一种慢羽公鸡基因型的检测方法

摘要

本发明涉及基因型检测领域，特别涉及一种慢羽公鸡基因型的检测方法，以纯合慢羽公鸡和杂合慢羽公鸡中含有的特定片段重复数的不同来判断是否为纯合慢羽公鸡；特定片段可通过第一对引物进行PCR扩增；第一对引物的上下游引物核酸序列如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示。本发明通过设计引物扩增出只有慢羽鸡能扩增出来的特定片段，快羽鸡扩增不出该段序列。因为公鸡基因型为ZZ，而位于Z染色体上的慢羽K基因有部分片段重复，所以在DNA初始浓度一致的情况下，理论上通过一定循环数的PCR扩增，纯合慢羽公鸡的该片段的DNA含量是杂合慢羽鸡该片段DNA含量的2倍，由此鉴定慢羽公鸡的基因型。

说明书

技术领域

本发明涉及基因型检测领域，具体而言，涉及一种慢羽公鸡基 因型的检测方法。

背景技术

羽速基因位于鸡的Z染色体上，为伴性基因，控制羽毛生长的 速度。快慢羽是一对等位基因(K-k)，慢羽(K)对快羽(k)为完 全显性，公鸡染色体型为ZZ，故慢羽公鸡分纯合和杂合两种。快慢 羽的区分主要由初生雏鸡翅膀上的主翼羽和覆主翼羽的长短来确 定，从而可通过出壳雏鸡的羽型区分性别。但是，纯合慢羽基因型 和杂合慢羽基因型的公鸡需要进一步将未知基因型的慢羽公鸡与慢 羽母鸡杂交才得以区分，杂交后纯合慢羽公鸡的后代全部为慢羽， 而杂合慢羽公鸡的后代会出现快羽，且该快羽个体为母鸡。

快慢羽自别雌雄是近代养鸡生产中的重要技术措施，已在国内 外养鸡业中广泛应用。但利用表型鉴定鸡的快慢羽在应用于雏鸡自 别雌雄时除鉴别准确率因鉴别误差不能达到100％外，2010年第32 卷第4期ChinaPoultry指出最主要的问题是能进行准确鉴定的时间 有一定的限制，一般不能超过出壳后24h。因此，在培育自别雌雄 配套系时一般需从雏鸡开始，需要2～3个世代才能形成后代达到一 定自别雌雄准确率(一般要求99％以上)的配套系。

为了提高育种效率和鉴定准确率，需要新的检测手段。有鉴于 此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种慢羽公鸡基因型的检测方法，设计 了两对引物，对特定核酸片段进行扩增，并对所扩增出的两个目的 片段的DNA进行定量。根据该两个目的片段的DNA含量比值判断 慢羽公鸡的基因型，能快速有效地鉴别出慢羽公鸡的基因型，准确 率高，达到100％；并且极大程度缩短了建立鸡纯慢羽系的时间。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种慢羽公鸡基因型的检测方法，以纯合慢羽公鸡和杂合慢羽 公鸡中含有的特定片段重复数的不同来判断是否为纯合慢羽公鸡；

所述特定片段可通过第一对引物进行PCR扩增；

所述第一对引物的上下游引物核酸序列如SEQIDNo.1和SEQ IDNo.2所示。

Elferink等发现控制羽速的慢羽K等位基因是由串联重复序列 构成，其总长度为176,324bp，由两个基因部分重复所引起：PRLR 基因和编码精子鞭毛蛋白的SPEF2基因，包含了PRLR基因的外显 子1-11和558bp的外显子12以及SPEF2基因的外显子1-外显子5。 通过设计引物，在慢羽鸡中扩增出一段长78bp的断点连接序列，快 羽鸡扩增不出该段序列，因此，该引物可作为区分快慢羽的一种分 子检测手段。在此基础上，通过设计引物扩增出一段包含78bp的长 度为1305bp的断点连接序列，只有慢羽鸡能扩增出来，快羽鸡扩增 不出该段序列。因为公鸡基因型为ZZ，而位于Z染色体上的慢羽K 基因有部分片段重复，所以在DNA初始浓度一致的情况下，理论 上通过一定循环数的PCR扩增，纯合慢羽公鸡的该片段的DNA含 量是杂合慢羽鸡该片段DNA含量的2倍，由此鉴定慢羽公鸡的基 因型。

特定片段重复数的不同可以通过待检测样本与已知纯合慢羽公 鸡或已知杂合慢羽公鸡进行比较来判断；也可以与其自身的内参基 因进行比较来判断。

优选地，所述特定片段重复数的不同通过内参基因进行比较来 判断；

所述内参基因可通过第二对引物进行PCR扩增，所述第二对引 物的上下游引物核酸序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。

该内参基因GHR位于Z染色体上，与PRLR基因相邻并位于 其下游，因为该基因扩增效率较稳定，故通过GHR内参基因片段 的扩增可以消除待检测样本的DNA初始浓度误差；并且，通过将 第一对引物扩增产物的亮度与第二对引物扩增产物的亮度进行对 比，可鉴定慢羽公鸡的基因型。

其中，第一对引物进行PCR扩增的目的基因片段长度1305bp； 第二对引物进行PCR扩增的目的基因片段长度857bp。

将所述特定片段重复数的不同通过与内参基因进行比较的同 时，再与已知基因型的纯合慢羽或杂合慢羽公鸡的PCR扩增结果进 行比较，达到更好的准确度。

进一步地，所述特定片段重复数的不同通过与内参基因进行比 较采用以下步骤进行：

具有相同基因组DNA含量的待检测样本分别采用第一对引物 和第二对引物进行半定量PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增 产物；

分别测定第一扩增产物的目的基因片段的DNA量和第二扩增 产物的目的基因片段的DNA量，并将两者进行比较，判断待检测 样本慢羽公鸡的基因型。

进一步地，所述比较两者目的基因片段的量，判断待检测样本 慢羽公鸡的基因型具体为：

将所述测得第二扩增产物的目的基因片段的DNA量与所述测 得第一扩增产物的目的基因片段的DNA量相除，得到的比值判断 待检测样本慢羽公鸡的基因型；

所述比值小于1.35，则待检测样本为纯合慢羽公鸡；

所述比值大于1.85，则待检测样本为杂合慢羽公鸡；

优选地，所述比值为1.05-1.31，则待检测样本为纯合慢羽公鸡；

所述比值为1.87-2.51，则待检测样本为杂合慢羽公鸡。

由于不同品种间的差异，PCR扩增时两对引物的扩增效率存在 差异，判断标准在一个范围内有波动，但是不影响对结果的判断。

基因片段的DNA量采用灰度值分析方法测定，以此鉴定慢羽 公鸡的基因型，因为电泳图可直观观察到纯合和杂合慢羽公鸡之间 的不同，故可结合电泳图判断。

为了提高鉴定的准确度和具有很好的灵敏度，优选地，所述待 检测样本中的基因组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度为 5-15ng/μl，所述半定量PCR扩增的循环数为20-25。如：待检测样 本中的基因组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度为5ng/μl，半 定量PCR扩增的循环数为25；待检测样本中的基因组DNA在半定 量PCR扩增体系中的浓度为15ng/μl，半定量PCR扩增的循环数为 20；待检测样本中的基因组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度 为10ng/μl，半定量PCR扩增的循环数为23等等。

为了进一步缩小由于待检测样本中的模板DNA含量不同而造 成的误差，进一步地，所述第一对引物和所述第二对引物进行半定 量PCR扩增在同一PCR扩增体系中进行。

经多次试验，优选地，所述半定量PCR扩增的反应体系中含有： 第一对引物的上下游引物各0.5μl，第二对引物的上下游引物各 0.5μl，2×ESMix5μl，DNA模板100ng±5ng，ddH₂O补平至10μl；

其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下 游引物的浓度均为10μM。

半定量PCR扩增的反应体系中的各组分由于取样时存在误差， 误差范围为5％以内，均在本发明的保护范围内。

该体系中的各物质的含量根据体系的扩大或者缩小进行相应的 倍增或倍减即可。

本发明涉及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组 分之间比例关系的限定，而不是对各自用量绝对值的限定。

进一步地，所述半定量PCR的反应程序为：

半定量PCR的反应程序根据一些PCR试剂的要求会有一些差 别，对于本领域技术人员能够预期效果的范围均在本发明的保护范 围内。

优选地，所述第一扩增产物的目的基因含量和所述第二扩增产 物的目的基因含量通过以下方法检测：

取等量(通常2.5μl即可)扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分离 后，利用ImageJ软件中的灰度值分析方法分析琼脂糖凝胶下的电泳 条带的DNA含量。

优选地，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为1.0％-1.2％，电泳电压 采用130-150V，电泳时间为20-25分钟。

进一步地，所述待检测样本的基因组DNA的A260/280在 1.8-1.9之间，A260/230在1.6-2.4之间。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，根据不 同基因型的慢羽公鸡含有的特定片段重复数不同建立起来的慢 羽公鸡基因型的鉴定方法，鉴定的慢羽公鸡基因型准确率为 100％。

(2)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，只需要 用两对引物的一个PCR扩增体系即可鉴定鸡的快慢羽类型，快 速，方便，成本低。

(3)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，可成功 鉴别慢羽公鸡中的杂合个体，减小因为慢羽公鸡杂合导致的鉴 别效率低的问题，提高了公鸡的使用价值，并且该方法只需一 个PCR反应即可完成，成本低，效率高，节约时间。

(4)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，可极大 程度缩短根据世代淘汰杂合慢羽公鸡选出纯合慢羽个体建立纯 慢羽系的时间，节省了培育成本。

(5)本发明还对PCR反应体系、循环数、模板DNA的含 量等等做出了限制，以增加鉴定的灵敏性和准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以 下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2中部分太行慢羽公鸡的基因型鉴定电泳 图；

图2为本发明实施例3中部分坝上长尾鸡慢羽公鸡的基因型鉴 定电泳图；

图3为本发明实施例4中部分白来航纯合慢羽公鸡的基因型鉴 定电泳图；

图4为本发明实施例4中部分海兰灰杂合慢羽公鸡的基因型鉴 定电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

本发明以提取的鸡血DNA作为PCR扩增的模板，鸡血DNA 的提取可采用常规的提取基因组的方法，也可以采用市售基因组提 取试剂盒进行提取。

本发明优选采用以下两种方式提取鸡血DNA，具体步骤如下：

1、试剂盒提取鸡血凝块DNA步骤：

(1)称取凝固血块0.1-0.2g，置于离心管中，并加入550μlBuffer GTL，电动匀浆器匀浆，为充分粉碎血块，可加入小磁珠，进行机 械破碎。

(2)加入20μlProteinase(20mg/ml)，上下颠倒使样品充分混 匀；在摇床里56℃过夜孵育至所有颗粒完全溶解。

(3)加入200μlBufferPP，涡旋震荡20s，冰上孵育3-5min； 12,000rpm(约为13,400×g)离心3min，将上清移至新的离心管中； 若上清不明显，可适当增加离心时间。

(4)加入1/2体积无水乙醇，涡旋震荡15s；短暂离心，使管 壁和盖子上液体集中到管底。

(5)将步骤4中所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube)中的吸附柱(SpinColumnDM)中，若一次不能加完溶液， 可分多次转入；12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸 附柱重新放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μlBufferGW1，12,000rpm离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入500μlBufferGW2，12,000rpm离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)12,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱置 于室温数分钟以彻底晾干。

(9)将吸附柱置于一新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入 100-200μlBufferGE，室温放置2-5min，12,000rpm离心1min，收集 DNA溶液，-20℃保存DNA。

提取鸡血凝块DNA试剂盒的生产厂家为康为世纪生物科技有 限公司，商品名为ClotBloodDNAKit，产品编号为CW0545，规格 为50次。

2、试剂盒提取抗凝鸡血DNA步骤：

(1)取20-25μl抗凝鸡血于1.5ml离心管中，并加入500μlBB3 溶液，20mg/μl蛋白酶K20μl，涡旋15s充分混匀样品，56℃水浴 2-3h。

(2)短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12000×g离心 1min，弃流出液。

(3)加入500μl溶液CB3，12000×g离心30s，弃流出液。

(4)加入500μl溶液WB3，12000×g离心30s，弃流出液。

(5)重复步骤4一次。

(6)12000×g离心2min，彻底去除残留的WB3。

(7)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入 50-200μl预热EB(65℃)，室温静置2-5min，12000×g离心1min， 洗脱DNA，4℃保存(长时间存放-20℃保存)。

以上两种方法提取得到的鸡血DNA浓度为200-300ng/μl，纯度： A260/280在1.8-1.9之间，A260/230在1.6-2.4之间。

提取抗凝鸡血DNA试剂盒的生产厂家为北京全式金生物技术 有限公司，商品名为EasyPureBloodGenomicDNAKit，产品编号 为EE121-12，规格为200rxns。

经过多次试验摸索，PCR扩增所需DNA的浓度最好在100± 5ng/μl，因此，提取得到的鸡血DNA浓度经检测后，可相应的进行 稀释，确保每个样本的DNA初始浓度为100±5ng/μl，以进行下一 步的试验。

实施例2

按照实施例1中的方法提取30份未知基因型的慢羽太行公鸡血 DNA作为PCR扩增模板；

以以下PCR扩增的反应体系进行半定量PCR反应：第一对引 物的上下游引物各0.5μl，第二对引物的上下游引物各0.5μl，2×ES Mix5μl，DNA模板100ng±5ng，ddH₂O补平至10μl；

其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下 游引物的浓度均为10μM。

其中，2×ESMix购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限公 司，商品名为2×ESTaqMastermix，产品编号为CW0690C，规格 为10×1ml。

半定量PCR的反应程序为：

取2.5μlPCR扩增产物采用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用150v，电泳时间20分钟。

部分结果如图1所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像 Type设置为8bit，并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的 可信度。对图1中条带的灰度值进行比较，1、2、4、6、7、12、14-16、 18-20、23、24泳道中，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰 度值，这些样本中的两条带的比值在1.21±0.02之间，为纯合慢羽； 3、5、8、9、10、11、13、17、21、22泳道中，857bp条带的灰度 值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的比值在2.03 ±0.04之间，为杂合慢羽。其中，图1中的Marker为DM2000plus， 从下往上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp， 3000bp，5000bp。

同样地，PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用130v均可，电泳时间25分钟，得到的灰度比值与上面一致。

实施例3

按照实施例1中的方法提取300份坝上长尾鸡慢羽公鸡(已进 行表型鉴定)的血样DNA作为PCR扩增模板；

以以下PCR扩增的反应体系进行半定量PCR反应：第一对引 物的上下游引物各0.5μl，第二对引物的上下游引物各0.5μl，2×ES Mix5μl，DNA模板100ng±5ng，ddH₂O补平至10μl；

其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下 游引物的浓度均为10μM。

其中，2×ESMix是购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限 公司的商品名为2×ESTaqMastermix中的试剂。2×ESTaq Mastermix的产品编号为CW0690C，规格为10×1ml。

半定量PCR的反应程序为：

取2.5μlPCR扩增产物采用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用150v，电泳时间20分钟。

部分结果如图2所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像 Type设置为8bit，并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的 可信度。对图2中条带的灰度值进行比较，3、16、19泳道中，857bp 条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的比 值在1.27±0.02之间，为纯合慢羽；1、2、4-10、12、14、17、18、 20、22-24泳道中，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值， 这些样本中的两条带的比值在2.28±0.03之间，为杂合慢羽；11、15、 21、25未扩增出1305bp片段，为快羽。其中，图2中的Marker为 DM2000plus，从下往上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp， 2000bp，3000bp，5000bp。

同样地，PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用130v，电泳时间25分钟，得到的灰度比值与上面一致。

实施例4

按照实施例1中的方法提取30份表型为白来航纯合慢羽公鸡血 样DNA作为PCR扩增模板；

以以下PCR扩增的反应体系进行半定量PCR反应：第一对引 物的上下游引物各0.5μl，第二对引物的上下游引物各0.5μl，2×ES Mix5μl，DNA模板100ng±5ng，ddH₂O补平至10μl；

其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下 游引物的浓度均为10μM。

其中，2×ESMix是购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限 公司的商品名为2×ESTaqMastermix中的试剂。2×ESTaq Mastermix的产品编号为CW0690C，规格为10×1ml。

半定量PCR的反应程序为：

取2.5ulPCR扩增产物采用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用150v均可，电泳时间20分钟。

部分结果如图3所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像 Type设置为8bit，并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的 可信度。对图3中条带的灰度值进行比较，1-23泳道中，857bp条 带的灰度值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的比值 在1.08±0.02之间，为纯合慢羽。其中，图3中的Marker为 DM2000plus，从下往上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp， 2000bp，3000bp，5000bp。

同样地，PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用130v均可，电泳时间25分钟，得到的灰度比值与上面一致。

实施例5

按照实施例1中的方法提取50份公鸡血样DNA作为PCR扩 增模板，其中，公鸡包括已知的海兰灰杂合慢羽和快羽；

以以下PCR扩增的反应体系进行半定量PCR反应：第一对引 物的上下游引物各0.5μl，第二对引物的上下游引物各0.5μl，2×ES Mix5μl，DNA模板100ng±5ng，ddH₂O补平至10μl；

其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下 游引物的浓度均为10μM。

其中，2×ESMix购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限公 司，商品名为2×ESTaqMastermix。2×ESTaqMastermix的产品编 号为CW0690C，规格为10×1ml。

半定量PCR的反应程序为：

取2.5μlPCR扩增产物采用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用150v，电泳时间20分钟。

部分结果如图4所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像 Type设置为8bit，并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的 可信度。对图4中条带的灰度值进行比较，1-3、5-15泳道中，857bp 条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的比 值在1.91±0.04之间，为杂合慢羽公鸡；4泳道未扩增出1305bp， 为快羽公鸡。其中，图4中的Marker为DM2000plus，从下往上分 别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。

检测结果与实际完全吻合，由此检验该鉴定方法的准确性。

同样地，PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶进行检测，电压 采用130v，电泳时间25分钟，得到的灰度比值与上面一致。

本发明共测定了86只纯合型慢羽公鸡，857bp条带的灰度值除 以1305bp条带的灰度值的比值的均值为1.18，偏差为±0.13；209 只杂合型慢羽公鸡，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值 的比值的均值为2.19，偏差为±0.32。

此外，本发明采用20μlPCR扩增的反应体系、25μlPCR扩增 的反应体系、30μlPCR扩增的反应体系、50μlPCR扩增的反应体系 等等进行了验证，结果与上述10μlPCR扩增的反应体系结果一致；

本发明改变PCR扩增的反应体系中的模板DNA的含量，如 PCR扩增体系中的模板DNA浓度为5ng/μl、PCR扩增体系中的模 板DNA浓度为8ng/μl、PCR扩增体系中的模板DNA浓度为15ng/μl 等等，结果与PCR扩增体系中的模板DNA浓度为10ng/μl结果一 致；

根据模板DNA浓度，本发明改变PCR扩增中的循环数，如循 环数为20、循环数为22、循环数为24、循环数为25等等，其结果 与循环数为23结果一致；

另外，使用本发明提供的慢羽公鸡基因型的检测方法对不同品 种的1000只待测样本进行检测，准确率为100％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到， 在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和 修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的 所有这些变化和修改。