LECT2多肽、LECT2蛋白在制备动员造血干/祖细胞药物中的应用

摘要

本发明提供了LECT2多肽、LECT2蛋白在制备促进造血干/祖细胞动员药物中的应用以及在制备促进骨髓造血干/祖细胞数量增加药物中的应用。本反应研究发现LECT2多肽、LECT2蛋白在促进造血干/祖细胞动员药物中、在促进骨髓造血干/祖细胞数量增加中具有极其显著的效果，并且副作用小。

说明书

技术领域

本发明涉及LECT2蛋白、LECT2多肽的应用，及LECT2蛋白、LECT2多肽中的氨基酸序列。

背景技术

造血干/祖细胞移植经常被用于治疗多种疾病，增加造血干/祖细胞在骨髓的增殖并且动员它们进入血液对于造血干/祖细胞移植非常重要。造血干/祖细胞疗法目前是肿瘤、中风、阿尔兹海默症等许多疾病的重要治疗手段。收集血液中的干细胞可以用于异体干细胞移植或者短暂保存以后用于自体干细胞移植。上述干细胞疗法均需要动员骨髓中的干细胞，使其由骨髓进入到血液中。造血干/祖细胞（HSPC）在骨髓和血液中经历滞留(retention)、动员(mobilization)和归巢(homing)三种运动。在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)作用下，HSPC将被动员激活增殖，最终由骨髓迁移到血液。这个过程已经被临床上用于收集骨髓造血干/祖细胞用于多种疾病的治疗。目前临床上，仅有G-CSF、GM-CSF和AMD3100等极少数的药物被用于动员HSPC，而其它动员药物在临床试验中多因为强烈的副作用或效果较差而失败，比如SCF可诱发血管性水肿、风疹等疾病。即使G-CSF已经成为最常用的HSPC动员药物，临床使用中也发现存在一定副作用，比如会引起骨痛、重度再生障碍性贫血和中性白细胞减少症。而且5-30%的病人在所有目前临床上使用的动员药物使用之后，仍然无法动员足够的HSPC进入血液。因此临床上急需开发新的HSPC动员药物。

白细胞衍生趋化因子(leukocytecell-derivedchemotaxin2，LECT2蛋白)是一个多功能的蛋白质，分子量约为16kDa，含三个分子内二硫键，该分子结构简单，无糖基修饰。LECT2一开始被认为是一种嗜中性粒细胞趋化因子，随着研究的深入，人们发现它还与骨骼和血管生长、肝移植损伤修复、植物毒素、非病原抗原等引起的病理和生理过程有关，如公布号为CN102159238名称为抑制病理性血管发生作用的组合物的中国专利文献，就公开了包括有效量的LECT2蛋白制备成抑制病理性血管发生作用和/或细胞增生性疾病的组合物。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供LECT2多肽在制备促进造血干/祖细胞动员药物中的应用。所述LECT2多肽通过上调骨髓中的造血干/祖细胞，将其动员到血液中，引起血液中造血干/祖细胞数目的增多，并且引起血液中造血干/祖细胞培养产生的集落形成单位(CFU-C)数量的增多。

进一步地，本发明还提供了LECT2多肽在制备促进骨髓造血干/祖细胞数量增加药物中的应用。

所述LECT2多肽包含下列氨基酸序列组成：PWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF，可以依据Ovejero等公开的“Identificationoftheleukocytecell-derivedchemotaxin2asadirecttargetgeneofbeta-cateninintheliver”(Hepatology,2004年7月、40(1),167-176)方法进行制备。所述LECT2蛋白(登录序列号NM_002302)为氨基酸全长序列，也用上述方法制备。可以在动物细胞、低等真核生物或原核生物中重组表达，如在酵母菌中表达得到重组LECT2多肽，或在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等原核生物进行表达得到重组LECT2多肽。此外，还可以采用固相合成的方法合成LECT2多肽。

本发明还提供了LECT2蛋白在制备促进造血干/祖细胞动员药物中的应用。所述LECT2蛋白通过上调骨髓中的造血干/祖细胞，将其动员到血液中，引起血液中造血干/祖细胞数目的增多，并且引起血液中造血干/祖细胞培养产生的集落形成单位(CFU-C)数量的增多。

进一步地，本发明还提供了LECT2蛋白在制备促进骨髓造血干/祖细胞数量增加药物中的应用。

LECT2蛋白、LECT2多肽制备的药物，可以是纯LECT2多肽制剂、LECT2蛋白制剂，也可以是LECT2多肽、LECT2蛋白与药学上可接受的载体组成的各种制剂，如注射剂、口服液、丸剂、片剂、胶囊等，这些药学上可接受的载体可以是：所述载体材料包括填充剂、崩解剂、润湿剂、粘合剂、泡腾剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫嗅剂、着色剂以及其他种类的固体制剂的赋形剂。

本发明的LECT2多肽的给药途径可以是口服、非肠胃吸入、直肠、阴道、皮内、经皮或局部给予；本发明的LECT2蛋白、LECT2多肽可一次给予或24小时内多次给予或连续给予，剂量可以为每天纯LECT2多肽0.02-2μg/g体重。

本发明中的LECT2多肽、LECT2蛋白含有以下氨基酸序列：PWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF。

由于某些氨基酸成份的改变并不影响多肽或者蛋白的活性，LECT2蛋白、LECT2多肽的修饰或改造产物如果存在与上述序列存在60%以上的氨基酸序列相似性可被视同LECT2多肽、视同LECT2蛋白。

经试验检验，LECT2多肽、LECT2蛋白连续皮下注射3天可引起骨髓造血干/祖细胞数目显著上调，LECT2、LECT2蛋白多肽连续注射达到5天，可引起血液中的CFU-C数目显著增高，同时采用流式细胞术发现血液中实际的造血干/祖细胞数目显著上调，LECT2多肽、LECT2蛋白在增加和动员骨髓造血干/祖细胞中的应用，LECT2多肽、LECT2蛋白在促进造血干/祖细胞动员药物中、在促进骨髓造血干/祖细胞数量增加中具有极其显著的效果。

附图说明

图1为LECT2多肽增加和动员骨髓造血干/祖细胞的示意图；

图2为LECT2多肽和LECT2蛋白增加血液中CFU-C数目的直方图，*P<0.05vs0h组；A：LECT2多肽处理后血液中CFU-C的数目，B：LECT2蛋白处理后血液中CFU-C的数目。

图3为采用流式细胞术检测造血干/祖细胞的方法的散点图，图中Lineage^-Sca-1⁺c-Kit⁺细胞(LSK)为造血干祖细胞(HSPC)；

图4为LECT2多肽和LECT2蛋白引起血液中造血干/祖细胞数量增加的直方图；其中，A：LECT2多肽处理后每ml血液的白细胞数，B：LECT2多肽处理后每ml血液的LSK，C：LECT2蛋白处理后每ml血液的LSK。*P<0.05vs0h组。

图5为LECT2多肽引起骨髓中造血干/祖细胞数量增加的直方图；其中，A：LECT2多肽处理后每根股骨的白细胞数。B：LECT2多肽处理后每百万骨髓细胞的LSK。C：LECT2蛋白处理后每百万骨髓细胞的LSK。*P<0.05vs0h组。

图6G-CSF不介导LECT2多肽对血液造血干/祖细胞的增加效果。*P<0.05vsPBS组，#P<0.05vsG-CSF组。

图7抗肿瘤药或辐射后LECT2多肽和G-CSF注射对血液造血干/祖细胞数量的影响。其中，A，Doxorubicin使用后LECT2多肽比G-CSF具有更强的促血液造血干/祖细胞的增加效果。B，小鼠辐射后(6Gy)LECT2多肽比G-CSF具有更强的促血液造血干/祖细胞的增加效果。*P<0.05vsPBS组，#P<0.05vsG-CSF组。

图8LECT2多肽和G-CSF注射对小鼠骨痛的影响。A，注射后小鼠右后足行走评分的变化。B，注射后小鼠右后足机械缩足反射阈值的变化。*P<0.05。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1，LECT2多肽的分析

根据对人类LECT2氨基酸序列的分析，找到LECT2的核心功能区。序列组成为：

PWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF。

经过分析该序列的分子量为5.51kDa，等电点为8.21。该序列在6-41和17-22分别拥有二硫键连接。

实施例2，LECT2多肽、LECT2蛋白影响集落形成

证明LECT2多肽引起造血干/祖细胞数量增加和动员的方法如图1所示。采用LECT2多肽溶于PBS(200μg/kg/d)，每天一次，皮下注射小鼠，心脏取血收集注射以后0h，24h，3d和5d血液，进行CFU-C分析。LECT2蛋白溶于PBS(200μg/kg/d)，皮下注射小鼠，每天一次，5d后收集血液，进行CFU-C分析。全血1500rpm离心5min去除上清，用PBS重悬细胞，Ficoll密度梯度离心，收集白膜层。用胎盼蓝染色血液细胞，血球计数仪算出各个样品中的外周血白膜层细胞的数量。

将血液白膜层细胞用培养基重悬(MDM,2%FBS)。每个35mm细胞培养皿加入2×10⁵外周血白膜层细胞(溶于0.3ml培养基)。0.3ml细胞加入到3ml的甲基纤维素培养基(MethoCult,StemCell,美国)。每个35mm培养皿铺1.1ml细胞和培养基混合物。每2个35mm培养皿置于一个100mm的大培养皿中，另加一个装有3ml双蒸水的35mm培养皿，保持湿度。

细胞于37oC，5%CO₂环境培养14天。然后显微镜下检测CFU-C生成的数量。结果如图2所示，发现LECT2多肽注射24h不增加CFU-C数目。而经过LECT2多肽注射3d和5d，血液的CFU-C数目显著性上调。在第5天，LECT2多肽组的CFU-C数目是0h组的8.8倍。LECT2蛋白注射5d，可明显提高血液中CFU-C的数目，效果与LECT2多肽相似。

实施例3，流式细胞术分析血液和骨髓造血干/祖细胞数。

采用流式细胞术分析造血干/祖细胞的方法参考Golan等已发表的论文(S1PpromotesmurineprogenitorcellegressandmobilizationviaS1P1-mediatedROSsignalingandSDF-1release.Blood,2012,119:2478-2488)。

小鼠采用干冰麻醉，心脏取血，取股骨和胫骨用于冲洗获得骨髓细胞。Turk计数骨髓白细胞。取全部的骨髓细胞，1500rpm5min取上清和骨髓细胞。取10⁷的骨髓细胞备用。在5ml流式管中加入6μl肝素钠，44μlPBS，将血液加入到流式管内，混匀一次。1500rpm5min离心，取上清，就是血浆。先用2mlPBS悬浮。Ficoll离心，直接把1mlFicoll加到底部。取白膜层+一半的Ficoll层。取全部血液白细胞备用。上述骨髓细胞和血液细胞均进行荧光抗体标记。标记6种白细胞标记物(lin)、Sca-1和c-Kit。Lin标记FITC荧光(每种抗体加1μl)：CD4,NK,CD8,B220,CD11b,Gr-1，Sca-1标记PE荧光(加1μl)、c-kit标记APC荧光(加2μl)。上述抗体均来自于美国Biolegend公司。抗体标记细胞后轻拍细胞混匀，置于4oC作用30min。1mlPBS1500rpm离心5min，用于流式细胞术检测。

采用Kaluza软件分析流式数据。如图3所示，Lin阴性，Sca-1和c-Kit阳性的细胞为造血干/祖细胞。

实施例4，LECT2多肽、LECT2蛋白增加血液中造血干/祖细胞的数目。

如图4A所示，LECT2多肽注射24h或3d后（200μg/kg/d），并没有上调血液中白细胞的数目，而在LECT2多肽注射5d后，每ml血液的白细胞数显著性上调。如图4B所示，LECT2多肽注射24h和3d不影响每ml血液的造血干/祖细胞数，而在LECT2多肽处理5d后，造血干/祖细胞数显著性上调9.8倍。如图4C所示，LECT2蛋白注射5d后（200μg/kg/d），可显著提高血液中LSK细胞的数目。该结果说明LECT2多肽的注射可用于动员骨髓中的造血干/祖细胞进入血液，LECT2多肽可用于做为临床上的骨髓造血干/祖细胞动员试剂。

实施例5，LECT2多肽增加骨髓中造血干/祖细胞的数目。

如图5A所示，LECT2多肽注射24h、3d或5d后（200μg/kg/d），并没有上调骨髓中白细胞的数目。如图5B所示，LECT2多肽注射24h不影响每百万骨髓的造血干/祖细胞数，而在LECT2多肽处理3d后，造血干/祖细胞数显著性上调2.1倍，同时LECT2多肽处理5d后，造血干/祖细胞数并不受影响。如图5C所示，LECT2蛋白注射3d后（200μg/kg/d），可显著提高骨髓中LSK细胞的数目。与血液的造血干/祖细胞数情况比较可以发现，骨髓中的造血干/祖细胞在3d上调，而在5d下调，是因为造血干/祖细胞在5d由骨髓进入到血液中。

实验例6，LECT2多肽不通过G-CSF引起造血干/祖细胞动员。

进行高剂量化疗和放疗的病人需要进行造血干/祖细胞移植，用于重建骨髓造血干/祖细胞库，增强免疫能力，提高后续的存活率。由于造血干/祖细胞在血液中的含量极少，主要定居在骨髓中，需要使用药物将其从骨髓动员到血液中便于收集用于造血干/祖细胞移植，该过程被称为动员。

G-CSF是目前常用的造血干/祖细胞动员药物，LECT2多肽并不通过G-CSF来增加血液造血干/祖细胞数量。如图6所示，在G-CSF抗体腹腔注射(100μg/kg体重剂量,R&D公司)以后同时注射LECT2多肽（200μg/kg/d），血液中造血干/祖细胞的数量与注射同源抗体对照(IsoIgG)组之间并无显著差异。这个结果说明LECT2并不通过G-CSF来促进造血干/祖细胞的动员。也就是说LECT2多肽并不是通过上调G-CSF的表达来引起造血干/祖细胞的动员。LECT2多肽引起造血干/祖细胞动员的作用机制应该与G-CSF有区别。

实验例7，LECT2和G-CSF在抗肿瘤药和辐射处理后对血液造血干/祖细胞数量的影响。

研究在抗肿瘤药物Doxorubicin使用以后，LECT2多肽和G-CSF对血液造血干/祖细胞数量的影响。Doxorubicin采用9mg/kg体重的剂量血液注射小鼠，每两周注射一次，总共注射5次，于最后一次注射后2d处死小鼠，对血液造血干祖细胞数量进行分析。LECT2多肽注射可显著增加血液中造血干/祖细胞的数量，数量为G-CSF的5.20倍(图7A)。采用6Gy辐射小鼠，30d以后注射PBS、G-CSF或者LECT2多肽，持续5d检测血液造血干/祖细胞的动员。研究发现LECT2多肽注射可显著增加血液中造血干/祖细胞的数量，数量为G-CSF的4.84倍(图7B)。这两个结果说明抗肿瘤药物处理和辐射处理后，LECT2多肽比G-CSF有更好的动员效果。

实验例8，LECT2多肽处理不存在骨痛的副作用。

G-CSF作为造血干/祖细胞动员药物在临床上最普遍的副作用是骨痛。采用小鼠机械缩足阈值测量和行走后足使用评分两种方法，研究LECT2多肽和G-CSF注射对疼痛的影响，具体方法参考已发表论文(EuropeanJournalofPharmacology,2012,688:27-34)。小鼠行走后足使用评分研究发现LECT2多肽(200μg/kg/d)注射5天，并不引起明显的行走后足评分下降，而G-CSF(200μg/kg/d)注射第5d，引起小鼠行走后足评分明显下降(图8A)。机械缩足阈值测量研究发现，LECT2多肽注射并不引起机械缩足阈值下降，而G-CSF注射后4d和5d，引起小鼠机械缩足阈值明显下降(图8B)。这两个研究说明LECT2多肽处理不引起小鼠骨痛，而G-CSF处理显著引起小鼠骨痛。

<110>宁波大学

<120>LECT2多肽、LECT2蛋白在制备动员造血干/祖细胞药物中的应用

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>51

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

ProTrpAlaAsnIleCysAlaGlyLysSerSerAsnGluIleArgThr

151015

CysAspArgHisGlyCysGlyGlnTyrSerAlaGlnArgSerGlnArg

202530

ProHisGlnGlyValAspIleLeuCysSerAlaGlySerThrValTyr

354045

AlaProPhe

50