一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及烟草制备领域，特别是涉及一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂及其制备方法和应用。本发明提供一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂中，固定化试剂选自多孔淀粉、壳聚糖或壳聚糖衍生物中的一种或多种的组合。本发明中，过氧化氢酶经过环保无毒的固定化剂处理，固定化处理后酶稳定性好、能有效祛除卷烟烟气中的自由基，减害的同时保证醋酸纤维的可纺性、单丝强度、延伸率等不受影。

说明书

本申请为《一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂及其制备方法和应用》的分案申请，原申请 的申请日：2013.10.18，申请号：201310493334.2。

技术领域

本发明涉及烟草制备领域，特别是涉及一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂及其制备方 法和应用。

背景技术

近年来有关吸烟和健康的研究发现，卷烟烟气中的自由基是引起各种疾病的重要原因。 卷烟烟气自由基的直接毒性是直接损伤细胞和酶等物质，并与DNA结合使细胞转化而产生 突变；其间接毒性是可在体内激活和产生大量活性更高毒性更大的其他自由基，如超氧自由 基和羟基自由基，从而导致多种病变。每支卷烟的烟气产生约1*10¹⁶个自由基，烟气中的自 由基一般分为两类，即气相自由基和粒相自由基。气相自由基性质非常活泼，以烷基自由基 和烷氧基自由基为主；粒相自由基的性质较稳定，以醌类和半醌类、稠环芳烃类自由基为主。 研究发现卷烟气相自由基具有较强的氧化性，而粒相自由基具有较强还原性；并且由于粒相 自由基被包埋于烟气粒相聚合物基体中，因此对于粒相自由基的去除主要依赖于烟气总粒相 物含量的整体的下降，选择性降低主流烟气中自由基含量的研究主要集中在气相自由基方面。

祛除卷烟烟气中自由基的研究取得了许多成果，如北京卷烟厂和中国科学院生物物理研 究所利用绿茶提取物和维生素的混合物祛除卷烟烟气中气相自由基；希腊雅典大学的 Stavridis领导的课题组用血红蛋白祛除烟气中气相自由基和其它有害物质，且利用研究成果 分别生产出了ENJOY、五叶神和BF等卷烟产品；广州神农烟科技有限公司等根据中医药学 理论研制开发的“神农萃取液”降低卷烟气相自由基、TSNAs等有害成分；梅建华发明了一种 以茶多酚和维生素C为有效成份的抑制氮氧自由基的卷烟滤嘴；赵保路等发明了一种能明显 降低烟气中自由基的卷烟滤嘴，添加剂为前花青素，或花青素与维生素C混合使用。

由于这些技术大多采用抗氧化剂，而卷烟长期放置后抗氧化剂对自由基的祛除效果会受 到影响，因此，寻找新型廉价、稳定、高效、缓释的抗氧化剂祛除卷烟烟气中气相自由基是 非常必要的。过氧化氢酶又称触酶(Catalase，简称CAT)，广泛存在于人体、动物、植物和微 生物中，动物肝脏、红细胞、植物叶绿体以及细菌、真菌、放线菌等中含有大量过氧化氢酶。 迄今过氧化氢酶已经成为农业，以及食品与乳制品业、纸浆和造纸业、农业环保产业中有应 用价值的酶之一。过氧化氢酶是一个同源四聚体，每一个亚基含有超过500个氨基酸残基， 每个亚基的活性位点都含有一个卟啉血红素基团，用于催化过氧化氢的反应。过氧化氢酶能 够高效催化氧化还原反应，是目前已知几乎所有好氧生物体内最重要的抗氧化屏障；过氧化 氢酶在有过氧化物的条件下，能迅速催化降解烟气中的氮氧化物，破坏气相自由基的反应链， 从而降低烟气中气相自由基的含量。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种可选择性降低卷烟主流烟气中自由基 含量的固定化的过氧化氢酶烟用添加剂。本发明利用酶固定化技术，制成高效、稳定、缓释 的生物酶烟用添加剂，生物酶选择过氧化氢酶，固定化剂可选择多孔淀粉、壳聚糖、壳聚糖 衍生物等。

高活性抗氧化剂自氧化失活快、寿命短、适宜温度范围窄，通过固定化处理后可增强其 稳定性，保留较高的酶活性，具有更强的温度适应能力和更宽的pH适应范围。由于酶的高 活性，添加至滤嘴或烟丝中的添加剂量较小，烟气经过滤嘴后卷烟原有的香气味道没有被改 变，不会破坏消费者的抽吸感受，易被广大消费者认可和接受；同时，此改性滤嘴可不需制 成复合滤嘴，投入生产不需要巨大的设备改造投资。

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种固定化的过氧化氢酶烟用添 加剂及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的问题。

本发明第一方面提供一种固定化的过氧化氢酶烟用添加剂，所述固定化的过氧化氢酶烟 用添加剂中，固定化试剂选自多孔淀粉、壳聚糖或壳聚糖衍生物等中的一种或多种的组合。

本发明第二方面提供所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的制备方法，所述固定化的过 氧化氢酶烟用添加剂中，固定化试剂为多孔淀粉，所述制备方法包括如下步骤：

1)将多孔淀粉加入过氧化氢酶溶液中，室温下充分搅拌后放入冰箱冷藏过夜；

2)将步骤1所得产物固液分离，所得沉淀水洗后抽滤、干燥，研磨过筛即得固定化 的过氧化氢酶烟用添加剂。

优选的，所述步骤1中，多孔淀粉和过氧化氢酶溶液的投料比为1g：8-12ml。

更优选的，所述步骤1中，将多孔淀粉加入过氧化氢酶溶液中以后，调酶液总体积至20ml。

优选的，所述步骤1中，所述过氧化氢酶溶液的酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml，溶剂为中 性磷酸缓冲液，浓度为0.05mol/L。

优选的，所述步骤1中，搅拌的时间为6-10h。

优选的，所述步骤1中，冰箱冷藏过夜的温度为0℃。

优选的，所述步骤2中，将步骤1所得产物固液分离的具体方法为：将步骤1所得产物 离心后弃上清液。

优选的，所述步骤2中，所得沉淀水洗的具体方法为：用去离子水反复冲洗。

优选的，所述步骤2中，干燥的温度为35-45℃。

优选的，所述步骤2中，过筛的具体条件为过80目筛。

本发明第三方面提供所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的制备方法，所述固定化的过 氧化氢酶烟用添加剂中，固定化试剂为壳聚糖或壳聚糖衍生物，所述制备方法包括如下步骤：

1)先将壳聚糖或壳聚糖衍生物溶于冰醋酸水溶液中，再在所得溶液中加入NaOH水 溶液，使其产生白色絮状沉淀；

2)固液分离，将所得沉淀水洗至中性，过滤后即得壳聚糖载体；

3)将所得壳聚糖载体加入戊二醛溶液中，充分搅拌后静置，再过滤、水洗；

4)将步骤3所得产物加入磷酸缓冲液中，再加入过氧化氢酶溶液，充分搅拌后静置， 再抽滤、干燥，研磨过筛即得固定化的过氧化氢酶烟用添加剂。

优选的，所述步骤1中，壳聚糖的平均分子量为2×10⁵-5×10⁵。

优选的，所述步骤1中，冰醋酸水溶液的浓度为0.8-1.2wt％。

优选的，所述步骤1中，NaOH水溶液的浓度为1.5-2.5mol/L。

优选的，所述步骤1中，壳聚糖或壳聚糖衍生物、冰醋酸水溶液、NaOH水溶液的投料 比为3g：1000-1200ml：4-6ml。

优选的，所述步骤3中，戊二醛溶液为戊二醛水溶液，浓度为4-6wt％。

优选的，所述步骤3中，壳聚糖载体、戊二醛溶液的投料比为1g：120-180ml。

优选的，所述步骤3中，搅拌的温度为室温，静置的时间长度为6-8h。

所述步骤3中，水洗的目的为洗去多余的戊二醛。

优选的，所述步骤4中，磷酸缓冲液的pH为6.0-8.0，浓度为0.05mol/L。

优选的，所述步骤4中，过氧化氢酶溶液的活性为1*10⁴CIU/ml，溶剂为中性磷酸缓冲 液，浓度为0.05mol/L。

优选的，所述步骤4中，步骤3所得产物、磷酸缓冲液、过氧化氢酶溶液的投料比为1g： 40-50ml：14-18ml。

优选的，所述步骤4中，搅拌的温度为室温，静置的时间长度为5-7h。

优选的，所述步骤4中，干燥的温度为35-45℃。

优选的，所述步骤4中，过筛的具体条件为过80目筛。

本发明所提供的固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的制备方法中，壳聚糖采取先交联后吸 附的方式固定，即壳聚糖先与交联剂戊二醛充分交联后再吸附过氧化氢酶，较现有的先吸附 后交联的方法有更高的固定化率。

本发明第四方面提供所述的固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的制备方法在烟草制备领域 的应用。

本发明第五方面提供一种降低烟气中气相自由基含量的方法，将所述的固定化的过氧化 氢酶烟用添加剂的制备方法所制备的固定化的过氧化氢酶烟用添加剂添加至醋酸纤维滤嘴或 均匀喷洒至烟丝中。

优选的，添加至醋酸纤维滤嘴时，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的添加量为醋酸 纤维丝束重量的0.2wt％-1.5wt％之间，最佳添加量为0.5wt％。

更优选的，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂添加至醋酸纤维滤嘴的具体方法为：在 丝束制浆过程中添加，制成改性滤嘴。

更优选的，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂添加至醋酸纤维滤嘴的具体方法为：在 纺丝上油过程中添加至醋酸纤维滤嘴表面制成改性滤嘴。

更优选的，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂添加至醋酸纤维滤嘴的具体方法为：将 添加剂以可破裂胶囊的形式加于滤嘴中，制成改性滤嘴。

更优选的，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂添加至醋酸纤维滤嘴的具体方法为：以 粉末的形式将添加剂含于滤嘴中制成复合滤嘴。

优选的，均匀喷洒至烟丝时，所述固定化的过氧化氢酶烟用添加剂的添加量为烟丝重量 的0.2wt％-1.5wt％，最佳添加量为0.5wt％。

将本发明所提供的固定化的过氧化氢酶烟用添加剂制成功能性滤嘴后抽吸检测，卷烟主 流烟气经此滤嘴过滤后气相自由基含量下降35％-43％，卷烟常规指标吸阻、烟碱、焦油及 CO无明显变化。评吸此功能性滤嘴的卷烟刺激性略有降低，原有的烟气香味基本不变。

本发明中，过氧化氢酶经过环保无毒的固定化剂处理，固定化处理后酶稳定性好、能有 效祛除卷烟烟气中的自由基，减害的同时保证醋酸纤维的可纺性、单丝强度、延伸率等不受 影。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置； 所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以 存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明； 还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设 备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其 他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤 的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的 改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

将1g多孔淀粉加入10ml过氧化氢酶液中，酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml，补充适量磷酸 缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)至酶液体积为20ml。室温下搅拌8h后放入冰箱0℃冷藏过夜， 离心后弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗后抽滤，40℃干燥，研磨过80目筛得到多孔淀粉 固定化的过氧化氢酶烟用添加剂。

将此烟用添加剂通过丝束制浆过程制备成功能性醋酸纤维丝束，添加量丝束重量的 1wt％，所得醋酸纤维丝束的可纺性、单丝强度、延伸率没有明显改变。丝束被制成滤嘴后与 无滤嘴的卷烟连接而制成低自由基卷烟，用无添加的同型号卷烟作为对照烟，吸烟机抽吸后 测定气相自由基含量，发现气相自由基的清除率为36％。另外，评吸发现，低自由基卷烟相 对于无滤嘴的卷烟，其香气味道没有明显改变，刺激性略有降低。

实施例2

称取3g壳聚糖溶于1L1wt％的冰醋酸中，加入2mol/LNaOH水溶液5ml，使其产生 白色絮状沉淀，抽滤后沉淀水洗至中性，再抽滤脱水制成壳聚糖载体。取1g该载体，加入 150ml5wt％戊二醛溶液，在室温下搅拌，静置8h，洗去多余戊二醛，抽滤，再加入50ml 磷酸缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)和16ml酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml过氧化氢酶溶液，在室 温下搅拌，静置6h后抽滤，40℃干燥，研磨过80目筛得到壳聚糖固定化的过氧化氢酶烟用 添加剂。

用干法(粉末添加)添加上述添加剂于卷烟的醋酸纤维丝束中，添加量为1.2mg，添加量 为丝束重量的0.7wt％，所得醋酸纤维丝束的可纺性、单丝强度、延伸率没有明显改变。吸烟 机抽吸后测定气相自由基含量，发现气相自由基的清除率为39％。另外，评吸发现，低自由 基卷烟相对于无添加的空白滤嘴卷烟，烟气变得更柔和，香气味道没有明显改变。

实施例3

将1g多孔淀粉加入8ml过氧化氢酶液中，酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml，补充适量磷酸 缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)至酶液体积为20ml。室温下搅拌10h后放入冰箱0℃冷藏过夜， 离心后弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗后抽滤，45℃干燥，研磨过80目筛得到多孔淀粉 固定化的过氧化氢酶烟用添加剂。

将此烟用添加剂通过纺丝上油过程添加至醋酸纤维滤嘴，添加量丝束重量的1.5wt％，所 得醋酸纤维丝束的可纺性、单丝强度、延伸率没有明显改变。滤嘴与卷烟连接制成低自由基 卷烟，用无添加的同型号卷烟作为对照烟，吸烟机抽吸后测定气相自由基含量，发现气相自 由基的清除率为37％。另外，评吸发现，低自由基卷烟相对于无滤嘴的卷烟，其香气味道没 有明显改变，刺激性略有降低。

实施例4

将1g多孔淀粉加入12ml过氧化氢酶液中，酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml，补充适量磷酸 缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)至酶液体积为20ml。室温下搅拌6h后放入冰箱0℃冷藏过夜， 离心后弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗后抽滤，35℃干燥，研磨过80目筛得到多孔淀粉 固定化的过氧化氢酶烟用添加剂。

将此烟用添加剂通过丝束制浆过程制备成功能性醋酸纤维丝束，添加量丝束重量的 0.2wt％，所得醋酸纤维丝束的可纺性、单丝强度、延伸率没有明显改变。丝束被制成滤嘴后 与无滤嘴的卷烟连接而制成低自由基卷烟，用无添加的同型号卷烟作为对照烟，吸烟机抽吸 后测定气相自由基含量，发现气相自由基的清除率为30％。另外，评吸发现，低自由基卷烟 相对于无添加的空白滤嘴卷烟，烟气变得更柔和，香气味道没有明显改变。

实施例5

称取3g壳聚糖溶于1.2L0.8wt％的冰醋酸中，加入1.5mol/LNaOH水溶液6ml，使其 产生白色絮状沉淀，抽滤后沉淀水洗至中性，再抽滤脱水制成壳聚糖载体。取1g该载体，加 入180ml4wt％戊二醛溶液，在室温下搅拌，静置6h，洗去多余戊二醛，抽滤，再加入40ml 磷酸缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)和14ml酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml过氧化氢酶溶液，在室 温下搅拌，静置7h后抽滤，45℃干燥，研磨过80目筛得到壳聚糖固定化的过氧化氢酶烟用 添加剂。

将此烟用添加剂通过丝束制浆过程制备成功能性醋酸纤维丝束，添加量丝束重量的 0.5wt％，所得醋酸纤维丝束的可纺性、单丝强度、延伸率没有明显改变。丝束被制成滤嘴后 与无滤嘴的卷烟连接而制成低自由基卷烟，用无添加的同型号卷烟作为对照烟，吸烟机抽吸 后测定气相自由基含量，发现气相自由基的清除率为38％。另外，评吸发现，低自由基卷烟 相对于无添加的空白滤嘴卷烟，烟气变得更柔和，香气味道没有明显改变。

实施例6

称取3g壳聚糖溶于1L1.2wt％的冰醋酸中，加入2.5mol/LNaOH水溶液4ml，使其产 生白色絮状沉淀，抽滤后沉淀水洗至中性，再抽滤脱水制成壳聚糖载体。取1g该载体，加入 120ml6wt％戊二醛溶液，在室温下搅拌，静置8h，洗去多余戊二醛，抽滤，再加入50ml 磷酸缓冲溶液(0.05mol/L，pH7.0)和18ml酶活性浓度为1*10⁴CIU/ml过氧化氢酶溶液，在室 温下搅拌，静置5h后抽滤，35℃干燥，研磨过80目筛得到壳聚糖固定化的过氧化氢酶烟用 添加剂。

将此烟用添加剂均匀喷洒于烟丝中，添加量为烟丝重量的0.5wt％，烟丝被制成低自由基 滤嘴卷烟，用无添加的同型号滤嘴卷烟作为对照烟，吸烟机抽吸后测定气相自由基含量，发 现气相自由基的清除率为38％。另外，评吸发现，低自由基卷烟相对于无添加的空白滤嘴卷 烟，烟气变得更柔和，香气味道没有明显改变。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。