiumautoethanogenum的培养基。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例中的操作方法如下：

恒温振荡培养：在100ml体系中加入2ml的mineralsolutionstock，0.05g的酵母提取物，调节体系初始pH范围5-6，MES浓度为0.1-5g/L，5mlreducingagentStock，以2L/min的速度充入99.999％的氮气5min后密封，在121度高温灭菌20min。灭菌后冷却至40度左右，再加入0.1ml的微量元素储存液，完成培养体系构建。接入培养至对数生长期的Clostridiumcarboxidivorans菌株P7或ClostridiumautoethanogenumDSM10060培养液10ml，再以2L/min流速，0.4bar压力持续通入模拟合成气(气体组成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)平衡5min，加压至0.6bar密封。在37度，180rpm下振荡培养，每隔一定时间取样进行发酵产物检测。

实施例1

调节体系初始pH＝6.0，MES浓度为5g/L，其他条件见具体操作方法，体系在恒温摇床中进行振荡培养，每隔一定时间取出样品以HPLC法进行发酵液中乙酸、乙醇和丁醇浓度的检测。在发酵6天之后，体系中乙醇浓度为0.34g/L，丁醇0g/L，乙酸1.47g/L，酸醇物质的比例为4.3：1，在较高的pH和MES浓度条件下，有机酸类物质的产率较高。

实施例2

调节体系初始pH＝6.0，MES浓度为0.1g/L，其他条件见具体操作方法，体系在恒温摇床中进行振荡培养，每隔一定时间取出样品以HPLC法进行发酵液中乙酸、乙醇和丁醇浓度的检测。在发酵6天之后，体系中乙醇浓度为0.11g/L，丁醇0g/L，乙酸1.79g/L，酸醇的比例为16.3：1。

实施例1和2的结果表明，提高体系的初始pH，同时降低MES的用量，可以显著提高发酵产物中有机酸的比例。

实施例3

调节体系初始pH＝5.0，MES浓度为0.1g/L，其他条件见具体操作方法，体系在恒温摇床中进行振荡培养，每隔一定时间取出样品以HPLC法进行发酵液中乙酸、乙醇和丁醇浓度的检测。在发酵6天之后，体系中乙醇浓度为0.51g/L，丁醇0.065g/L，乙酸0.12g/L，酸醇的比例为0.21：1，在稍低pH和低浓度MES体系中，醇类物质的产率较高。

实施例4

调节体系初始pH＝5.0，MES浓度为5g/L，其他条件见具体操作方法，体系在恒温摇床中进行振荡培养，每隔一定时间取出样品以HPLC法进行发酵液中乙酸、乙醇和丁醇浓度的检测。在发酵6天之后，体系中乙醇浓度为0.44g/L，丁醇0.16g/L，乙酸0.59g/L，酸醇类物质的比例为1：1。

实施例3和4的结果表明，降低体系的初始pH，同时降低MES的用量，可以显著提高发酵产物中醇的比例。

本发明方法所使用的培养基包括有2％-4％的矿物元素储液(mineralsolutionstock(V/V))，0.05％的酵母提取物(M/V)，，0.5％的还原剂储液(reducingagentStock(V/V))，0.1％的微量元素储存液(V/V)；

其中Mineralsolutionstock(M/V)的组成为：8％氯化钠，10％氯化铵，1％氯化钾，1％的磷酸二氢钾，2％的硫酸镁和0.4％的氯化钙；ReducingAgentStock(M/V)的组成为0.9％的氢氧化钠，4％的L-半胱氨酸盐酸盐和4％的九水硫化钠。

微量元素液储存液(M/V)的组成为1％的氨三乙酸，0.5％的硫酸镁，0.4％的硫酸亚铁铵，0.1％的氯化钴，0.1％的硫酸锌，0.01％的氯化镍，0.01％的硒酸钠和0.01％的钨酸钠。

上述的培养基是根据Clostridiumcarboxidivorans菌株和菌株Clostridiumautoethanogenum的理化特性配制的，相比于其它含有无机盐的培养基,实施例中使用的培养基能更有效的来生产酸醇。