一种利用心跳作为海湾扇贝亲贝选育指标的方法

摘要

本发明的目的是提供一种利用扇贝心跳作为亲贝选育指标的新方法，本发明对扇贝进行体外、非侵入性无损伤的心跳检测，将获得的扇贝心跳频率和波形作为扇贝亲贝选育的依据。本发明方法结合了红外感应技术、滤波技术、波形放大技术，能够快速灵敏地捕捉和检测扇贝的心跳频率和波形。与传统方法相比，本方法具有非侵入性、无损伤性、可长期跟踪等特点，而且是首次将扇贝心跳作为亲贝选育的指标。采用本种方法能够究为海湾扇贝亲贝选育体系的建立提供研究基础。

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，准确的说是一种利用扇贝心跳作为亲贝选育指标的新方 法。

背景技术

动物的心跳与机体自身的体质、活动、外界的环境变化等因素息息相关，是表征生 物机体状况的重要指标。心率是指动物在静息状态下，每分钟心跳的次数；心跳波形反映 了心脏兴奋的产生、传导和恢复过程，有研究发现，通过心率和心跳波形可以预测动物繁殖 期间机体的健康状况。

双壳类软体动物的循环系统是开管式的，扇贝的循环系统有心脏、动脉、静脉和血窦。 心脏位于消化腺与闭壳肌之间，具有一个心室(A)和两个心耳(V)，均被一个薄而透明的 围心腔包膜所包围。围心腔位于后闭壳肌背部后方，从体外透过半透明的围心腔，可直接观 察到漂浮在无色的围心腔液中的心脏。心室位于两心耳的中间，包围着直肠。每一心耳的前 端有孔与心室相通，心脏的耳室孔边缘，有一列具有瓣膜作用的环形肌纤维，能防止心室的 血液倒流回心耳。心耳另一端(后端)则与出鳃血管相通，心耳的外壁被复有带褐色的腺质 上皮，称围心腔腺。

扇贝是我国重要的海洋经济养殖贝类，其营养丰富，经济价值高，是人们所喜爱的高级 佳肴，是珍贵的海产八珍(鲍鱼、干贝、鱼翅、燕窝、海参、鱼肚、鱼唇、鱼籽)之一深受 国内外消费者的喜爱。我国扇贝养殖历史悠久，养殖成本低，在我国具有开展扇贝养殖的优 越条件，发展扇贝养殖潜力巨大，掀起了海洋水产养殖的第三次浪潮。世界上扇贝的近缘种 近达300种，在我国约有30余种，主要包括栉孔扇贝(Chlamysfarreri)、海湾扇贝(Patinopecten yessoensis)、海湾扇贝(Argopectenirradias)，华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)等。

在我国由于适合扇贝养殖的水域广阔，与对虾、滩涂贝类养殖水面无矛盾，可养种类多， 苗种来源容易，生产性能高，养殖成本低，有群聚习性等，使扇贝养殖有着十分广阔的前途。 但是近年来我国扇贝人工育苗业出现幼虫孵化率低、生长速度慢、幼虫附着率低、变态率低 等问题，导致扇贝苗业受挫，造成巨大的经济损失，严重挫伤了扇贝养殖业的积极性，成为 了制约其发展的主要因素。研究表明，在人工育苗过程中，扇贝亲贝的选择是决定扇贝贝苗 质量的关键因素，机体健康、活性较好的亲贝的后代成活率高、生长速度快、附着率和变态 率高，显现出较好的生长优势。

现阶段的亲贝养殖过程中，一般通过性腺指数的测定作为扇贝性腺成熟的指标。扇贝性 腺指数的测定需要经过测定体尺数据、洗刷、煮沸、解剖、24h烘干、称重等步骤，然后经 公式：性腺指数(GSI)＝性腺重/个体重计算。测定步骤繁琐、周期长、受人为影响程度高， 更多地依靠人工观察、挑选，不仅具有相对的盲目性和单一性，而且速度慢通量低，操作过 程会对亲贝造成一定的损伤。相对标准化的扇贝亲贝选择是扇贝人工良种培育的关键步骤， 但迄今为止扇贝中尚未建立快速、准确、高效的快速选择亲贝的方法。另有研究表明，双壳 贝类的心跳变化与机体活性和健康状况显著相关，是一种合理的、准确的、有巨大发展 潜力的机体健康状态检测指标。因此，利用扇贝心跳频率和波形可以作为相同条件下快 速选择亲贝的指标之一。

发明内容

本发明的目的是建立一种利用扇贝心跳作为亲贝选育指标的新方法，利用扇贝心跳频率 和波形作为活力指标对扇贝进行快速选种，在不伤害育种亲贝机体活性的基础上，实现心跳 活力指标的红外感应无损伤检测，以弥补现有技术的不足。解决现阶段海产经济贝类养殖过 程中缺少快速、准确、高效、活体检测选育亲贝的问题，从而使心跳作为性状/活力指标，就 如同壳高、壳长、壳宽、体重等体尺性状，应用于扇贝的亲贝选育工作中。

本发明通过对扇贝的心跳频率和波形进行检测，同时结合相应扇贝个体温度胁迫下耐受 时间的测定，将获得的扇贝心跳频率和波形作为扇贝亲贝选育的依据，建立一种海产经济养 殖扇贝快速选取亲贝的新方法，为扇贝育种工作提供可靠的技术手段。

本发明提供一种扇贝心跳作为亲贝选育指标的新方法，包括如下的步骤：

1)将待检测的扇贝个体首先培养5-7天使其适应检测环境；

2)将InfraredSensors的红外感端粘附到扇贝壳外靠近心脏的位置；

3)检测之前10分钟，将扇贝放到同样温度的充气的水体环境中，待外套膜触须充分伸 展之后进行检测；

4)实验数据的采集：

A、心率的检测：

截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明区分扇贝两个心耳的波形和一个心 室的波形；信号的强度在1.45-1.95V之间；

B、心跳波形峰高的检测：

计算10分钟检测时间内所有稳定波形的频率，计算10分钟检测时间内所有稳定波形的 平均峰高；

5)数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率a_i(beatsperminute-bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高 h_i(V)，并且将横纵坐标进行标准化；将(a_i，h_i)设定为二维坐标系中的点，所有点标准化 之后，计算(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离Y_i；根据不同个体的Y_i值选择育种个体；

所述的标准化，其公式如下：

Yi的计算公式如下：

其中

a₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的心率；

h₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的峰高；

a_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后的心率；

表示所有检测扇贝个体心率的平均值；

ε_a表示所有检测扇贝个体心率的标准差；

h_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后心跳波形的峰高；

表示所有检测扇贝个体标准化之后心跳波形峰高的平均值；

ε_h表示所有检测扇贝个体心跳波形的标准差；

Y_i表示在所设定的二维坐标系中，每个检测扇贝个体心跳标准化之后的点(a_i标，h_i标) 与同种同龄扇贝最适生长条件下的心率(a₀，h₀)之间的相对距离。

本发明还提供一种基于扇贝心跳指标作为亲贝选育的标准，所述的标准如下：海湾扇 贝(Patinopectenyessoensis)最适生长条件下心率为19.06±1.48bpm，心跳波形峰高为1.56 ±0.26V；

本发明对扇贝进行体外、非侵入性无损伤的心跳检测，将获得的扇贝心跳频率和波形作 为育种过程中亲贝选育的依据。本发明方法结合了红外感应技术、滤波技术、波形放大技术， 能够快速灵敏地捕捉和检测扇贝的心跳频率和波形。与传统方法相比，本方法具有非侵入性、 无损伤性、可长期跟踪等特点，而且是首次将扇贝心跳作为亲贝选育的指标。采用本种方法 能够究为海湾扇贝抗逆品种的选育及抗性指标体系的建立提供研究基础。

附图说明

图1：本发明中涉及的扇贝心脏结构示意图，其中A心耳；Aa前主动脉；Ant前；Ba肺 主动脉；Gpv外套膜大血管；Nrv背腔顶部小静脉；Pa后主动脉；Pc心室壁；Post后；Pvf 连接背部包心膜和心室的纤维；V心室；

图2：本发明中涉及的检测扇贝心跳示意图

图3：本发明中涉及检测到的扇贝心跳波形图

图4：本发明中涉及到检测四种实验扇贝心跳频率随温度的变化图

图5：本发明中涉及到评价海湾扇贝快速选种的二维坐标分析图。

具体实施方式

心率一般是指动物在静息状态下，每分钟心跳的次数；心跳波形反映了心脏兴奋的产生、 传导和恢复过程，申请人在长期的研究中发现扇贝的心跳频率和波形可以作为扇贝亲贝选育 的指标。

1、扇贝心跳检测仪器的连接：

(1)InfraredSensors(CNY-70)的接口端以RJ11连接方式接入Heartbeatmonitor(AMP-03)；

(2)Heartbeatmonitor(AMP-03)和PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机(含 LabChartPro专业版)两端均以BNC连接方式相互连接；

(3)PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机(含LabChartPro专业版)以以USB连接方 式接入电脑(安装LabCharbv7forWindows)。

2、扇贝心跳检测方法的标准化：

(1)将实验扇贝外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下5-7天使其适应实验环境， 稳定心跳；

(2)将InfraredSensors(CNY-70)的红外感端用Blu-Tag型胶(蓝丁胶)粘到扇贝壳外靠 近心脏的位置(背部围心腔中)；

(3)检测之前10分钟，将扇贝放到充气的5L的实验水体环境中，待外套膜触须充分伸 展之后，进行检测，单一实验条件下持续观测观测10分钟。

3、实验数据的采集：

(1)截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明显区分扇贝一个心室的波形 (短而高的波峰)和两个心耳的波形(长而平的波峰)。信号的强度在1.45-1.95V之 间(具有种内和种间差异)。

(2)计算10分钟检测时间内所有稳定波形的频率，将每个个体按上述步骤重复三次或以 上，作为此条件下此扇贝个体的心率，作为亲贝选育指标一；

(3)计算10分钟检测时间内所有稳定波形的平均峰高，将每个个体按上述步骤重复三次 或以上，作为此条件下此扇贝个体的峰高，作为亲贝选育指标二；

(4)将检测个体转移到温度为该物种ABT的水体环境中，测定检测个体在ABT温度下的 耐受时间。

4、依据心跳指标的扇贝亲贝选育指标评价：

(1)比较亲贝选育指标一-心率(a_i)，相同实验条件下，选种指标一越接近同种同龄扇贝 最适生长条件下的心率(a₀)，亲贝选育指标越好；

(2)比较亲贝选育指标二-峰高(h_i)，选种指标二越接近同种同龄扇贝最适生长条件下的 峰高(h₀)，亲贝选育指标越好；

(3)综合亲贝选育指标一(a₀)和亲贝选育指标二(h₀)；

(4)数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率(bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高(V)， 并且将横纵坐标进行标准化；将(a_i,h_i)设定为二维坐标系中的点，所有点标准化之 后，计算的(a_i,h_i)与(a₀,h₀)之间的距离Y_i。Y_i值越小，亲贝选育综合指标越大。

下面以心跳频率和波形为指标评价，对温度影响下的海湾扇贝进行快速选种的方法为 例详细叙述本发明的方法

实施例1

1、扇贝心跳检测仪器的连接：

(1)InfraredSensors(CNY-70)的接口端以RJ11连接方式接入Heartbeatmonitoramplifer (AMP-03)；

(2)Heartbeatmonitoramplifer(AMP-03)和PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机(含 LabChartPro专业版)两端均以BNC接口相互连接；

(3)PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机(含LabChartPro专业版)以以USB连接方 式接入电脑(安装LabCharbv7forWindows)。

2、扇贝心跳检测方法的标准化：

(1)将实验扇贝外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下暂养5-7天，使其适应实验 环境，稳定心跳；

(2)将InfraredSensors(CNY-70)的红外感端用Blu-Tag型胶(蓝丁胶)粘到扇贝壳外靠 近心脏的位置(背部围心腔中)；

(3)实验之前10分钟将扇贝放到充气的、具有升温设备的5L实验水体环境中，待外套 膜触须充分伸展之后，进行检测。

初始水温设置为18℃，升温速度设置为0.2℃/分钟，每升温0.2℃，恒温10分钟检测心 跳，之后继续升温，直到升温至37℃。持续观测各温度下扇贝的心跳频率和波形。每种扇贝 保证不少于6个个体的重复样；

3、实验数据的采集：

(1)截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明显区分扇贝一个心室的波形 (短而高的波峰)和两个心耳的波形(长而平的波峰)；信号的强度在1.45-1.95V之 间(具有种内和种间差异)。

(2)计算每个检测温度点10分钟恒温过程中稳定波形的频率作为此条件下此扇贝个体的 心率和心率的标准差(SD)，作为亲贝选育指标一；

(3)用MicrosoftOffice做出每种扇贝心跳频率随温度变化的曲线图；

(4)计算每个检测温度点10分钟恒温过程中稳定波形的平均峰高作为此条件下此扇贝个 体的波高，作为亲贝选育指标二；

4、依据心跳指标的扇贝亲贝选育指标评价：

实验结果表明：

海湾扇贝为暖温水贝，最佳生长温度范围：18-28℃，最佳生长温度范围内心率为19.06 ±1.48bpm，最佳生长温度范围内心跳波形峰高为1.56±0.26V，ABT(Arrheniusbreak temperatures即阿列纽斯突破温度)为30℃；

(1)比较扇贝亲贝选育指标一-心率：相同实验条件下，扇贝亲贝选育指标一越接近同种 同龄扇贝最佳生长温度范围内的心率，扇贝亲贝选育指标越好；

如，在24℃下检测6只不同遗传背景的海湾扇贝，心跳频率分别为A：18.43±2.02bpm， B：15.32±2.67bpm，C：18.14±1.98bpm，D：21.26±2.41bpm，E：17.67±1.83bpm，F：20.21 ±2.05bpm。仅从心率指标看，海湾扇贝A最接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的心率 (19.06±1.48bpm)，扇贝亲贝选育指标越好；

(2)比较扇贝亲贝选育指标二-峰高，扇贝亲贝选育指标二越接近同种同龄扇贝最佳生长 温度范围内的峰高，扇贝亲贝选育指标越好；

如，在24℃下检测上述6只不同遗传背景的海湾扇贝，心跳波峰分别为A：1.60±0.67V， B：1.52±0.78V，C：1.71±0.88V，D：1.73±0.85V，E：1.68±0.72V，F：1.67±0.35V； 仅从心跳波峰指标看，A最接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的峰高(1.56±0.26V)， 扇贝亲贝选育指标越好；

(3)综合扇贝亲贝选育指标一和扇贝亲贝选育指标二；

数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率(bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高(V)，将(a_i,h_i) 设定为二维坐标系中的点，同时进行标准化；

坐标轴和坐标点标准化之后，计算的(a_i,h_i)与(a₀,h₀)之间的距离Y_i。Y_i值作为 兼具了心率和波形的扇贝快速选种综合指标，Y_i值越小，亲贝选育综合指标越大。

如，在24℃下检测6只不同遗传背景的海湾扇贝，(a_i,h_i)分别为，A：(18.43，1.60)， B：(15.32，1.52)，C：(18.14，1.71)D：(21.26，1.73)E：(17.67，1.68)F：(20.21，1.67)； (a0，h0)为M：(19.06，1.56)。通过公式标准化 之后(a_i标，h_i标)的坐标分别为，A：(-0.0811，-0.4854)，B：(-1.7148，-1.4922)，C：(-0.2334， 0.8989)D：(1.4056，1.1506)E：(-0.4803，0.5214)F：(0.8540，0.3955)；M：(a₀，h₀)为 (0.2499，-0.9888)。(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离通过公式分别为，Y_A＝0.6024，Y_B＝2.0282，Y_C＝1.9486，Y_D＝2.4316，Y_E＝1.6774，Y_F＝1.5104；综合 亲贝选育指标Y_A<Y_F<Y_E<Y_C<Y_B<Y_D，6只海湾扇贝的亲贝选育指标高低为A>F>E>C>B>D。

(4)将检测个体转移到温度为该物种ABT的水体环境中，测定检测个体在ABT温度下 的耐受时间。

将6只不同遗传背景的海湾扇贝放入30℃(海湾扇贝ABT)的温度下检测，观察每只海 湾扇贝心率出现显著性差异(心律不齐或者心跳骤停)的时间T_i。ABT温度下检测到6只不 同遗传背景的海湾扇贝T_i分别为：T_A＝73min02s；T_B＝32min17s；T_C＝39min57s；T_D＝25min38s； T_E＝47min25s；T_F＝58min36s。

ABT温度下检测到6只不同遗传背景的海湾扇贝的耐受时间T_A>T_F>T_E>T_C>T_B>T_D，与此 6只海湾扇贝的快速选种指标的大小关系一致，均为A>F>E>C>B>D。

表1依据心跳指标海湾扇贝不同个体的选种指标Yi和ABT温度下的耐受时间Ti(表 1)

海湾扇贝个体 Y_iT_iA 0.6024 73min02s B 2.0282 32min17s C 1.9486 39min57s D 2.4316 25min38s E 1.6774 47min25s F 1.5104 58min36s

(5)将检测个体在车间加温培育促熟(以亲贝促熟开始时海区自然水温为基数，每天以 升高1.5℃的梯度，逐步将培育水温升至18℃并一直恒温于18℃)积温足够360℃之后，备 24℃恒温海水，阴干催产。检测个体产精产卵，进行海湾扇贝自交系的建立，测定检测个体 产卵量、自交系扇贝幼虫的受精率、孵化率、变态率。统计结果如表所示：

表2依据心跳指标海湾扇贝不同个体的选种指标Yi和产卵量、自交系扇贝幼虫的受精 率、孵化率、变态率、出库稚贝数量统计(表2)

海湾扇贝个体 Y_i产卵量 受精率 孵化率 变态率 出库稚贝 A 0.6024 约82万 88.67±3.52 32.83±6.12 23.67±1.56 5.65万 B 2.0282 约56万 80.67±6.12 23.58±4.50 19.98±2.56 2.13万 C 1.9486 约65万 84.33±5.85 25.33±6.02 18.67±2.45 2.59万

D 2.4316 约48万 80.53±4.53 18.43±5.06 15.23±5.37 1.08万 E 1.6774 约68万 86.02±4.34 26.75±2.84 22.01±3.12 3.44万 F 1.5104 约76万 88.33±5.63 32.91±5.33 22.21±3.05 4.84万

通过心跳指标测定的6只不同遗传背景的海湾扇贝在生产过程中的产卵量，自交系扇贝 幼虫的受精率、孵化率、变态率、出库稚贝数量的统计结果，尤其是具有生产意义的出库稚 贝数量存在有A>F>E>C>B>D，与此6只海湾扇贝的快速选种指标的大小关系一致，均为 A>F>E>C>B>D。显示了心跳指标作为亲贝选育指标的可靠性和准确性。

应用本发明方法，在海湾扇贝亲贝促熟升温到18℃时，检测一龄海湾扇贝个体(n＝360， 2014年11月16日取自青岛市黄岛开发区琅琊镇山东头村海区)的心率，跟踪统计亲贝积温 促熟养殖过程中死亡率，验证本发明方法在海湾扇贝亲贝选育工作中的应用。

心跳检测结果显示，360只一龄海湾扇贝在18℃条件下的心率在10.57bpm-19.38bpm之 间变化，呈现较为规则的正态分布；心跳波幅在1.47bpm-1.79bpm之间变化，亦呈现较为规 则的正态分布。根据心率和波幅，应用上述统计方法，分别选取180只一龄海湾扇贝排名前 30％(组1，n＝108只)和后30％(组2，n＝108只)分别装筐(36只/筐，分为3筐)车间内 相同条件下积温促熟，定期统计各组死亡率(表3)，结果如下：

表3依据心跳指标一龄海湾扇贝排名前30％(组1，n＝108只)和后30％(组2，n＝108只) 的海上笼养死亡率统计

分组 数目 死亡率-4天 死亡率-8天 死亡率-16天 组1 108 2.86±1.42 5.18±2.03 10.46±3.67 组2 108 5.67±1.6785 10.18±4.85 18.96±3.17

以上结果显示，组1和组2各108只一龄海湾扇贝个体在测定心跳，分组放筐后放到车 间18℃恒温积温促熟，4天、8天、16天死亡率的组间比较均具有显著性差异(T检验，P<0.05)， 验证了心跳作为海湾扇贝亲贝选育指标的可靠性。为了更好的验证本发明方法的准确性，2015 年4月在莱州海益苗业有限公司育苗车间内实验。对不同批次，相同养殖方式的海湾扇贝亲 贝进行心跳指标的检测，同时统计生产后的幼苗成活率。结果表明，扇贝心跳频率和波幅接 近同种同龄扇贝最适生长条件下的心率指标，亲贝的后代成活率均具有显著优势。结果表明 本发明的检测标准可以有效的确定扇贝抗性的强弱，从而为扇贝亲贝的的快速选育和科研提 供翔实和有效的实验方法方法，为我国扇贝的高质健康养殖提供技术支撑。