利用红土培养红假单胞菌及其长期保活的方法

摘要

本发明公开了一种利用红土培养红假单胞菌及其长期保活的方法。本发明利用红土易得，成本低，吸附氮化合物等能力强，具有低pH特性和强大缓冲能力的特点，对红土进行改性后用于培养红假单细胞菌，可为菌种生长提供必须的营养盐缓释、pH缓冲，有效缓解决存放期中红假单胞菌死亡的问题。本发明方法获得的红假单细胞菌产品为固体产品，保存时间长，沼泽红假单胞菌活性高；红假单细胞菌产品含沼泽红假单胞菌量为109~1010cfu/g，pH？7.0~8.0，在常温室温、密封真空条件下，储存时间为6~8个月，保留沼泽红假单胞菌活性90~95%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌种的培养及其保活方法，具体是一种利用红土培养红假单胞菌及其长期保活的方法，属于生物技术领域中的菌种培养技术领域。

背景技术

光合细菌红假单胞菌的生产性培养过程中，不断升高的培养液pH是培养物浓度提升的障碍，同时大量代谢废物积累也是一个问题。红假单胞菌产品一般采取液体透明罐装，接受光线照射，在销售及使用中，货架期或存放时间长达3~6个月。红假单胞菌产品长期放置，其中菌的存活是一个问题。由于营养盐消耗，代谢废物增加，大量PSB死亡（死亡量98%~100%），产生沉底、附壁，红颜色淡化，但是此时其pH并没有明显下降，这种光合细菌产品使用于水产中没有预期的效果。

目前，市面上对红假单胞菌产品有一些保存措施，这些措施包括在分离纯化PSB菌种、在无菌化培养操作和流程的基础上利用高pH限制，提供必需的高氮营养盐缓释剂、pH缓冲剂、胶囊包被营养盐，但是，这些措施没有有效解决产品存放期中红假单胞菌死亡的现象。红假单胞菌的在存放过程中的存活仍是一个长期难以解决的问题。

红土普遍存在于我国华南地区，沿海岸线与海岸接壤的主要是红土。红土长期受暴雨等淋溶，富含铝铁，pH偏低，但同时也吸附大量有机物大小分子，使其富有有机质，支持各种农作物的生长。红土具有易得，成本低，吸附氮化合物等能力强，具有低pH特性和强大的缓冲能力的特点。

利用红土的特性，将其适度改性，可很好地用于光合细菌红假单胞菌的培养与保存。现有技术中未见有利用红土来实现红假单胞菌的培养与保存技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用红土培养红假单胞菌的方法，该方法通过将红土改性成培养红土、吸附红土、保持红土，进行红假单胞菌的多次培养与吸附，利用改性后红土强大的吸附性能、pH调节缓冲能力，大幅度地提高培养的红假单胞菌在培养液的浓度；加入红土后的培养方式，解决光合细菌培养过程中pH升高抑制红假单胞菌生长数量增加问题，同时，吸附红土提供了红假单胞菌的吸附基质，解决了红假单胞菌培养中没有吸附基质，最后浓度受限的问题；该方法获得的红假单细胞菌产品为吸附后的固体产品，保存时间长，保留沼泽红假单胞菌活性高。

本发明的技术方案如下：一种利用红土培养红假单胞菌的方法，包括如下步骤：

（1）培养基配制：取NH₄C11.0g，CH₃COONa3.5g，MgC1₂0.1g，CaC1₂0.1g，KH₂PO₄0.6g，K₂HPO₄0.4g，酵母膏0.1g配制红假单胞菌常规培养基成分，再用淡水1000mL将常规培养基成分配制成pH7.4的红假单胞菌液体培养基；

（2）接种培养：以红假单胞菌液体培养基接种沼泽红假单胞菌，以3000~4000LX光照、30~34℃，厌氧培养3~7d，完成菌种的扩大培养；然后以接种量3~5mL/100mL，培养3~7d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成第二级扩大培养；再以接种量30~50mL/100mL，培养2~5d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成生产性培养，得液体红假单胞菌；

（3）培养红土培养：当步骤（2）的培养液经过2~5d生产性培养，液体颜色变深红，pH为8.0~9.0时，向其中加入培养红土50~250g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，继续厌氧培养2~5d，增加红假单胞菌浓度，直到培养物菌量为5~15亿cfu/mL，pH为8.0~9.0；

（4）吸附红土吸附：向经过步骤（3）的培养液投放吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液A和沉淀固体A，完成吸附；

（5）第二次培养和吸附：向步骤（4）的上清液A，加入培养红土50~250g/L，厌氧培养2~5d，直到培养液菌量5~15亿cfu/mL，pH为8.0~9.0，然后投放吸附红土750L~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液B和沉淀固体B，完成吸附；

（6）连续培养：向上清液B中，加入培养红土50~250g/L、步骤（1）的红假单胞菌液体培养基800~1000mL/L，在与步骤（2）相同的培养条件下培养2~5d，得到红假单胞菌的连续培养液；

（7）第三次吸附：向连续培养液中加入吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，去上清液C，得沉淀固体C，完成吸附；

（8）将沉淀固体A、沉淀固体B、沉淀固体C混合，再将得到的混合物与保存红土按照以1:1的质量比混合均匀，真空条件下密封包装，得到红假单胞菌红土；

所述吸附红土的制备方法是：取洁净砖红土，晒干，粉碎，过100~120目筛网，用陈海水与淡水混合得到的且盐度为5‰的水浸泡24小时，去除上层水，日照晒干，得到的红土粉末置放于灭菌锅内，以116℃，30min灭菌；

所述培养红土是由吸附红土1000g与红假单胞菌常规培养基成分60g混合后，再以低浓度盐酸和碱液调整其pH为7.4后得到；

所述保存红土由吸附红土1000g、经过处理的甘蔗渣50~100g、以116℃，30min灭菌的步骤（1）的培养基10~25g、磷酸铵镁3~10g、沸石粉100~150g和白云石粉200~350g，混合均匀得到，其pH为6.8~7.4。

所述陈海水是指：从大海取盐度25~35‰新鲜海水，装满于器皿中，避光黑暗下保存60日~90日，为陈海水。

所述淡水是将可饮用水通过0.45μm膜滤得到。

所述甘蔗渣的处理方法是：取新鲜甘蔗渣，干燥粉碎，过80~100目筛，先以95%酒精浸泡处理24h，去除该酒精液体，再以75%酒精浸泡24h，去除该酒精液体，日光晒干或90℃烘干。

本发明技术方案中，沉淀固体A、沉淀固体B、沉淀固体C为不同阶段获得的已经吸附了红假单胞菌的红土，其中，步骤（4）所述沉淀固体A为已经吸附沼泽红假单胞菌的红土中的沼泽红假单胞菌吸附量已经达到10⁹~10¹⁰cfu/g红土。

本发明技术方案中，步骤（2）所得到的液体红假单胞菌，液体中菌量为1~5亿cfu/mL，pH9~10，色泽深红。

在所述步骤（5）得到的红假单胞菌的连续培养液中，沼泽红假单胞菌浓度大于5亿cfu/mL，pH8.0~9.5。

采用上述的方法制备得到的红假单胞菌红土经过5~10日静置处理，即可获得固体状的红假单胞菌产品，该红假单胞菌产品含沼泽红假单胞菌量为10⁹~10¹⁰cfu/g，pH7.0~8.0，在常温室温、密封真空条件下，储存时间为6~8个月，保留沼泽红假单胞菌活性90~95%。

本发明技术方案所述的菌种为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，来源自广东省微生物菌种保藏中心（GIM编号:GIM1.485）。

本发明利用低盐度海水适度对红土高铁高铝，以及过低的pH值进行改性；改性后的红土具有强大的吸附性能、pH调节缓冲能力，可以较大幅度地提高培养的红假单胞菌在培养液的浓度；加入红土后的培养方式，使红假单胞菌得以迅速地大量生长，从而解决光合细菌培养过程中pH升高抑制红假单胞菌生长数量增加，同时，红土提供了红假单胞菌的吸附基质，解决了红假单胞菌培养中没有吸附基质，最后浓度受限的问题。

本发明利用红土低pH值的特性降低pH，以及保存用的红土制剂中红土、白云石粉的缓冲能力，起到长期稳定pH的作用；同时红土富含有机质，具有高生物富集能力，再利用红土高吸附能力，同蔗渣、沸石粉一起提供光合细菌营养成分的吸附基质，并与难溶解的磷酸铵镁，酒精处理蔗渣构成缓释系统，对维持红假单胞菌的存活，延长储存时间，起到有效作用。

本发明的方法改变了光合细菌液体储存的方式与习惯，采用吸附后固体产品保存，可大幅度延长产品光合细菌的存活；实践证明，在常温室温，密封真空条件下，红假单细胞菌产品可储存6~8月，保留沼泽红假单胞菌活性90~95%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1用于实施例2~4的培养材料的准备和红土的改性：

（1）水的处理：从大海取盐度25~35‰新鲜海水，装满于器皿中，避光黑暗下保存60日~90日，为陈海水，备用；将可饮用水通过0.45μm膜滤得到淡水，备用。

（2）甘蔗渣处理：取新鲜甘蔗渣，干燥粉碎，过80~100目筛，先以95%酒精浸泡处理24h，去除该酒精液体，再以75%酒精浸泡24h，去除该酒精液体，日光晒干或90℃烘干，得处理后的甘蔗渣，备用；

（3）培养基配置：取NH₄C11.0g，CH₃COONa3.5g，MgC1₂0.1g，CaC1₂0.1g，KH₂PO₄0.6g，K₂HPO₄0.4g，酵母膏0.1g配制红假单胞菌常规培养基成分，再用淡水1000mL将常规培养基成分配制成pH7.4的红假单胞菌液体培养基；

（4）吸附红土的制备方法：取洁净砖红土，晒干，粉碎，过100~120目筛网，用陈海水与淡水混合得到的且盐度为5‰的水浸泡24小时，去除上层水，日照晒干，得到的红土粉末置放于灭菌锅内，以116℃，30min灭菌，得吸附红土；

（5）培养红土的制备方法：取吸附红土1000g与红假单胞菌常规培养基成分60g混合，再以低浓度盐酸和碱液调整其pH7.4，得到培养红土；

（6）保存红土的制备方法：取吸附红土1000g、经过处理的甘蔗渣50~100g、以116℃，30min灭菌的培养基10~25g、磷酸铵镁3~10g、沸石粉100~150g和白云石粉200~350g，混合均匀得到，其pH为6.8~7.4。

实施例2利用红土培养红假单胞菌，步骤如下：

（1）接种培养：以红假单胞菌液体培养基接种购自广东省微生物菌种保藏中心（GIM编号:GIM1.485）的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，以3000LX光照、34℃，厌氧培养3d，完成菌种的扩大培养；然后以接种量5mL/100mL，培养3d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成第二级扩大培养；再以接种量40mL/100mL，培养3d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成生产性培养，得液体红假单胞菌；

（2）培养红土培养：当经过2d生产性培养，液体颜色变深红，pH为8.0~9.0时，向其中加入培养红土250g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，继续厌氧培养5d，增加红假单胞菌浓度，直到培养物菌量为15亿cfu/mL，pH为8.0~9.0；

（3）吸附红土吸附：向经过上一步骤的培养液投放吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液A和沉淀固体A，完成吸附；

（4）第二次培养和吸附：向上清液A，加入培养红土250g/L，厌氧培养2~5d，直到培养液菌量5亿cfu/mL，pH为9.0，然后投放吸附红土750L~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液B和沉淀固体B，完成吸附；

（5）连续培养：向上清液B中，加入培养红土250g/L、红假单胞菌液体培养基800mL/L，在与接种培养相同的培养条件下培养3d，得到红假单胞菌的连续培养液；

（6）第三次吸附：向连续培养液中加入吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，去上清液C，得沉淀固体C，完成吸附；

（7）保存红土制备：取吸附红土1000g、经过处理的甘蔗渣80g、以116℃，30min灭菌的培养基10g、磷酸铵镁3g、沸石粉120g和白云石粉200g，混合均匀得到，其pH为6.8；

（8）将沉淀固体A、沉淀固体B、沉淀固体C混合，再将得到的混合物与保存红土按照以1:1的质量比混合均匀，真空条件下密封包装，得到红假单胞菌红产品，其中菌量10⁹cfu/g，pH8.0，在常温室温、密封真空条件下，储存时间为8个月，保留沼泽红假单胞菌活性95%。

实施例3利用红土培养红假单胞菌，步骤如下：

（1）接种培养：以红假单胞菌液体培养基接种购自广东省微生物菌种保藏中心（GIM编号:GIM1.485）的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，以3000LX光照、32℃，厌氧培养7d，完成菌种的扩大培养；然后以接种量3mL/100mL，培养7d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成第二级扩大培养；再以接种量30mL/100mL，培养5d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成生产性培养，得液体红假单胞菌；

（2）培养红土培养：当经过5d生产性培养，液体颜色变深红，pH为8.0~9.0时，向其中加入培养红土50g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，继续厌氧培养4d，增加红假单胞菌浓度，直到培养物菌量为10亿cfu/mL，pH为8.0~9.0；

（3）吸附红土吸附：向经过上一步骤的培养液投放吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液A和沉淀固体A，完成吸附；

（4）第二次培养和吸附：向上清液A，加入培养红土50g/L，厌氧培养5d，直到培养液菌量5亿cfu/mL，pH为8.0，然后投放吸附红土750L~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液B和沉淀固体B，完成吸附；

（5）连续培养：向上清液B中，加入培养红土50g/L、步骤（1）的红假单胞菌液体培养基1000mL/L，在与接种培养相同的培养条件下培养5d，得到红假单胞菌的连续培养液；

（6）第三次吸附：向连续培养液中加入吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，去上清液C，得沉淀固体C，完成吸附；

（7）保存红土制备：取吸附红土1000g、经过处理的甘蔗渣50g、以116℃，30min灭菌的培养基15g、磷酸铵镁10g、沸石粉100g和白云石粉300g，混合均匀得到，其pH为7.4；

（8）将沉淀固体A、沉淀固体B、沉淀固体C混合，再将得到的混合物与保存红土按照以1:1的质量比混合均匀，真空条件下密封包装，得到红假单胞菌红土产品；其中菌量10¹⁰cfu/g，pH7.0，在常温室温、密封真空条件下，储存时间为6个月，保留沼泽红假单胞菌活性90%。

实施例4利用红土培养红假单胞菌，步骤如下：

（1）接种培养：以红假单胞菌液体培养基接种购自广东省微生物菌种保藏中心（GIM编号:GIM1.485）的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，以4000LX光照、30℃，厌氧培养5d，完成菌种的扩大培养；然后以接种量5mL/100mL，培养5d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成第二级扩大培养；再以接种量50mL/100mL，培养5d，同样的光照、温度、厌氧的条件下完成生产性培养，得液体红假单胞菌；

（2）培养红土培养：当培养液经过5d生产性培养，液体颜色变深红，pH为8.0~9.0时，向其中加入培养红土150g/L，直到上层液体pH为7.5，继续厌氧培养2d，增加红假单胞菌浓度，直到培养物菌量为5亿cfu/mL，pH为9.0；

（3）吸附红土吸附：向上一步骤培养液投放吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液A和沉淀固体A，完成吸附；

（4）第二次培养和吸附：向上清液A，加入培养红土250g/L，厌氧培养2d，直到培养液菌量5亿cfu/mL，pH为9.0，然后投放吸附红土750L~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，得上清液B和沉淀固体B，完成吸附；

（5）连续培养：向上清液B中，加入培养红土150g/L、红假单胞菌液体培养基800mL/L，在与接种培养相同的培养条件下培养2d，得到红假单胞菌的连续培养液；

（6）第三次吸附：向连续培养液中加入吸附红土750~1000g/L，直到上层液体pH为7.0~8.0，震荡1小时后，静置分离，去上清液C，得沉淀固体C，完成吸附；

（7）保存红土制备：取吸附红土1000g、经过处理的甘蔗渣100g、以116℃，30min灭菌的培养基25g、磷酸铵镁6g、沸石粉150g和白云石粉350g，混合均匀得到，其pH为7.2；

（8）将沉淀固体A、沉淀固体B、沉淀固体C混合，再将得到的混合物与保存红土按照以1:1的质量比混合均匀，真空条件下密封包装，得到红假单胞菌红土；包装于密封的真空条件下，所含沼泽红假单胞菌菌量为10¹⁰cfu/g，pH7.8，在常温室温、密封真空条件下，可以储存6月，保留沼泽红假单胞菌活性95%。