一种微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的确定方法

摘要

本发明公开了一种微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的确定方法：分别添加两种δ

说明书

技术领域

本发明涉及一种微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的确定方法，属于生态环境治理和海洋生物工程领域。

背景技术

微藻（microalgae）包括所有生活在水中营浮游生活方式的微小植物，通常就指浮游藻类。微藻结构简单，其生理过程也相对简单，有些种类是科学研究的模式植物，如：莱茵衣藻、小球藻，很多种类还可以人工培养，这为我们的研究提供了便利。微藻对水体无机碳的利用有两种方式，（1）利用大气中的二氧化碳。CO₂作为线性非极性分子，呈电中性，它可以自由扩散进入细胞双层脂膜，进入细胞中的CO₂为微藻细胞的光合作用所利用；（2）利用溶液中碳酸氢根离子。碳酸氢根离子既可以直接转运也可间接转运到细胞中为微藻细胞所利用。碳酸氢根离子的直接转运指的是经过细胞质膜表面载体蛋白或阴离子交换蛋白，直接把碳酸氢根离子转运到细胞内，在胞内经碳酸酐酶转化为CO₂或直接以碳酸氢根离子的形式由叶绿体膜蛋白主动运输到叶绿体内，经碳酸酐酶转化成CO₂供核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）固定；碳酸氢根离子的间接转运是指依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运。碳酸酐酶（EC4.2.1.1）是一种含锌的金属酶，催化CO₂与HCO₃^-的可逆转化：CO₂+H₂O?H⁺+HCO₃^-。碳酸酐酶分为质膜内和质膜外两种。质膜外碳酸酐酶（又称胞外碳酸酐酶）通过金属离子与细胞壁内表面相连接，催化细胞扩散层中碳酸氢根离子迅速水解成游离CO₂,从而保证了细胞的CO₂快速供应。

有些藻类只利用CO₂；有些藻类不仅能利用CO₂，还能或直接利用碳酸氢根离子，或通过胞外碳酸酐酶间接利用碳酸氢根离子，或者两者兼而有之。微藻在二氧化碳同化成藻体时碳会发生分馏，不同藻体因为大小结构的差异,其稳定碳同位素分馏值也明显不同。了解不同微藻在二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值，不仅对分析水体微藻的种群结构，定量微藻不同类型的碳汇，具有重要的意义。同时，也为海洋科学、湖泊科学以及水生生物学提供了便利工具，为水华赤潮的治理提供科学依据。可是，目前还没有一个获取微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的在体（invivo）方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的确定方法，以克服现有技术通过设计多步体外反应过程和步骤分析而无法在体确定稳定碳同位素分馏值的不足。

本发明采取以下技术方案：它包括以下步骤：第一，选择两种δ¹³C值差值大于10‰的碳酸氢钠作为同位素标记1和同位素标记2分别添加到检测培养液中同时在同样的培养条件下培养起始生物量相同的待测微藻；检测培养液为添加碳酸氢钠的浓度为16mM及以上、同时附加10mM乙酰唑胺也即AZ的藻类培养液。测定待测微藻的起始生物量M_O和微藻的起始稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_O。同位素标记1的碳酸氢钠的δ¹³C值为δ_C1，同位素标记2的碳酸氢钠的δ¹³C值为δ_C2；第二，将待测微藻在添加同位素标记的检测培养液中培养4天后，测定待测微藻的最终生物量M_N和在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_S1和δ_S2；第三，利用双向标记培养植物测定大气二氧化碳稳定碳同位素组成的方法，测定在培养期间每天培养环境中大气二氧化碳的日平均稳定碳同位素组成，由此计算出在培养期间，培养环境中大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_air；第四，待测微藻增值倍数P=M_N/M_O；第五，将微藻的起始稳定碳同位素组成δ_O、待测微藻增值倍数P以及在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的稳定碳同位素组成δ_S1或δ_S2代入方程：和，计算出在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的新生藻体稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_T1和δ_T2；第六，将δ_T1、δ_T2、δ_C1和δ_C2代入到方程：，计算出待测微藻利用添加的无机碳源的份额f_B；第七，将f_B、δ_air以及δ_T1和δ_C1或δ_T2、δ_C2代入到方程：=δ_air+f_Bδ_C1-δ_T1-f_Bδ_air或=δ_air+f_Bδ_C2-δ_T2-f_Bδ_air，计算出待测微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值。

本发明的优点如下：

1）本发明不仅能测得单个微藻种二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值，而且也能测定混合藻体微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值，有利于分析水体微藻的种群结构，定量微藻不同类型的碳汇，这是目前现有方法无法做到的；

2）依据本发明测得的微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值，可以直接应用到自然水体量化自然水体微藻无机碳利用途径；

3）本方法在完全相同的实验条件下同时开展两个培养实验，因此，获取微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的数据更为可靠；

4）本方法排除了老“碳”对测定结果的影响，因此，测定的结果精确度高；

5）利用本方法测得的微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值，可以反过来测得不同环境的大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_air。这为生态学研究以及碳汇研究带来了便利。

发明原理

自然界中碳元素有两种稳定同位素：¹²C和¹³C，它们的天然平均丰度分别为98.89%和1.11%。稳定碳同位素组成通常用δ¹³C（‰）表示，自然界中δ¹³C的变化为-90‰~+20‰。质量平衡原理以及同位素混合模型和化学计量学方法，是定量微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的基础。

微藻两种无机碳利用途径造成的同位素分馏差异有明显不同。利用大气中的二氧化碳途径可造成最大的同位素分馏（）。碳酸氢根离子的直接转运和依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径造成的同位素分馏比利用大气中的二氧化碳途径造成同位素分馏小9‰（PDB）。

乙酰唑胺(acetazolamide，AZ)是含1,3,4-噻二唑环的杂环磺酰胺类碳酸酐酶胞外酶抑制剂。利用碳酸酐酶胞外酶抑制剂能够专一地抑制碳酸酐酶胞外酶的特点，研究碳酸酐酶胞外酶活性被抑制下的微藻同位素变化，可以反向识别依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径对无机碳利用的贡献和份额。在依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子间接转运途径被抑制同时，碳酸氢根离子的直接转运途径也同时被抑制。高浓度碳酸氢钠也对碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高浓度碳酸氢钠和10mMAZ的作用下，依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径和碳酸氢根离子的直接转运途径将同时被完全抑制。

对于微藻来说，它们都可以利用大气的无机碳源和添加的无机碳源，且对于每一种来源的无机碳的利用，都存在CO₂和HCO₃^-两种无机碳利用途径，为此，我们可以建立如下两端元的同位素混合模型：

δ_Ti=(1-f_Bi)δ_TA+f_Biδ_TB

=(1-f_Bi)[(1-f_bi)(δ_air-)+f_bi(δ_air-+9‰)]+f_Bi[(1-f_bi)(δ_Ci-)+f_bi(δ_Ci-+9‰)](i=1,2)（1）

δ_TA是指微藻利用大气来源的无机碳，包括：CO₂和HCO₃^?这两种利用途径；δ_TB是指微藻利用添加的碳酸氢钠来源的无机碳，同样包括：CO₂和HCO₃^?这两种利用途径。δ_Ti为添加已知δ¹³C的某一碳酸氢钠培养的微藻藻体的δ¹³C值，f_Bi为微藻利用添加的无机碳占总碳源的份额，(1-f_Bi)为微藻利用大气二氧化碳占总碳源的份额。f_bi为微藻利用碳酸氢根离子途径，(1-f_bi)为微藻二氧化碳利用途径份额。δ_air、以及δ_Ci分别为环境中大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值、二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值以及同位素标记的碳酸氢钠的δ¹³C值。

在同一条件下培养的同一种微藻，对于添加的两种标记的重碳酸盐来说，方程（1）可以分别表示如下：

δ_T1=(1-f_B1)[(1-f_b1)(δ_air-)+f_b1(δ_air-+9‰)]+f_B1[(1-f_b1)(δ_C1-)+f_b1(δ_C1-+9‰)](2)

δ_T2=(1-f_B2)[(1-f_b2)(δ_air-)+f_b2(δ_air-+9‰)]+f_B2[(1-f_b2)(δ_C2-)+f_b2(δ_C2-+9‰)](3)

在方程（2）和（3）中，δ_T1为添加第一种已知δ¹³C的碳酸氢钠培养的微藻藻体的δ¹³C值；δ_T2为添加第二种已知δ¹³C的碳酸氢钠培养的微藻藻体的δ¹³C值；f_B1为微藻利用添加的第一种碳酸氢钠占总碳源的份额；f_B2为微藻利用添加的第二种碳酸氢钠占总碳源的份额；f_b1为培养在添加第一种已知δ¹³C的碳酸氢钠的培养液中的微藻利用碳酸氢根离子途径所占的份额；f_b2为培养在添加第二种已知δ¹³C的碳酸氢钠的培养液中的微藻利用碳酸氢根离子途径所占的份额。δ_C1为同位素标记1的碳酸氢钠的δ¹³C值，δ_C2为同位素标记2的碳酸氢钠的δ¹³C值。

基于以下两点认识：1、不论添加哪种标记的碳酸氢钠，只要在同一培养条件下，同一种微藻利用添加的重碳酸盐所占总碳源的份额是相同的，由此可以得到：f_B1=f_B2=f_B。2、不论添加哪种标记的碳酸氢钠，只要在同一培养条件下，同一种微藻利用碳酸氢根离子途径所占的份额是相同的，由此可以得到：f_b1=f_b2=f_b。在此基础上，由方程（2）与方程（3）做差、化简可得：

（4）

由于在高浓度碳酸氢钠和10mMAZ的作用下，依赖于胞外碳酸酐酶的碳酸氢根离子的间接转运途径和碳酸氢根离子的直接转运途径将同时被完全抑制，所以。

f_b1=f_b2=f_b=0（5）

这样，此时的（2）和（3）式可分别简化成：

=δ_air+f_Bδ_C1-δ_T1-f_Bδ_air（6）

=δ_air+f_Bδ_C2-δ_T2-f_Bδ_air（7）

δ_T1为添加第一种已知δ¹³C的碳酸氢钠培养的微藻藻体的δ¹³C值；δ_T2为添加第二种已知δ¹³C的碳酸氢钠培养的微藻藻体的δ¹³C值；培养4天后的微藻藻体的δ¹³C值，并不完全是新生成的藻体的δ¹³C，而是含有培养时的原始藻体加新生成的藻体的综合δ¹³C值，因此，为了获取新生成的藻体的δ¹³C值δ_T1或δ_T2；我们建立了如下方程：

δ_O+(P-1)×δ_Ti=P×δ_Si（8）

P为微藻增值倍数。P=实验处理后的微藻生物量（M_N）/初始接种时的微藻生物量（M_O）；

δ_O为初始接种的微藻藻体碳同位素组成（δ¹³C）；

δ_Si为实验处理后的微藻藻体碳同位素组成（δ¹³C）（i=1，2）；

δ_Ti为实验处理新生成的藻体碳同位素组成（δ¹³C）（i=1，2）。

（8）式变形后为：

（i=1，2）（9）

知道了δ_Ti、δ_Ci以及培养期间培养环境中大气二氧化碳平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_air，由（6）和（7）式计算微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值。而培养环境中大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_air可利用双向标记培养植物测定大气二氧化碳稳定碳同位素组成的方法。

具体实施方式

实施例1：第一步骤，选择两种δ¹³C值差值大于10‰的碳酸氢钠作为同位素标记1和同位素标记2分别添加到检测培养液中同时在同样的培养条件下培养起始生物量相同的待测微藻；检测培养液为添加碳酸氢钠的浓度为16mM、同时附加10mM乙酰唑胺也即AZ的藻类培养液；测定待测微藻的起始生物量M_O和微藻的起始稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_O。同位素标记1的碳酸氢钠的δ¹³C值为δ_C1，同位素标记2的碳酸氢钠的δ¹³C值为δ_C2；

第二步骤，将待测微藻在添加同位素标记的检测培养液中培养4天后，测定待测微藻的最终生物量M_N和在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_S1和δ_S2；

第三步骤，利用双向标记培养植物测定大气二氧化碳稳定碳同位素组成的方法，测定在培养期间每天培养环境中大气二氧化碳的日平均稳定碳同位素组成，由此计算出在培养期间，培养环境中大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_air；

第四步骤，待测微藻增值倍数P=M_N/M_O；

第五步骤，将微藻的起始稳定碳同位素组成δ_O、待测微藻增值倍数P以及在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的稳定碳同位素组成δ_S1或δ_S2代入方程：和计算出在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的新生藻体稳定碳同位素组成δ¹³C的值δ_T1和δ_T2；

第六步骤，将δ_T1、δ_T2、δ_C1和δ_C2代入到方程：，计算出待测微藻利用添加的无机碳源的份额f_B；

第七步骤，将f_B、δ_air以及δ_T1和δ_C1或δ_T2、δ_C2代入到方程：=δ_air+f_Bδ_C1-δ_T1-f_Bδ_air或=δ_air+f_Bδ_C2-δ_T2-f_Bδ_air，计算出待测微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值。

实施例1的实施效果如下：

培养材料为：莱茵衣藻和蛋白核小球藻。培养基为在基本培养液（SE培养基）添加16mM碳酸氢钠和10mMAZ，基本培养条件为：光周期L/D：12h/12h；温度25℃；光照强度为100μmolm^-2s^-1，pH值8.2；添加的碳酸氢钠的δ¹³C分别为-17.4‰(PDB)（δ_C1）和-28.4‰(PDB)（δ_C2），表1表示莱茵衣藻和蛋白核小球藻有关实验数据。

表1莱茵衣藻和蛋白核小球藻新生藻体稳定碳同位素组成δ¹³C的值

依据表1可以获得莱茵衣藻和蛋白核小球藻的二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值如表2。

表2莱茵衣藻和蛋白核小球藻的二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值

从表2中可以看出，莱茵衣藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值比蛋白核小球藻大，这与莱茵衣藻细胞体积比蛋白核小球藻大有关，与实际相符；上述测得的模式藻类的二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值一方面还可以用于不同环境的大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成δ¹³C的值的测定，另一方面还可以用于不同培养环境下无机碳利用途径的份额的确定。

实施例2：检测培养液为添加碳酸氢钠的浓度为20mM、同时附加10mM乙酰唑胺也即AZ的藻类培养液，其它与实施例1相同。

培养材料为：红枫湖中提取的混合微藻；培养基为在基本培养液（SE培养基）添加20mM碳酸氢钠和10mMAZ，基本培养条件为：光周期L/D：12h/12h；温度25℃；光照强度为100μmolm^-2s^-1，pH值8.2；添加的碳酸氢钠的δ¹³C分别为-17.4‰(PDB)（δ_C1）和-28.4‰(PDB)（δ_C2），表3表示红枫湖中混合微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值。

表3红枫湖中混合微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值

从表3中可以看出，红枫湖中混合微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值比莱茵衣藻和蛋白核小球藻更大，这与混合微藻有各种藻类，其中一些硅藻等在二氧化碳同化过程中具有较大的稳定碳同位素的分馏有关，造成了混合微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值更大，这也与实际相符；对自然界混合微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的测定分析，可有助于该水体群落结构和时空间结构的分析。