外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达方法

摘要

外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达方法，它涉及一种外源基因转入白桦苗的方法。本发明提供了一种外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达方法。方法：一、Tween无菌水溶液震荡清洗，然后放入高渗液中浸泡；二、转化培养基中侵染浸泡；三、用甘露醇和二硫苏糖醇的混合液震荡洗涤，然后吸干水分栽种到土壤中。本发明方法为更有效的分析白桦抗逆基因及启动子功能研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种外源基因转入白桦苗的方法。

背景技术

白桦(BetulaplatyphyllaSuks.)是北温带的一个广布种，生长迅速，适应性和抗逆性较强，是研究抗逆机理和进行抗逆基因克隆的理想生物材料。由于白桦的育种周期长，遗传改良进程缓慢，所以采用传统的育种技术已不能满足白桦研究的需要。

瞬时表达(transientexpression)是指导入外源基因后在短时间内就能检测到其表达产物的外源基因表达方式。农杆菌介导的瞬时表达方法已经在很多转基因植物中应用，与传统的转基因过程相比较，具有周期短、安全高效、操作简易、费用相对较低、转化效率高等优点。但目前都仅是利用农杆菌介导从叶、根、茎节间、或是离体培养的愈伤组织上形成的不定芽；再对不定芽进行培养才能获得完整的植株。

发明内容

本发明提供了一种外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达方法，该方法以整株的白桦实生苗为外植体，利用农杆菌介导。

按以下步骤实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达：

一、将白桦苗用浓度为0.5ml/L的Tween无菌水溶液震荡清洗2min，然后放入高渗液中浸泡10min；

二、将经过高渗液浸泡的白桦苗放入转化培养基，在转速为120r/min的条件下侵染浸泡4h；

三、将侵染后的白桦苗用甘露醇和二硫苏糖醇(DTT)的混合液震荡洗涤2次，然后用无菌滤纸吸干水分，再栽种到土壤中，覆膜保湿3天后获得瞬时转化子，即实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达；

其中，步骤一中高渗液为含有250g/L蔗糖的1/4MS培养基；

步骤二中转化培养基为1/2MS+AS100μM+甘露醇100mM+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖50g/L+Tween200.1ml/L+农杆菌，转化培养基OD值为0.6～1.0；；

步骤三甘露醇和二硫苏糖醇混合液中甘露醇的浓度为170mM、二硫苏糖醇的浓度为1mM。

实生苗为由种子繁殖得到的苗株，其有别于无性繁殖得到的扦插苗或嫁接苗；实生苗具有生长旺盛、根系发达、寿命较长等特点。本发明的目的在于提供一种将外源基因转入白桦实生苗中进行瞬时表达的方法，以农杆菌介导，通过构建植物过表达载体，使外源基因在白桦苗中进行表达分析。本发明采用实生苗进行遗传转化，具有遗传转化周期短、效率高的优点，为有效地分析白桦抗逆基因功能、启动子活性分析、亚细胞定位，生产制备目的蛋白奠定基础。

附图说明

图1是实施例1中植物过表达载体pBI121-proBpDREB1B::GUS的构建示意图。

图2是实施例1中proBpDREB1B启动子片段扩增凝胶电泳图。

图3是实施例1中pBI121-proBpDREB1B::GUS大肠杆菌菌液PCR扩增凝胶电泳图。

图4是实施例1中pBI121-proBpDREB1B::GUS质粒HindIII、XbaI双酶切凝胶电泳图。

图5是实施例1中pBI121-proBpDREB1B::GUS农杆菌菌液PCR扩增凝胶电泳图。

图6是实施例1中对照组(用PBI121空载体转化的农杆菌侵染的白桦实生苗)GUS染色后白桦实生土培苗的GUS染色结果图。

图7是实施例1中对照组(用PBI121空载体转化的农杆菌侵染的白桦实生苗)GUS染色后白桦实生土培苗叶片的GUS染色结果图。

图8是实施例1中阴性对照组(用不含PBI121空载体的农杆菌侵染白桦实生苗)GUS染色、脱色后白桦实生土培苗的观察图。

图9是实施例1中瞬时转化白桦实生土培苗(用植物过表达载体pBI121-proBpDREB1B::GUS转化的农杆菌侵染的白桦实生苗)GUS染色、脱色后白桦实生土培苗的观察图。

图10是实施例2中proBpbZIP38启动子片段扩增凝胶电泳图。

图11是实施例2中pBI121-proBpbZIP38::GUS大肠杆菌菌液PCR扩增凝胶电泳图。

图12是实施例2中pBI121-proBpbZIP38::GUS质粒HindIII、XbaI双酶切凝胶电泳图。

图13是实施例2中pBI121-proBpbZIP38::GUS农杆菌菌液PCR扩增凝胶电泳图。

图14是实施例2中瞬时转化白桦实生土培苗(用植物过表达载体pBI121-proBpbZIP38::GUS转化的农杆菌侵染的白桦实生苗)GUS染色后白桦实生土培苗的GUS染色结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式按以下步骤实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达：

一、将白桦苗用浓度为0.5ml/L的Tween无菌水溶液震荡清洗2min，然后放入高渗液中浸泡10min；

二、将经过高渗液浸泡的白桦苗放入转化培养基，在转速为120r/min的条件下侵染浸泡4h；

三、将侵染后的白桦苗用甘露醇和DTT的混合液震荡洗涤2次，然后用无菌滤纸吸干水分，再栽种到土壤中，覆膜保湿3天后获得瞬时转化子，即实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达；

其中，步骤一中高渗液为含有250g/L蔗糖的1/4MS培养基；

步骤二中转化培养基为1/2MS+AS(乙酰丁香酮)100μM+甘露醇100mM+KT(激动素)1.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+蔗糖50g/L+Tween200.1ml/L+农杆菌，转化培养基OD值为0.6～1.0；

步骤三甘露醇和二硫苏糖醇混合液中甘露醇的浓度为170mM、二硫苏糖醇的浓度为1mM。

本实施方式步骤一将白桦苗放入Tween无菌水溶液震荡清洗用以消除外植体(白桦实生苗)的表面张力。

本实施方式通过农杆菌与高渗液的共同作用，实现侵染具有完整表皮的白桦实生苗。

本实施方式步骤三中侵染后的白桦苗用甘露醇和DTT的混合液震荡洗涤，以防止获得的瞬时转化子再次与水接触受到浸泡。

本实施方式转化培养基以1/2MS为基本培养基，附加AS(乙酰丁香酮)100μM、甘露醇100mM、KT(激动素)1.5mg/L、NAA(萘乙酸)0.5mg/L、蔗糖50g/L、Tween200.1ml/L和农杆菌菌液，加入农杆菌菌液至转化培养基OD值为0.6～1.0。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中的白桦苗为4周龄白桦实生土培苗。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤三中每次震荡洗涤时间为3min、转速为120r/min。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点是：步骤二农杆菌菌液中的农杆菌含有带报告基因的质粒。其它步骤及参数与实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：质粒为pBI121质粒。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是：农杆菌的质粒包含BpDREB1B基因启动子或BpbZIP38基因启动子。其它步骤及参数与实施方式一至五之一相同。

实施例1

一、白桦BpDREB1B基因启动子克隆

以白桦DNA为模板，根据BpDREB1B基因启动子基因序列，设计引物(pBI121-BPDREB1B-GUSF：5′-CCCAAGCTTAAAAGGAGTCTCACTAG-3′；pBI121-BPDREB1B-GUSR：5′-GCTCTAGAAGTAAAGGATGCTCTTCT-3′)，克隆获得BpDREB1B基因启动子片段，如SEQIDNO：1所示，长度为814bp。

二、用BpDREB1B基因启动子定向替换载体pBI121质粒的35S启动子，用限制性内切酶HindIII和XbaI对BpDREB1B基因启动子片段及含有GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因的pBI121质粒进行双酶切，然后连接构建植物过表达载体pBI121-proBpDREB1B::GUS(如图1所示)。

用植物过表达载体pBI121-proBpDREB1B::GUS转化大肠杆菌和农杆菌，再经PCR及双酶切验证(双酶切凝胶电泳图如图2～5所示)，证明成功构建含proBpDREB1B::GUS的植物表达载体。

三、培养步骤二中转化成功的农杆菌，然后离心、收集农杆菌。

四、将4周龄白桦实生土培苗用浓度为0.5ml/L的Tween无菌水溶液震荡清洗2min，然后放入高渗液中浸泡10min；

五、将经过高渗液浸泡的白桦苗放入转化培养基，在转速为120r/min的条件下侵染浸泡4h；

六、将侵染后的白桦苗用甘露醇和DTT的混合液震荡洗涤2次，每次震荡洗涤时间为3min、转速为120r/min；然后用无菌滤纸吸干水分，再栽种到土壤中并覆膜保湿3天，即实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达；

其中，步骤四中高渗液为含有250g/L蔗糖的1/4MS培养基；

步骤五中转化培养基为1/2MS+AS(乙酰丁香酮)100μM+甘露醇100mM+KT(激动素)1.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+蔗糖50g/L+Tween200.1ml/L+农杆菌，转化培养基OD值为0.6～1.0；

步骤六甘露醇和二硫苏糖醇混合液中甘露醇的浓度为170mM、二硫苏糖醇的浓度为1mM。

实验

对本实施例获得的瞬时转化苗木进行GUS染色(50ml染色液由20ml浓度为0.1mol/L、pH值为7.0磷酸钠缓冲液，1ml浓度为0.5mol/L的EDTA溶液，0.5ml的TritonX-100，42.5mg的亚铁氰化钾，33mg的铁氰化钾，5mg的氯霉素，50mgX-Gluc用10ml甲醇溶液溶解，以及余量的水配制而成)，37℃温育过夜，然后将植株置于脱色液(无水乙醇：冰乙酸体积比为3:1)中脱色2h～4h，再将脱色后的植株保存于体积浓度为70％的乙醇中，观察染色情况；对照组采用PBI121空载体进行GUS染色；阴性对照组用不含PBI121空载体的农杆菌侵染白桦实生苗；实验结果如图6～9所示。图6和图7中PBI121空载体转化的农杆菌侵染的白桦实生苗和叶片染色后均为蓝色，说明本发明方法农杆菌介导白桦实生苗，质粒已经成功导入白桦实生苗。图8用不含PBI121空载体的农杆菌侵染白桦实生苗，经GUS染色、脱色后白桦实生土培苗为白色；图9中用植物过表达载体pBI121-proBpDREB1B::GUS转化的农杆菌侵染的白桦实生苗，经GUS染色、脱色后在白桦实生土培苗叶片和根的局部呈现蓝色，说明在BpDREB1B基因启动子的驱动下，报告基因GUS在嫩叶及根部中特异表达，外源报告基因成功转入白桦实生苗并实现瞬时表达，实验结果还表明BpDREB1B基因启动子不仅具有表达活性，且具有一定的组织表达特异性。

实施例2

一、白桦BpbZIP38基因启动子克隆

以白桦DNA为模板，根据BpbZIP38基因启动子基因序列，设计引物(pBI121-bZIP38-GUSF：5′-CCCAAGCTTACGGGGTGGATCAAGACCTC-3′；pBI121-bZIP38-GUSR：5′-GCTCTAGAATTTTGAAAACTTGAAGCAGTG-3′)，克隆获得BpbZIP38基因启动子片段，如SEQIDNO：2所示，长度为1862bp。

二、用BpbZIP38基因启动子定向替换载体pBI121质粒的35S启动子，用限制性内切酶HindIII和XbaI对BpbZIP38基因启动子片段及含有GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因的pBI121质粒进行双酶切，然后连接构建植物过表达载体pBI121-proBpbZIP38::GUS(如图1所示)。

用植物过表达载体pBI121-proBpbZIP38::GUS转化大肠杆菌和农杆菌，再经PCR及双酶切验证(双酶切凝胶电泳图如图10～13所示)，证明成功构建含proBpbZIP38::GUS的植物表达载体。

三、培养步骤二中转化成功的农杆菌，然后离心、收集农杆菌。

四、将4周龄白桦实生土培苗用浓度为0.5ml/L的Tween无菌水溶液震荡清洗2min，然后放入高渗液中浸泡10min；

五、将经过高渗液浸泡的白桦苗放入转化培养基，在转速为120r/min的条件下侵染浸泡4h；

六、将侵染后的白桦苗用甘露醇和DTT的混合液震荡洗涤2次，每次震荡洗涤时间为3min、转速为120r/min；然后用无菌滤纸吸干水分，再栽种到土壤中并覆膜保湿3天，即实现外源基因转入白桦实生苗的瞬时表达；

其中，步骤四中高渗液为含有250g/L蔗糖的1/4MS培养基；

步骤五中转化培养基为1/2MS+AS(乙酰丁香酮)100μM+甘露醇100mM+KT(激动素)1.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+蔗糖50g/L+Tween200.1ml/L+农杆菌，转化培养基OD值为0.6～1.0；

步骤六甘露醇和二硫苏糖醇混合液中甘露醇的浓度为170mM、二硫苏糖醇的浓度为1mM。

实验

对本实施例获得的瞬时转化苗木进行GUS染色(50ml染色液由20ml浓度为0.1mol/L、pH值为7.0磷酸钠缓冲液，1ml浓度为0.5mol/L的EDTA溶液，0.5ml的TritonX-100，42.5mg的亚铁氰化钾，33mg的铁氰化钾，5mg的氯霉素，50mgX-Gluc用10ml甲醇溶液溶解，以及余量的水配制而成)，37℃温育过夜，然后将植株置于脱色液(无水乙醇：冰乙酸体积比为3:1)中脱色2h～4h，再将脱色后的植株保存于体积浓度为70％的乙醇中，观察染色情况，结果如图14所示，在BpbZIP38基因启动子的驱动下，报告基因GUS同样可以在嫩叶及根部中特异表达，外源报告基因成功转入白桦实生苗并实现瞬时表达，实验结果也表明BpbZIP38基因启动子具有表达活性，且具有一定的组织表达特异性。