一种测定单糖对映体过量值的方法

摘要

本发明提供一种测定单糖对映体过量值的方法：1)利用静电吸附的方法将二肽聚乙烯亚胺聚合物接枝到石英微晶体天平芯片表面，形成聚合物薄膜；2)分别利用不同的已知对映体过量值的单糖溶液浸泡步骤1)得到的石英微晶体天平芯片；3)利用原子力显微镜的力学模式分别测定上述不同的已知对映体过量值的单糖溶液浸泡后的聚合物薄膜的杨氏模量大小，得到聚合物薄膜杨氏模量相对于对映体过量值的线性关系曲线；4)提供未知对映体过量值的单糖溶液，重复步骤2)和3)得到杨氏模量值，该杨氏模量值对应的线性关系曲线上的对映体过量值即为测试结果。该方法测量准确、操作简单、可重复好，有望在糖类物质的对映体含量检测领域获得广泛的应用。

说明书

技术领域

本发明属于材料化学和有机化学领域，具体涉及一种测定单糖对映体过量值的方法。

背景技术

对于不对称合成而言，其目标是通过手性催化剂来得到一种纯度高的对映异构体。这种方法能够避免耗时的手性分离，节约生产成本。而对于不对称合成的评估而言，对映体过量值(常用名：ee值)的测定至关重要。随着市场上手性药物的不断增加，需要研制和开发新的、高效的对映体过量值的测定方法。

目前，对映体过量的测定主要是利用液相和气相色谱进行，通过设计和制备不同的手性色谱柱填料，依据待测定的手性物种在色谱柱上保留时间的差异，通过比较L-，D-型物种的色谱峰面积，来测定手性物质的对映体过量值。然而，这些方法都存在着耗费时间长和花费大等缺点，特别是手性色谱柱价格非常昂贵，动辄2万元每根分析柱；而且色谱填料十分娇贵，无法承受一些苛刻的分离条件(如要尽量避免在溶剂中引入二甲基亚砜、N，N’-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃、二氧六环等常见的有机溶剂，以免造成色谱填料不可逆的损伤)。对于手性色谱法而言，其无法实现对某些手性物质(如手性单糖)对映异构体过量的测定。

单糖和低聚糖被广泛应用于手性药物的合成中，充当起始的光学纯原料、或者反应的中间体。天然存在的单糖大多数都是D-型糖，只有阿拉伯糖和岩藻糖以L-型糖的形式存在。D-型糖的生物学功能已经被充分地揭示，并开展了深入的研究探索；然而L-型糖的生理功能却很少被发现，例如L-阿拉伯糖具有和D-型阿拉伯糖一样的甜味，但是却不能为人体所代谢，因此被作为一种减肥食品(“左旋阿拉伯糖”)被广泛使用。D-型脱氧核糖是DNA的核心构筑单元，而L-型脱氧核糖被用来合成一种抗艾滋病药物。因此研究非天然的手性单糖具有显著的科学意义和潜在的经济价值。然而L-型单糖很难从自然界生物中提取得到，一般需要进行多步的不对称催化反应，得到的产物往往是以外消旋体的形式存在，因此有必要对单糖的对映体纯度进行精确的测定，作为后续开发的基础。

目前，手性色谱柱无法实现对单糖的对映异构体区分，因此无法进行对映体过量值的测定；旋光法和圆二色谱法，由于精度不高，批次重现性差，也无法进行定量测定。因此，有必要开发一种能准确测定单糖对映体过量的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确性高、操作简便的单糖对映体过量值的测定方法。

本发明为解决上述技术问题所采用的方案为：

一种测定单糖对映体过量的方法，其包括如下步骤：

1)利用静电吸附的方法将二肽聚乙烯亚胺聚合物接枝到石英微晶体天平芯片表面，形成聚合物薄膜；

所述二肽聚乙烯亚胺聚合物为其中，n为聚合度，其范围为5至200000；

2)分别利用不同的已知对映体过量值的单糖溶液浸泡步骤1)得到的石英微晶体天平芯片；

3)利用原子力显微镜的力学模式分别测定上述不同的已知对映体过量值的单糖溶液浸泡后的聚合物薄膜的杨氏模量大小，得到聚合物薄膜杨氏模量相对于对映体过量值的线性关系曲线；

4)提供未知对映体过量值的单糖溶液，重复步骤2)和3)得到杨氏模量值，该杨氏模量值对应的线性关系曲线上的对映体过量值即为测试结果。

上述方案中，所述步骤2)中的单糖溶液为核糖、脱氧核糖、葡萄糖、木糖、来苏糖、阿拉伯糖或甘露糖。

上述方案中，所述二肽聚乙烯亚胺聚合物是通过取代反应，将氯乙酰氯化的二肽接枝到聚合度为5至200000的聚乙烯亚胺的侧链上，获得所述二肽聚乙烯亚胺聚合物，其中，所述二肽为所述氯乙酰化的二肽为

上述方案中，所述的二肽聚乙烯亚胺聚合物的制备方法包括如下步骤：

1)将所述二肽和三乙胺溶解在无水氯仿溶液之中，搅拌条件下，将氯乙酰氯逐滴滴加到上述溶液中，滴加结束后，室温下反应10-14小时，得到氯乙酰化的二肽1；

2)室温条件下，将聚乙烯亚胺，碘化钠和碳酸钾溶解到无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌条件下，将溶有1的N,N-二甲基甲酰胺溶液滴加逐滴滴加到上述溶液之中，避光氮气保护条件下反应22-26小时，经过提纯即可得到二肽聚乙烯亚胺聚合物PEI-g-D-DF；

本发明的有益效果为：

1.本发明开发了一种全新的，利用检测聚合物杨氏模量的变化来测定单糖对映体过量的新方法。在前期的研究中，发明人发现二肽(例如：D-Asp-D-Phe，缩写D-DF)对于不同的单糖对映异构体，具有很好的立体选择性。在此基础上，发明人通过化学接枝的方法将二肽单元接枝到一种柔性的聚电解质(例如：聚乙烯亚胺，英文缩写：PEI)链段上，即得到了一种对单糖对映异构体具有手性选择性相互作用的聚合物材料(PEI-g-D-DF)。通过QCM-D的研究表明，这种手性聚合物对不同种类单糖(例如：核糖、脱氧核糖、葡萄糖、木糖、来苏糖、阿拉伯糖、甘露糖)展现出良好的手性选择性和化学选择性吸附，其中L/D-核糖和L/D-脱氧核糖表现出最大的手性差异性。于此同时，在吸附单糖后，聚合物薄膜的两种宏观性质，即硬度和粘弹性发生明显的变化，同时变化的程度与溶液中单糖的对映体含量比例呈良好的线性关系。基于此，可以利用对此聚合物机械性能上的变化，来测定单糖的对映体过量值；

2.本发明制备的聚合物为聚电解质，既可以通过静电吸附的方式键合到各种不同的金属基底表面，构建出具有糖响应的功能界面材料；又可以通过取代反应将聚合物接枝修饰到硅胶表面，开发为糖分离色谱填料；

3.本发明通过测定聚合物薄膜吸附单糖前后杨氏模量的变化，即可获取单糖的对映异构体过量值，解决了常规的手性色谱方法无法解决的难题。同时该方法具有测量精度高、耗时短、成本低、易推广等优点，提供了一种全新的手性物种对映体含量测定的方法。

附图说明

图1为二肽修饰的聚乙烯亚胺功能聚合物的制备路线。

图2为化合物1，PEI和聚合物材料PEI-g-D-DF的核磁氢谱。

图3为化合物1，PEI和PEI-g-D-DF的紫外光谱。

图4为化合物1，PEI和PEI-g-D-DF的红外光谱。

图5为化合物1，PEI和PEI-g-D-DF的园二色谱光谱。

图6为裸芯片和PEI-g-D-DF修饰后的芯片聚合物膜厚测试。

图7为PEI-g-D-DF修饰的芯片XPS元素分析，碳元素组成。

图8为PEI-g-D-DF修饰的芯片XPS元素分析，氧元素组成。

图9为PEI-g-D-DF修饰的芯片XPS元素分析，氮元素组成。

图10为七组单糖对映异构体吸附后引起PEI-g-D-DF聚合物芯片频率的变化。

图11为核糖对映异构体在PEI-g-D-DF聚合物芯片表面吸附时产生的频率变化。

图12为原始的聚合物表面硬度分布(A)，以及经过L-型(B)或D-型(C)核糖处理后的表面硬度分布。

图13为L/D-核糖混合物对映体过量值与聚合物杨氏模量线性关系图。

图14为L/D-脱氧核糖混合物对映体过量值与聚合物杨氏模量线性关系图。

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例中所用原料及设备:

聚乙烯亚胺(分子量10000，100000，500000)由上海阿拉丁生化科技股份有限公司购得，D-Asp-D-Phe由上海希施生物科技有限公司购得。氯乙酰氯，三乙胺和色谱纯DMF由TCI公司购得。其他试剂均使用市售分析纯。¹H和¹³CNMR图谱在BrukerARX300spectrometer检测获得。

实施例1

PEI-g-D-DF的制备

详细的制备路线见图1所示。冰浴条件下，将0.62g(2mmol)的D-Asp-D-Phe和0.24g(2mmol)的三乙胺溶解在30mL无水氯仿溶液之中，搅拌条件下，将0.27g(2.4mmol)的氯乙酰氯逐滴滴加到上述溶液中，滴加结束后，室温下反应12个小时。反应结束后30mL盐水洗4次，取有机相溶液，旋转蒸发掉有机溶剂后过硅胶柱即可得到反应物1(0.51g，产率65％)。

室温条件下，将1.5g聚乙烯亚胺(分子量为10000)，0.04g碘化钠(0.26mmol)和0.36g的碳酸钾(2.6mmol)溶解到50mL的无水DFM溶液中，搅拌条件下，将10mL溶有0.5g化合物1的DMF溶液滴加逐滴滴加到上述溶液之中，避光氮气保护条件下反应24小时。然后将上述溶液转移到透析袋(截留分子量：3000)中，在甲醇和超纯水条件下透析5天。之后减压条件下除去溶剂，即可得到PEI-g-D-DF。两物质的表征数据如下所示。

化合物1的表征数据：

核磁氢谱(300MHz,氘代氯仿):化学位移(ppm):2.65(d,d,J₁＝J₂＝4.2Hz,1H,C-CH₂),2.97(d,d,J₁＝J₂＝2.4Hz,1H,C-CH₂),3.06(d,d,J₁＝J₂＝3.9Hz,1H,C-CH₂),3.16(d,d,J₁＝J₂＝4.2Hz,1H,C-CH₂),3.71(s,3H,OCH₃),3.73(s,3H,OCH₃),3.92-4.02(d,d,J₁＝J₂＝9.0Hz,2H,C-CH₂Cl),4.78-4.82(m,2H,C*H),6.97(d,J＝7.5Hz,1H,CONH),7.12-7.32(m,5H,Ph-H),7.86(d,J＝4.8Hz,1H,CONH).核磁碳谱(600MHz,氘代氯仿):化学位移(ppm):35.1,37.5,42.3,49.3,52.3,52.4,53.4,127.2,128.4,128.6,129.0,129.2,135.6,166.3,169.4,171.4,172.3；红外(波数):3290,2956,1755,1732,1668,1646,1530,1436,1413,1367,1311,1292,1207,1173,1068,1031,989,952,930,900。元素分析,C₁₇H₂₁N₂O₆Cl预测值(％):C,53.06；H,5.50；N,7.28；实际测量值C,53.00；H,5.58,N,7.36；高分辨质谱:荷质比C₁₇H₂₁N₂O₆Cl计算值：384.1；实测值:385.0[M+H]+。

PEI-g-D-DF的表征数据见图2至图5所示。

实施例2

采用实施例1中所述的方法，将氯乙酰化的二肽接枝到不同聚合度的聚乙烯基亚胺上，聚合度的范围是5至200000。

实施例3

PEI-g-D-DF功能聚合物在金表面上的自组装方法：

将清洗干净的QCM-D芯片(芯片表面蒸镀了一层30－40nm厚的金作为金属传感器)浸泡在20mg/mL的PEI-g-D-DF水溶液中，半小时后取出，用超纯水冲洗芯片，之后用氮气吹干芯片即可得到接枝有PEI-g-D-DF的芯片。聚合物修饰后的芯片表征如图6至图9所示。

图6为裸芯片(左图)和PEI-g-D-DF修饰后的芯片(右图)聚合物膜厚测试，由图可知聚合物厚度为7-8nm。

实施例4

QCM-D吸附实验

发明人通过QCM-D，测定PEI-g-D-DF对六组单糖对映异构体的动态吸附行为，根据芯片频率和耗散数据得知PEI-g-D-DF对六组有着手性差异性吸附行为(如图10所示)，同时聚合物的粘弹性发生差异性的改变。以核糖为例，如图11所示。吸附实验是后期表面杨氏模量测量的基础，只有吸附实验证实在聚合物表面产生了吸附差异的手性物种对，才有可能通过杨氏模量测量获得对映体过量值。

实施例5

对映异构体过量的测定

通过实施例4中的吸附频率测量，可以快速评估聚合物表面能否区分待测的手性物种对。手性单糖的吸附引起了聚合物表面硬度(采用杨氏模量进行定量分析)的显著变化，同时L-型和D-型单糖所引起的硬度变化截然不同。以核糖为例，L-型核糖的吸附导致聚合物表面硬度显著降低，而D-型核糖的吸附使得材料表面的硬度显著增加，如图12所示。图12为原始的聚合物表面硬度分布(A)，以及经过L-型(B)或D-型(C)核糖处理后的表面硬度分布。

在此基础上，建立聚合物表面杨氏模量与手性物种对对映体过量值之间的线性关系，其中表面杨氏模量由AFM软件统计自动给出。以核糖为例，利用不同对映体过量(-100％，-50，0，50，100)的核糖溶液浸泡PEI-g-D-DF修饰的QCM芯片，然后通过利用原子力显微镜的力学模式测定了聚合物膜的杨氏模量。通过数据分析可知，核糖的对映体过量值与对应的聚合物膜杨氏模量之间存在着线性关系(如图13所示)。因此，在建立了聚合物杨氏模量和相应单糖对映异构体过量值线性关系后，只需测定未知聚合物膜的杨氏模量即可得知其核糖的对映体过量值。

由图13可知，经过五组不同的已知核糖对映异构体混合物(对映体过量值为：-100％，-50％，0，50％，100％)处理后的PEI-g-D-DF杨氏模量，建立出的对映体过量值与聚合物杨氏模量线性关系图。在此基础上，我们测定了三组“未知”核糖样品，得到的结果能很好的吻合之前得到的线性拟合线，说明该对映体过量测定方法十分准确。

实施例6

采用实施例5中类似的方法，通过聚合物材料表面杨氏模量的测量，获得了杨氏模量与脱氧核糖对映体过量值之间的线性关系。同样采用三组未知的脱氧核糖混合物样品，检验了方法的准确性。如图14所示。

图14中，通过测定，经过五组不同的脱氧核糖对映异构体混合物(对映体过量值为：-100％，-50％，0，50％，100％)处理后的PEI-g-D-DF杨氏模量，建立出的对映体过量值与聚合物杨氏模量线性关系图。在此基础上，我们测定了三组“未知”脱氧核糖样品，得到的结果能很好的吻合之前得到的线性拟合线，说明该对映体过量测定方法十分准确。

可以理解的是，葡萄糖、木糖、来苏糖、阿拉伯糖或甘露糖也可以参照此方法测量对映体过量值。