沙地云杉体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明为一种沙地云杉体细胞胚胎发生的方法，属于植物栽培领域种苗技术，具体的讲是利用沙地云杉成熟胚诱导体细胞胚胎发生的方法。本发明采用完全成熟的沙地云杉种子，剥取成熟胚为外植体材料，接种到愈伤诱导培养基上培养，两次继代后产生胚性愈伤，将上述愈伤增殖从而能达到扩繁目的，再由胚性愈伤分化产生体细胞胚，体细胞胚经干化处理后正常萌发：本发明的优点是，采用本发明所述的沙地云杉成熟胚诱导体细胞胚胎发生，获得了大量的沙地云杉体细胞胚，摆脱了以幼胚作为外植体而产生的季节上的瓶颈，实现沙地云杉的快速繁殖。

说明书

技术领域

本发明属于植物栽培领域，具体的讲，涉及沙地云杉成熟胚体细胞胚胎发生的一种方法。

背景技术

沙地云杉（Piceamongolica）是分布在内蒙古境内的白音敖包自然保护区的我国特有新种，属于珍稀植物。沙地云杉作为一个独特的沙地造林树种，为在沙地系统中建立能够维持沙地并向绿洲化方向发展的可持续系统防护林工程提供了一个新的思路。因此，研究沙地云杉快繁具有极大的经济意义和生态意义；由于沙地云杉种子生产易受到大小年、倒春寒及重齿小蠹等虫害影响，有性繁殖受到阻碍，而利用成熟胚进行体细胞胚胎发生具有众多优点，如数量多、繁殖速度快、不受季节影响、植株再生率高等，成为植物无性繁殖的一种主要手段。对沙地云杉种质资源的保存、扩繁及生产实践中的开发利用都具有重要的意义。

发明内容

本发明目的为了解决运用体细胞胚胎发生技术实现沙地云杉快繁问题，以沙地云杉成熟胚为外植体，以LM为基本培养基附加不同浓度的6-BA、2,4-D、KT、ABA、PEG4000来诱导胚性愈伤组织、胚性愈伤组织增殖、胚胎分化、干化处理以及植株再生，并提供一种诱导、继代及成苗时的方法及培养条件，以实现植株再生与快繁。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

本发明包括以下生产步骤：

（1）将成熟的沙地云杉种子用清水浸泡12～15h，将漂浮于液面的种子舍弃，余下的种子用自来水冲洗3～4次。在超净工作台中，将云杉种子先用70～75%酒精浸泡28～32s后用无菌水清洗3～5次,再用2%次氯酸钠溶液消毒12min,然后用无菌水冲洗3～5次；

（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：LM培养基+6-BA（2～5mg/L）+2,4-D（4～8mg/L）+KT（0.5～2.0mg/L）+蔗糖（30g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行诱导培养20～25d生成愈伤组织；

（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：1/2～1/4LM培养基+6-BA（1～4mg/L）+2,4-D（1～5mg/L）+KT（0.1～1.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20～25d使愈伤组织进一步生长；

（4）将步骤（3）所述的愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+6-BA（1.0～1.9mg/L）+2,4-D（1.0～1.9mg/L）+KT（0.1～0.5mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20～25d,得到淡黄色紧密结构的非胚性愈伤组织与白色半透明丝状的胚性愈伤；

（5）将步骤（4）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+6-BA（0.1～1.0mg/L）+2,4-D（1.0～3.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔20～25d以相同配方继代培养进行增殖；

（6）将步骤（5）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+ABA（15～20mg/L）+PEG4000（40～50g/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行分化培养，每隔20d以相同配方进行继代培养；40～60d后即长出云杉体细胞胚；

（7）将步骤（6）所述的体细胞胚接种于1/2～1/4LM培养基+蔗糖（20～40g/L）+结冷胶（3～7g/L）+PEG4000（50～80g/L）培养7d以上，将体胚平铺于两层湿润的滤纸上，放在一个无菌培养皿中干化处理7天，每个培养皿放置约150个体细胞胚，以上过程均在培养温度为22±2℃、光照条件为1200Lx、光照时间为14h/d的条件下进行从而达到干化目的。

（8）将步骤（7）所述的完成干化的体细胞胚接种于1/4～1/2LM培养基+蔗糖（20～30g/L）+琼脂（5～8g/L）,30d后即可萌发并长成带根的键壮云杉幼苗。

本发明的优点是以沙地云杉成熟胚为外植体，以LM为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、2,4-D、KT、ABA、PEG4000来进行胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织增殖、胚胎分化、干化处理以及植株再生，并提供一种诱导、继代及成苗时的方法及培养条件，以实现植株再生与快繁。

具体实施方案：

实施例1

（1）将成熟的沙地云杉种子用清水浸泡12h，将漂浮于液面的种子舍弃，余下的种子用自来水冲洗三遍。在超净工作台中，将云杉种子先用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3次,再用2%次氯酸钠溶液消毒12min,然后用无菌水冲洗5次；

（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：LM培养基+6-BA（3mg/L）+2,4-D（6mg/L）+KT（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.7、温度为22±2℃、暗条件下进行诱导培养20d生成愈伤组织；

（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：1/2LM培养基+6-BA（2mg/L）+2,4-D（3mg/L）+KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.7、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20d使愈伤组织进一步生长；

（4）将步骤（3）所述的愈伤组织接种于下列培养基中：1/2LM培养基+6-BA（1.1mg/L）+2,4-D（1.6mg/L）+KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.7、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20d,得到淡黄色紧密结构的非胚性愈伤组织与白色半透明丝状的胚性愈伤；

（5）将步骤（4）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2LM培养基+6-BA（0.8mg/L）+2,4-D（1.5mg/L）+蔗糖（20g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔20d以相同配方继代培养进行增殖；

（6）将步骤（5）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2LM培养基+ABA（18mg/L）+PEG4000（45g/L）+蔗糖（30g/L）+结冷胶（4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行分化培养，每隔20d以相同配方进行继代培养；50d后即长出云杉体细胞胚；

（7）将步骤（6）所述的体细胞胚接种于1/4LM培养基+蔗糖（20g/L）+结冷胶（5g/L）+PEG4000（70g/L）培养7d后，将体胚平铺于两层湿润的滤纸上，放在一个无菌培养皿中处理7d，每个培养皿放置约150个体细胞胚，以上过程均在培养温度为22±2℃、光照条件为1200Lx、光照时间为14h/d的条件下进行从而达到干化目的。

（8）将步骤（7）所述的完成干化的体细胞胚接种于1/4LM培养基+蔗糖（20g/L）+琼脂（6g/L）,30d后即可长成带根的键壮云杉幼苗。

本发明的优点是以沙地云杉成熟胚为外植体，以LM为基本培养基附加不同浓度的6-BA、2,4-D、KT、ABA、PEG4000来诱导胚性愈伤组织、胚性愈伤组织增殖、胚胎分化、干化处理以及植株再生，并提供一种诱导、继代及成苗时的方法及培养条件，以实现植株再生与快繁。

本发明方法胚性愈伤诱导率为12%，增殖期以4.6倍速率增殖，分化期胚性愈伤平均分化产生体细胞胚297个/g，干化处理后体细胞胚萌发率为76.8%。

虽然以上对本发明目的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。