GMFB的应用、GMFB干扰剂及GMFB干扰剂的应用

摘要

本发明涉及GMFB作为糖尿病视网膜病变早期诊断以及病程进展的生物标记物的应用、GMFB作为糖尿病视网膜病变治疗靶点的应用、GMFB干扰剂及GMFB干扰剂的应用。与现有技术相比，本发明证实在STZ-诱导的I型糖尿病(TIDM)大鼠中，在发病早期GMFB在玻璃体含量显著升高。首次证实随着DR的病情进展，GMFB含量逐渐下降，可以用动态检测DR进展；首次证实干扰DR大鼠GMFB表达，可以保护视功能。首次证实GMFB介导视网膜变性的机制，包括引起Muller细胞的谷氨酰胺合酶降低，导致节细胞死亡，并诱导光感受器细胞引起自噬。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞因子GMFB的用途，尤其是涉及GMFB作为糖尿病视网膜病 变早期诊断生物标记物的应用并作为治疗干预的靶点，GMFB干扰剂及GMFB干 扰剂的应用。

背景技术

随着我国经济的高速发展和老龄化进程的加速，糖尿病(diabetesmilletus，DM) 的患病率正呈快速上升的趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人 民健康的重要慢性非传染性疾病。世界卫生组织推测，在2025年中国糖尿病患者 将达到3亿。糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy，DR)，简称糖网病，是糖 尿病最常见的并发症，在DM患者中1/3发生DR，1/10发生致命性威胁视力的糖 尿病黄斑水肿(diabeticmacularedema,DME)或者增殖性糖网病(proliferative diabeticretinopathy,PDR)，严重影响患者生活质量，世界范围内DR已经成为显著 的社会负担和社会问题。DR曾被认为是视网膜的微血管病变，微循环损害是DR 的经典标志，但是越来越多的证据提示在DR的病理过程中神经变性是一个早期事 件，并参与微血管异常的发展。组织学上神经元凋亡和反应性的胶质化是DR神经 变性的最重要的特征。目前DM捐献眼在眼科检查没有发现任何微循环异常，但 是已经具有主要的神经变性的特点。视网膜节细胞(RGC)是DR最先被检测的发 生凋亡的细胞；RGC丢失导致神经纤维层变薄，在DM患者或者有轻微DR的DM 患者通过OCT检测都检测到，在没有任何微血管病变的DMI型和II型病人发现 ERG(electroretinogram，视网膜电流图)异常。神经元凋亡伴随着Muller胶质细 胞的变化。目前尚不清楚神经元凋亡和胶质化哪一个在DR中是第一个发生的事 件。研究DR神经变性的机制及鉴定在神经变性的介导者对于研发新的治疗策略是 非常必要的。从临床角度早期鉴别神经变性对于基于神经保护的药物的应用是必须 的。

DR神经变性的机制研究现状：介导DR神经变性的主要机制有细胞外兴奋毒 性谷氨酸(Glutamate，Glu)集聚、氧化应激增加、视网膜分泌保护因子的减少及 慢性炎症。SchellinSA等用光镜和电镜检测发现，DM早期Muller细胞核已发生 改变，而视网膜血管内皮细胞、周细胞并未见明显病理改变，DM早期视网膜Muller 细胞的超微结构和生理功能已发生变化，不仅影响早期DM患者神经细胞功能异 常(表现为视觉敏感度及色觉敏感度下降，视网膜振荡电位b波异常)，而且影响 整个DR的进展过程。在研究介导DR神经变性的分子中，我们更关注Muller细胞 产生的分子。

胶质细胞成熟因子beta(gliamaturationfactorbeta,GMFB)与神经变性： GMFB最早从牛脑分离纯化的17kd酸性胞浆蛋白，进化上高度保守，在中枢神经 系统主要由星形胶质细胞产生，对脑组织生长、分化和再生有重要的作用，其表达 在发育期上调，成年明显降低。在大鼠视网膜GMFB仅在Muller细胞表达，从胚 胎14天到成年均表达。新近研究显示GMFB是一种促炎因子，与人中枢神经系统 退行性疾病密切相关，如阿茨海默病和帕金森病。GMFB基因敲除小鼠能够抵抗 实验性自身免疫性脑炎和MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)的毒性。

目前用于DR进展相关的细胞因子包括以下4类：(1)，调节自然免疫的因 子:IL-1b,IL-10；(2)调节淋巴细胞激活增殖和分化的因子：IL-6和IL-12；(3)与 激活巨噬细胞相关的因子：TNFa和TGFb(4)趋化因子，如MCP-1、SDF-1等， 目前也未见GMFB在DR中的作用报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种GMFB的应 用、GMFB干扰剂及GMFB干扰剂的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明发现GMFB是在大鼠视网膜的节细胞层、内核层、视网膜色素上皮细 胞层表达，在STZ-诱导的糖尿病(DM)的血糖升高的第一天在玻璃体可检测到 GMFB含量明显升高，持续到第四周，然后逐渐下降，可作为生物标记物检测DR 发病的过程。GMFB处理大鼠Muller细胞(视网膜的胶质细胞)引起谷氨酰胺合 成酶含量降低，导致Muller细胞功能受损；用GMFB处理光感受器细胞系661w 引起自噬；在正常SD大鼠视网膜下腔注射3*10^6gcAAV2/8-GMFB病毒，在注 射后6周，出现ERG波幅下降，视网膜核层变薄，光感受器细胞丢失，节细胞发 生凋亡。这一发现首次证实GMFB在DR早期明显上调，介导神经视网膜变性， 在STZ-诱导的DR第一天，ERG检测即可发现b波波幅下降，提示视功能损害， 可能与高血糖引起的氧化应激对神经视网膜的损害有关。进行视网膜下腔注射 3*10^6gcAAV2/8-shGMFB4周后检测，对注射空病毒组相比，ERG检测B波增 高，提示视功能受到保护。

本发明的第一方面，提供了GMFB作为糖尿病视网膜病变早期诊断以及病程 进展的生物标记物的应用。

所述的生物标记物是指检测玻璃体GMFB的含量评估DR的病程进展。

本发明的第二方面，提供了GMFB作为糖尿病视网膜病变治疗靶点的应用， 并提供了GMFB介导视网膜变性的可能机制，可以通过干扰技术下调DR大鼠视 网膜GMFB蛋白的表达，从而保护视功能。

本发明的第三方面，提供了GMFB干扰剂，所述的GMFB干扰剂为干扰GMFB 活性或下调GMFB表达的物质，所述的GMFB干扰剂为化学合成的shGMFB，或 包含shGMFB的载体，其中，shGMFB为小发卡GMFB寡核苷酸(smallhairpin GMFB，shGMFB)。

本发明的第四方面，提供了GMFB干扰剂的应用，GMFB干扰剂用于制备预 防、改善或治疗糖尿病视网膜病变的药物组合物。

本发明利用ELISA方法检测STZ-诱导DM大鼠玻璃体GMFB的含量，发现 GMFB在实验性DM大鼠的早期显著升高维持在高水平至发病后4周，然后逐渐 下降。然后发现，在STZ-诱导的I型糖尿病(TIDM)大鼠中，采用RNA干扰技 术下调GMFB表达能够抑制胶质化，明显下调GFAP的表达(胶质化的标记物)， 降低炎症因子分泌，保护视功能。而AAV2/8介导的GMFB过表达又能够引起节 细胞凋亡，损害视功能，最后体外实验采用GMFB处理Muller细胞引起Muller细 胞转化谷氨酸毒性能力下降，与谷氨酰胺合酶下降有关；用GMFB处理661w细 胞，引起光感受器细胞自噬性死亡。这说明GMFB可作为DR发生、发展的一个 生物标记物，同时GMFB也可作为DR早期干预的靶向，而保护视功能。

本发明首次证实在STZ-诱导的I型糖尿病(TIDM)大鼠中，在发病早期GMFB 在玻璃体含量显著升高。首次证实随着DR的病情进展，GMFB含量逐渐下降，可 以用动态检测DR进展；首次证实干扰DR大鼠GMFB表达，可以保护视功能。 首次证实GMFB介导视网膜变性的机制，包括引起Muller细胞的谷氨酰胺合酶降 低，导致节细胞死亡，并诱导光感受器细胞引起自噬。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)在DR大鼠的视网膜，发现GMFB在节细胞层、内核层、RPE层均表达， 在DR极早期(血糖升高的第一天)在玻璃体GMFB含量显著升高；

2)在正常SD大鼠过表达GMFB引起视网膜变性。首次证实了GMFB介导神 经变性的机制，包括引起Muller细胞谷氨酰胺合酶降低，节细胞凋亡和光感受器 细胞自噬性死亡；

3)在DR视网膜干扰GMFB，胶质化过程受到抑制，保护视功能。

附图说明

图1：GMFB在DR发病不同核层的表达结果；

图2：在STZ-诱导的TIDM大鼠的玻璃体中GMFB浓度随着DR病程的变化 结果；

图3：AAV2/8-shGMFB干扰对STZ-诱导DR的视功能影响结果；

图3a：shGMFB视网膜下腔注射DR大鼠，GMFB与GFAP变化结果；

图3b：shGMFB视网膜下腔注射DR大鼠，在注射后第四、六周ERG检测b 波结果；

图3c：shGMFB视网膜下腔注射DR大鼠，在注射后第四周mRNA水平检测 GFAP、GMFB表达结果；

图4：GMFB过表达结果；

图4a：AAV2/8-GMFB视网膜下腔注射后6周后外壳层变化情况；

图4b：AAV2/8-GMFB视网膜下腔注射后6周后节细胞凋亡情况；

图5：GMFB处理Muller对谷氨酰胺合酶的影响；

图6：GMFB处理661w引起自噬结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中，661w购自ATCC，培养基为低糖DMEM。rMC-1细胞系由实 验室制备，培养基为高糖DMEM，含10％血清和1％P/S。培养环境是37℃、5％CO₂ 和95％空气。以AAV2/8作为载体介导GMFB的过表达，记做载体AAV2/8-GMFB； 以AAV2/8作为载体介导GMFB的干扰载体记为AAV2/8-shGMFB。 AAV2/8-shGMFB和AAV2/8-GMFB为商品化包装好的病毒，购自武汉维诺赛生物 技术有限公司，滴度10^9gc/ml，LC3病毒购自汉恒生物，大鼠GMFBELISA试 剂盒购自elabscience。

实施例1

GMFB在糖尿病视网膜不同核层的表达

1、糖尿病大鼠制备：采用雄性SD大鼠，160-180g，实验前先将大鼠饥饿24 小时。单次腹腔内注射STZ(60mg/kg体重)来诱发DM，正常对照组腹腔注射等 体积的柠檬酸溶液；24小时后断尾取血测血糖，血糖值低于250mg/dL的大鼠补 充注射STZ。连续3天测血糖。将血糖连续3天超过250mg/dL的大鼠确定为DM 大鼠(血糖低于250mg/dL的大鼠将被排除)。虽然制备的是DM大鼠，在检查眼 部改变情况，至少在两周时，已经可以检测到神经视网膜、RPE、血管内皮细胞、 BRB、ERG等改变支持视网膜已经发生病变，可以用作DR模型。

2、激光显微切割样品的实时定量PCR检测GMFB表达：

新鲜获得取不同时间点视网膜，制备冰冻切片，将切片直接贴在激光切割的膜 上，按照莱卡激光切割样品制备方法进行制备(莱卡Lasermicrodissection(LMD)6500)。 切片厚度是8um，分别收集3个切片的内核层、外核层、节细胞层和视网膜色素上 皮细胞层于0.5ml的Trizol里，进行抽提总RNA。经过逆转录和实时定量PCR分 析，采用半定量的方法计算。

主要步骤如下：

1.将激光切割获得的组织收集在0.5mlTrizol裂解液。

2.然后转移到1.5mL的离心管，加入五分之一体积的氯仿，剧烈混匀后，以 12000rpm的转速4℃离心15分钟。

3.离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入 等体积的异丙醇，加入1ul20ug/ml糖原作为核酸载体，冰浴20分钟。

4.12000rpm的转速4℃离心15分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗1-2 次。

5.将沉淀室温干燥后，用适量的8ulDEPC水溶解。

RNA反转录，cDNA第一条链是通过Promega公司的M-MLV反转录酶获得 的，主要步骤如下：

1.首先取8ulRNA与2μLTakara的逆转录试剂supermix混合均匀，然后37 度15分钟，85度5秒结束逆转录。

引物见下表1。

表1用于检测基因的引物

Name forward reverse qRo-GAPDH CCCCTTCATTGACCTCAACTACA TCCCATTCTCAGCCTTGACTGT qRo-GFAP CCTTGACCTGCGACCTTGAG CCTGTTCGCGCATTTGC qRo_GMFB GATGATGTACGCTGGGAGTAAGAAC GGTCTTCGGTGTTTCTTATTTCAAA

反转录体系如表2：

表2反转录体系

试剂 用量(μL) 终浓度 5×supermix 2 1× 总RNA 8 50-100ng

反转录程序：37℃15分钟，85℃5秒，然后可于-20℃冰箱保存备用。

定量PCR

将RNA反转录后得到的cDNA第一链作为模板，设计引物如表1。利用天根 公司的SYBRGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测目的基因的表达量。PCR 扩增条件如下：94℃变性10分钟，进入循环(95℃5sec，60℃60sec)，一共40 个循环，并收集溶解曲线。

实验结果如图1所示，其中，GCL，ganglioncelllayer节细胞层；INL，innercell layer，内核层；ONL，outernuclearlayer外核层；RPE，retinalpigmentepithelia， 视网膜色素上皮细胞。通过图1可以看出，在正常对照大鼠视网膜，GMFB表达 主要在节细胞层，在血糖升高的第一天，节细胞层和RPE细胞层表达上调，在DM 发病一周，GMFB在节细胞层、RPE细胞层的表达明显上调，在内核层表达开始 上调；在DM发病2周，GMFB在节细胞层和RPE层表达下调，在内核层、外核 层表达逐步上调，高于DM一周的GMFB在内核层的表达。

实施例2

在STZ-诱导的TIDM大鼠的玻璃体中GMFB浓度随着DR病程的变化

采用STZ制备I型糖尿病模型，方法同实施例1，在不同的时间点收取糖尿病 大鼠的玻璃体，每个时间点收集6-8只，分别收集，1000g于4度离心20分钟后 转移上清备用，进行ELISA检测，结果参加图2，图2中，Cont为正常对照，PI 为postinjection注射后，DM即糖尿病，由图2可知，在血糖升高的第一天，发现 GMFB显著升高，然后略有下降，并维持在高水平，从第四周开始逐渐下降，在 DM发病第八周，降至与正常对照相近水平。大鼠的GMFB的elisa试剂盒购自 Elabscience(货号是E-EL-Ro419C)根据试剂盒说明进行，主要步骤包括：

1.样品收集:大鼠玻璃体收集后1000×g离心20分钟，取上清用于检测

2.检测前准备工作:

(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。将浓缩洗涤液用双蒸水 稀释(1:25)。

(2)标准品配制:于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL 至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用 移液器将其轻轻混匀(浓度为1000ng/mL)。然后根据需要进行倍比稀释(注：不 要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度：1000、500、250、125、 62.5、31.25、15.625、0ng/mL，标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如 配制500ng/mL标准品：取0.5mL1000ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品 &样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。

(3)生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计)， 实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓 缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

(4)酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计)，实 际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP 酶结合物(1:100)成工作浓度。当日使用。

3.操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并 尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加 于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分 钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL(在 使用前15分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔， 甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加酶结合物工作液(临用前15分钟内配制)100μL，加上覆膜，37℃ 温育30分钟。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右 (根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯 度时，即可终止)。

7.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应 尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标 仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

实施例3

干扰GMFB改善DR大鼠视功能

1、制备I型糖尿病大鼠模型，方法同实施例1。

在STZ-TIDM大鼠发病当天(指大鼠连续3天血糖浓度超过250mg/dL后的第 一天)，视网膜下腔注射AAV2/8-shGMFB3ul，在注射后4周检测GFAP免疫荧光， 提示胶质化受到抑制。AAV2/8-shGMFB干扰对STZ-诱导DR的视功能影响如图3 所示。

结果参见图3a，在DR大鼠视网膜干扰GMFB使神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)表达下降。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)是一种脂溶性荧光染料，对 细胞核进行染色；Zsgreen是一种绿色标签，RPE是视网膜色素上皮细胞，ONL 是外核层，INL是内核层，GCL是节细胞层，merge是重叠，将绿色的荧光、红色 的荧光和蓝色的荧光进行重叠。

结果参见图3b，在注射后干扰GMFB病毒后4周ERG检测显示b波增高， 提示视功能改善的量化统计。

结果参见图3c，在注射后干扰GMFB病毒后4周，在mRNA水平经过定量 PCR检测GFAP和GMFB表达显著下降，有统计学差异。

提取RNA采用的是Trizol裂解的方法，主要步骤如下：

1.将细胞用PBS缓冲液洗1-2次，按比例加入Trizol裂解液(例如六孔板的 一个孔对应1mL裂解液)。

2.细胞离壁后，转移到1.5mL的离心管，加入五分之一体积的氯仿，剧烈混 匀后，以12000rpm的转速4℃离心15分钟。

3.离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入 等体积的异丙醇，冰浴20分钟。

4.12000rpm的转速4℃离心15分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗1-2 次。

5.将沉淀室温干燥后，用适量的DEPC水溶解。测浓度。

RNA反转录，cDNA第一条链是通过Promega公司的M-MLV反转录酶获得 的，主要步骤如下：

1.首先取1-2μg的RNA与2μL的oligod(T)混合，72℃水浴放置5分钟， 立即冰浴2分钟后，使oligod(T)与RNA的poly-A尾巴结合，轻微离心。

2.加入1.25μL的dNTP(10μM)、1μLM-MLV反转录酶和0.5μLRNA酶抑 制剂，用DEPC水将反应体积调节到25μL。42℃水浴放置1小时。

3.70℃放置10分钟使反转录酶失活。将得到的cDNA单链保存于-20℃冰箱。

反转录体系如表3：

表3反转录体系

试剂 用量(μL) 终浓度 5×M-MLV buffer 4 1× dNTP(10μM) 0.75 0.375mM miRNA RT primer(1μM) 1.2 60nM M-MLV 0.2 20U RNA 1 0.2-200ng H₂O 12.85

反转录程序：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃10分钟后立即置于冰上5 分钟。然后可于-20℃冰箱保存备用。

定量PCR

将RNA反转录后得到的cDNA第一链作为模板，设计引物如实施例1中表1。 利用天根公司的SYBRGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测目的基因的表 达量。PCR扩增条件如下：94℃变性10分钟，进入循环(95℃5sec，60℃60sec)， 一共40个循环，并收集溶解曲线。

ERG方法：APS全自动视觉电生理检查仪(APS-2000)购于重庆康华科技有 限公司。做视觉电生理功能检查前一天，把DM大鼠转移到暗房，进行暗适应。 第二天开始做。大鼠的准备：向大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1mL/500g体重)进 行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)让眼球突出，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳 (WuxiShanheGroup，Jiangsu，China)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(EisaiCo Ltd，Tokyo，Japan)，每只眼睛各涂一点导电膏。插电极：地线接大鼠尾巴上，负 极接大鼠两耳朵之间，正极接两眼睛角膜上，注意不要触到眼睑和巩膜上。打开软 件“视觉电生理图”，点“FERG”，再点1,2通道，一个为左眼通道，另一个为 右眼通道，点“设置”，刺激次数为2次，刺激频率为0.05Hz；依次点击刺激强 度(1)―0.0006325(cd*s/m)、(5)―0.006325(cd*s/m)、(9)―0.06325(cd*s/m)， 每次强度至少间隔2min。点“示波”，待波的基线平稳时，点击“采集”，等听 到“嘀”的一声后，采集完毕，点击“保存”。再点击“设置”，修改文档号和刺 激强度，依次类推。等所有强度做完后，换下一只大鼠。所有大鼠做完后，打开“文 件”，进行标定，双击曲线，曲线变为白色，点击“标定”。标定完a波后，按 空格键，标定b波。所有标定完毕，点击“打印”，保存为.PDF格式。点击左下 角按钮，退出软件，关闭电脑，关闭放大器。

结果显示在AAV2/8-shGMFB病毒在视网膜下腔注射病毒第4周、6周分别进 行ERG检测，注射后4周有显著差异，但在注射后6周没有统计学差异，(图3b)， 提示GMFB干扰能够保护视功能。

眼内注射：

注射前大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1mL/400g体重)进行麻醉，然后给予一 滴0.5％托吡卡胺散瞳(WuxiShanheGroup，Jiangsu，China)，一滴0.4％盐酸奥布 卡因表面麻醉(EisaiCoLtd，Tokyo，Japan)。

视网膜下腔注射时，先用30号的针头在颞侧角巩膜缘后2mm处做一个通道， 然后用33号的针头(Lot#440602，Hamilton，Reno，NV)和5μL的微量注射器 (P/N：7634-01/00，Hamilton，Reno，NV)注射AAV2-CMV-hEPO。如果注射成 功，眼底可见一个小泡状结构，数分钟后视网膜变平，小泡消失，如果有玻璃体出 血、晶体损伤的大鼠排除出此实验。

实施例4

在正常SD大鼠过表达AAV2/8-GMFB

将3*10^6gcAAV2/8-GMFB在正常大鼠视网膜下腔注射，方法同实施例3。注 射后6w分离视网膜，进行冰冻切片，并进行DAPI染色，采用Photoshop进行核 层厚度测量。

结果参见图4a，在病毒注射区外核层厚度明显变薄，核层厚度为零的是视神 经乳头。

结果参加图4b，在病毒注射后6周，采用TUNEL染色，发现在节细胞层出现 凋亡阳性信号。

视网膜厚度测量：

冰冻切片经DAPI染色后行视网膜厚度测量及细胞计数分析。视网膜厚度测量 在400倍放大的显微镜下进行。测量在距离视神经乳头1mm、视乳头两侧进行， 包括：(1)外界膜－内界膜(OLM-ILM)；(2)外界膜－节细胞层(OLM-GCL)； (3)外核层－外网层(ONL-OPL)；(4)内核层(INL)；(5)外核层(ONL)。每 个眼球取5张视网膜切片，每组4只大鼠。

TUNEL检测主要步骤如下：

采用InSituCellDeathDetectionKit试剂盒来检测细胞凋亡，根据试剂盒中提 供的流程进行实验操作。阳性对照是预先将视网膜用GradeIDNase-I室温孵育10 分钟，阴性对照则只加标记液、不加酶液。样品经37℃孵育1小时后，用PBS洗 涤3次，在荧光显微镜(Nikon,Yokohama,Japan)下直接观察，激发波长为 450-490nm。

实施例5

GMFB处理Muller对谷氨酰胺合酶的影响；

大鼠Muller细胞系培养于DMEM-高糖培养基，含10％血清和双抗。将重组 GMFB干粉溶于无菌PBS溶液，终浓度500ug/ml，将GMFB加入无血清的DMEM- 高糖培养基，在不同的时间点收集细胞，抽提总蛋白，然后用ELISA进行谷氨酰 胺合酶(GS)的检测。

结果参见图5所示，GMFB处理Muller细胞8小时，GS含量下降，随着处理 时间的延长持续下降，所用抽提蛋白和ELISA方法同前。

实施例6

GMFB处理661w细胞引起自噬

小鼠光感受器细胞系培养于DMEM-低糖培养基，含10％胎牛血清和双抗， RFP-GFP-LC3腺病毒购自汉恒生物。661w先用RFP-GFP-LC3腺病毒(滴度为 10^10pfu)感染661w。感染1天后，用无血清培养基含GMFB处理661w时。参 见图6所示，GMFB处理661w4小时，细胞开始出现红色和绿色荧光，点状，提 示LC3转位到溶酶体膜上，提示自噬发生，处理8小时，点状荧光明显，自噬的 红绿色荧光需要在共聚焦显微镜下进行观察拍片。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发 明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。