一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白

摘要

本发明公开了一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ？ID？No.1，基因序列SEQ？ID？No.2，其保藏号为M2015388；同时公开了合成该重组蛋白的上下游引物SEQ？ID？No.3和SEQ？ID？No.4以及合成该重组蛋白的制备方法。通过west-blotern及ELISA检测发现该重组蛋白对羊脑多头蚴感染血清反应明显，表明这种重组蛋白对羊脑多头蚴病具有诊断价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于多头带绦虫的重组蛋白及其制备方法，本发明还涉及该重组蛋白在羊脑多头蚴病诊断上的应用。

背景技术

脑多头蚴病（Coenuruscerebralis）俗称脑包虫病，是多头带绦虫的幼虫，脑多头蚴寄生于绵羊和山羊等有蹄类反刍动物脑内，可引起一种严重致死性的寄生虫病，人也可作为中间宿主感染。其成虫寄生于犬科肉食兽的小肠。脑多头蚴病的致死率可达100%，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。该病呈全球性分布，是一种重要的人畜共患寄生虫病。所以该病的早期诊断对患畜的检疫与治疗有着非常重要的社会经济意义。

早期报道的羊脑多头蚴病诊断抗原有包囊液、原头节组织匀浆等粗抗原，但因其抗原来源十分有限，而且其诊断的敏感性不高,特异性不强,与其他羊绦虫蚴病(如羊细颈囊尾蚴病,羊囊尾蚴病)存在交叉反应。目前，一些重组抗原如Tm7等也被应用于诊断，可能克服运用粗抗原作为诊断抗原的一些不足，当然，这些重组抗原对哪个感染时期的血清或哪种感染剂量的血清敏感，还需进一步研究证实。

发明内容

本发明提供了一种诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白。本发明同时提供了一种用于制备上述重组蛋白的方法及制备该重组蛋白的引物，以及该重组蛋白的用途。

本发明提供的这种诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白是脑多头带绦虫基因TmAdh3的ORF序列在原核表达系统下的重组蛋白，其氨基酸序列是SEQIDNo.1，基因序列为SEQIDNo.2。该重组蛋白已于２０１５年６月１９日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2015388。

TmAdh3序列是以脑多头蚴原头节基因组DNA为模板，分别以用上游引物序列SEQIDNo.3和下游引物序列SEQIDNo.4进行PCR扩增得到。

本发明的重组蛋白的制备方法是针对前述来源于多头带绦虫的TmAdh3基因全序列，在其ORF序列5′端和3′端分别加上酶切位点BamHⅠ/XhoⅠ后人工合成，测序获得基因序列SEQNo.3。接着将合成的SEQNo.3产物与载体pGEX-4T-1分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后回收产物以T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-4T-TmAdh3，再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基培养，将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养物沉淀，用pH7.4PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后，将可溶性表达上清用GST琼脂糖树脂纯化，得到目标蛋白。

本发明提供的重组蛋白可在诊断羊脑多头蚴病中应用。通过west-blotern及ELISA检测发现该重组蛋白对羊脑多头蚴感染血清反应明显，从而推测这种重组蛋白对羊脑多头蚴病具有诊断价值。

附图说明

图1是实施例一中TmAdh3基因的PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳结果。其中，M:DNA分子质量标准DL2000；1:TmAdh3基因PCR产物。

图2是实施例二中TmAdh3重组蛋白诱导表达及表达形式SDS-PAGE鉴定结果。

M：低蛋白分子质量标准；1：pGEX-4T-1/BL21菌液未诱导；2：pGEX-4T-1/BL21菌液诱导；3：pGEX4T-1-TmAdh3/BL21菌液未诱导；4：pGEX-4T-1-TmAdh3/BL21菌液诱导；5：pGEX4T-1-TmAdh3/BL21裂解液的上清液；6-7：pGEX-4T-1-TmAdh3/BL21裂解液2mol/L尿素洗涤液；8：pGEX4T-1-TmAdh3/BL21裂解液8mol/L尿素溶解沉淀。

图3是实施例三中TmAdh3重组蛋白纯化产物SDS-PAGE鉴定。M：低蛋白分子质量标准；1：纯化后的重组TmAdh3蛋白。

图4是实施例四中TmAdh3重组蛋白与绵羊脑多头蚴感染血清进行Westernblot分析。M：蛋白质分子质量标准；1：羊脑多头蚴自然感染血清；2：健康羊血清。

具体实施方式

本发明以下结合实施例作进一步详述。

一、脑多头蚴TmAdh3基因的克隆

1.基因组DNA的提取

从甘肃景泰屠宰场收集脑多头蚴病羊，开颅分离到脑多头蚴包囊，形态学检查确认后，将原头节无菌条件下剥离后，用PBS洗涤，最后应用北京天根公司的组织DNA提取试剂盒提取脑多头蚴基因组DNA，具体操作详见说明（略）。

2.TmAdh3基因的扩增

以前述内容1.1提取的脑多头蚴基因组DNA为模板，用上游引物序列SEQIDNo.3（5′-ATACGCAATGATTTGTGCCT-3′）和下游引物序列SEQIDNo.4（5′-ACGATGGCCTCGAAAGATTC-3′）进行PCR扩增得到。PCR反应体系：10×PCR缓冲液5μL，dNTPmixture（2.5mmol/L）4μL，引物（10μmol/L）各1μL，LATaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板基因组DNA1μL，加入ddH2O至50μL。反应条件：94℃1min；94℃30s，50℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min。反应结束后，取5μLPCR产物于8g/L琼脂糖凝胶中电泳观察结果。其余产物克隆于pMD18-T载体中，进行测序，获得TmAdh3基因组DNA完整序列。

3.TmAdh3基因的克隆、序列分析

(1)将上述2的PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化(北京天根公司DNA纯化试剂盒)，具体步骤见试剂盒说明（略）：

(2)TmAdh3基因与pMD-18T克隆载体的连接

连接体系为：pMD18T克隆载体1μL(50ng/μL)，TmAdh3基因PCR纯化产物4μL，SolutionI5μL，混匀后置16℃连接4h后转化E.coliDH5α感受态细胞，然后涂布于氨苄青霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜。挑选转化后的单个菌落，进行PCR阳性鉴定。

(3)TmAdh3基因的序列分析

分别取阳性重组菌送上海生工测序公司测序，分析测序结果，通过Blast分析确定其ORF序列，去除信号肽序列并在5′端和3′端分别加上酶切位点BamHⅠ/XhoⅠ后人工合成该序列。其基因编码的氨基酸序列为SEQIDNo.2,基因编码的氨基酸序列为SEQIDNo.１。

二、TmAdh3重组蛋白的表达

将上述人工合成的TmAdh3基因产物及pGEX-4T-1质粒，分别用BamHⅠ/XhoⅠ进行双酶切，回收产物以T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-4T-TmAdh3，并测序验证正确后转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落，37℃过夜培养后，按1：50转接至新的LB培养基中（含氨苄青霉素100μg/mL）进行扩大培养，当OD600为0.6时，取1mL未诱导菌液作为阴性对照，向剩余菌液中加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm，4h，收集菌体，取1mL诱导后的菌液。剩余菌液进行离心收集菌体，4℃，5500rpm，15min，在菌体沉淀中加入磷酸盐缓冲液（PBS）（1g/5mL），混匀，反复冻融3次。超声破碎后，离心（4℃，12000rpm，15min），收集上清，依次用2M尿素洗沉淀2次，最后用8M尿素溶解沉淀。将收集的未诱导及诱导菌液、上清样品、2M尿素洗涤液及8M尿素溶解的沉淀样品进行处理，进行SDS-PAGE分析，以确定重组蛋白TmAdh3的表达形式。

三、TmAdh3重组蛋白的纯化

TmAdh3重组表达蛋白使用北京韦氏博慧色谱科技有限公司谷胱甘肽琼脂糖凝胶FF树脂进行纯化，方法参见使用说明（略）。TmAdh3重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE蛋白电泳检测没有杂带后，用紫外分光光度计测定浓度，?80°C保存备用。

四、TmAdh3重组蛋白West-blotting鉴定

将GST-TmAdh3重组蛋白进行SDS-PAGE，然后用Bio-Rad半干转印仪在15V电压电转15min至NC膜。用5%脱脂牛奶封闭1h后，加入相应的以1：200倍稀释的健康羊血清和脑多头蚴感染羊血清，室温孵育1h。TBST反复清洗3次，每次10min。然后加入以1：4000倍稀释的AP标记的驴抗羊IgG，室温孵育1h,最后加入NBT/BCIP混合显色液避光显色5～10min，显色后弃去显色液用水终止反应。

应用western-blot试验证实，自然感染脑多头蚴的绵羊血能与其特异结合，说明本发明构建的脑多头蚴重组蛋白具有很好的反应原性，具有潜在的脑多头蚴诊断价值。

五、TmAdh3重组蛋白ELISA方法的建立

抗原不同浓度梯度包被

将纯化后的TmAdh3重组蛋白用0.05mol·L^-1pH9.6的碳酸盐缓冲液按2、1、0.5、0.25μg/孔依次倍比稀释，每孔100μl包被96孔的ELISA板，37℃温箱孵育2h后于4℃过夜包被。

1.封闭

次日将ELISA板甩干，用PBST（0.01mol·L^-1pH7.4PBS中加入0.05%吐温-20）洗涤三次后，用200μl含1%BSA的封闭液37℃封闭每孔30min，甩干；用PBST洗涤3次；

2.不同稀释度血清孵育

将标准阴性、阳性血清用PBST依次作1:20、1:40、1:80、1:160共4个梯度稀释后以100μl/孔，37℃孵育1h；甩干，用PBST洗涤3次；

3.二抗孵育

每孔加入1：8000倍稀释的HRP标记的驴抗羊IgG孵育1h，同上甩干后用PBST洗涤4次，接着每孔加入100μlOPD底物显色液，37℃避光反应15min，最后每孔加入50μl的2mol·L^-1H₂SO4终止反应；

4.酶标仪读值

用微量板酶标自动检测仪于490nm处测定OD490nm，同时设空白孔。读数结果选择阳性血清OD490nm值（P）在1.0左右，阴性血清OD490nm值（N）在0.2～0.3左右，P/N值最大时的抗原包被量和血清稀释倍数为最佳工作浓度。

5.最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

最终通过方阵滴定确定TmAdh3重组抗原浓度为0.5μg/孔，血清稀释浓度为1:80。

6.判定标准的确定

将12份无绦虫蚴感染的健康绵羊血清依据上述确定的最佳条件进行ELISA检测，根据公式：阴阳性临界值=阴性样本OD490nm平均值+3×S，最终确定阴阳性判定临界值为0.7，以标准阳性血清的OD490＞1.0，标准阴性血清的OD490nm≤0.3时，判为试验成立；以OD490nm≥0.7作为抗体阳性判断的下限，或者将P/N≥2.0定为阳性判定标准。

六、临床绵羊血清样品的检测分析

按照已建立的间接ELISA方法，检测近年来我们实验室收集的12份绵羊脑多头蚴自然感染血清、12份绵羊脑多头蚴实验室人工感染血清及7份绵羊细粒棘球蚴感染血清，测定OD490值。

1）12头份剖检确认有脑多头蚴包囊的感染绵羊血清中有2份的ＯＤ值低于临界值，其余10份的ＯＤ值高于临界值，敏感性为83.3%（见表1）。

2）6份细颈囊尾蚴感染血清，有1份ＯＤ值高于临界值，说明该绵羊细颈囊尾蚴感染血清能与脑多头蚴重组蛋白非特异性的结合，存在少量的交叉反应（见表1）。

通过实验室收集样本的检测，发现该重组蛋白能特异的识别脑多头蚴感染血清，适合应用于羊脑多头蚴病的诊断，具有良好的开发应用前景。

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白

<160>序列表中序列的个数（如18）（注：CN1至CN8的基因序列与其氨基酸序列）

<210>1

<211>136

<212>PRT

<213>Tmadh3基因编码的氨基酸序列

<400>

MetValValArgPheCysLeuLeuIleLeuValAlaSerValLeu

51015

ThrAlaLysValLysGluAlaGlyGluGlyProLysLeuAspGlu

202530

AsnProValProGluValPheArgLeuAspGlyValThrSerAsp

354045

AlaPheArgLeuThrTrpAsnValGlnHisLeuIleGlyLeuGly

505560

ValLysSerValGluValAlaTyrThrGlnAlaGluLysLeuAsp

657075

LysTrpGlySerArgLeuValAspValValMetGlyGluValVal

808590

IleGlyGlnLeuLeuProAspThrLeuTyrSerValLysIleVal

95100105

AlaPheGlyAlaAspAlaValLysLeuThrHisAspAlaLeuLeu

110115120

LysThrLeuProIleGluValGlyIleGlyArgGlyArgLeuGlu

125130135

Asn

136

<210>2

<211>411

<212>DNA

<213>Tmadh3基因核苷酸序列

<400>

atggtggttcggttctgcctcttaatcttagtagcctcagtgttgactgctaaagtaaaa　　　　　60

gaagccggtgaagggccaaagttggacgaaaatcccgtcccggaagtgtttcgtttggac　　　　　120

ggagtgacatctgatgcgtttcggttgacttggaatgtgcagcatctgattggacttggc180

gtgaaatcggttgaggtggcctatacacaagctgagaagctggacaaatgggggagcagg240

ctcgtagacgtggtcatgggagaagtcgtcattgggcagttgctccccgacacgctgtac300

tcggtgaagatagtagcgttcggagctgacgccgttaaactcactcatgatgctttactc360

aaaacactgccgattgaagttggaataggaagaggtcgccttgaaaactag411

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列（上游引物）

<400>

atacgcaatgatttgtgcct　　20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列（下游引物）

<400>

acgatggcctcgaaagattc20