ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应用于Hg2+检测

摘要

本发明公开了ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应用于Hg2+检测，当Hg2+存在时，H-DNA和A-DNA中的T-rich部分形成T-Hg2+-T金属碱基对，H-DNA与A-DNA杂交，引发链置换反应，形成Hg2+介导的含有悬垂的保护部分和DNAzyme部分的双链结构(称为Hg-Complex)。在ExoIII的作用下，Hg2+和A-DNA被释放出来，与另一个H-DNA杂交，进行循环，得到大量的DNAzyme序列。得到的DNAzyme序列能够循环切割分子信标，产生放大的信号。通过两种循环的有效结合，这一策略能够灵敏的检测水溶液中的Hg2+，并且实现了高选择性。同时，此方法能够成功地用于污水中Hg2+的检测，为环境水样中Hg2+的定量检测提供了潜在的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及环境污染物检测领域，具体涉及基于ExoIII(核酸外切酶III)辅助的目标物循环和DNAzyme(脱氧核酶)切割循环构建的双重放大荧光反应用于检测Hg²⁺，尤其涉及检测水溶液中的Hg²⁺的检测。

背景技术

Hg²⁺作为一种最常见和稳定形式的汞，由于其即使在较低浓度下具有高毒性的性质，是一种严重的环境污染物。因为其具有生物累积性，Hg²⁺的摄取危害人类健康。当其在人体内过量存在时，会损害人类的神经系统、肾脏和其他器官。因此，迫切需要发展一种可靠且灵敏的方法用于Hg²⁺的检测。传统的检测方法，包括原子吸收光谱和电感耦合等离子体质谱已经发展起来用于Hg²⁺的检测。然而，这些方法需要复杂的仪器和样品预处理，限制了其在实际和日常检测中的应用。在荧光、电化学和比色技术的基础上，一些简便且经济的方法被建立起来。其中，荧光法以其良好的准确性和高灵敏度受到广泛关注。

Ono及其合作者报导，T-T错配碱基能够选择性的结合Hg²⁺，形成T-Hg²⁺-T金属碱基对，由于N-Hg²⁺-N键的形成，此金属碱基对比天然的沃森-克里克碱基对更稳定。这一发现为Hg²⁺检测实验提供了高选择性和有效的识别方式。Yang课题组展示了金属离子诱导的单、双链DNA的构型转变，借助金纳米颗粒实现对Hg²⁺的检测。Lou课题组构建了基于芯片的传感器用于检测Hg²⁺。然而，多数这些方法的检测限大于1.0×10^-8mol·L^-1，不能满足美国环境保护署的检测要求(1.0×10^-8mol·L^-1,2011)。

一些基于酶的灵敏的方法被建立起来，这些酶包括切刻酶，外切酶和聚合酶。虽然灵敏度有所提高，实验结果并不完全令人满意，这是由其一步放大机制造成的。Zhang和他的合作者将链置换扩增和短的淬灭-荧光探针结合起来发展了一种Hg²⁺检测方法。Willner课题组提出了一种Hg²⁺诱导的聚合/切刻机器，产生DNAzyme用于循环切割底物。虽然实现了两步放大，此过程需要引物来产生大量的DNA重复序列和特殊的切刻酶识别位点来进行切刻反应，这就增加了探针设计的复杂性。因此，仍然需要构建一种新的机制来简化探针设计并且获得良好的扩增能力。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，发明人提出了一种新型双重放大反应用于灵敏和选择性的检测Hg²⁺。所述的双重放大方法是基于ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环，通过T-rich部分T-Hg²⁺-T碱基对的形成，A-DNA靠近H-DNA，打开封闭在发卡结构中的DNAzyme，形成Hg-Complex。在ExoIII的作用下，Hg²⁺和A-DNA被释放出来，引发与另一个H-DNA的杂交反应，产生大量的DNAzyme。得到的DNAzyme能够对分子信标底物进行循环切割。因此，这种新型双重放大方法被建立起来并且能够灵敏和选择性的检测水溶液中的Hg²⁺甚至是污水样品中的Hg²⁺。此外，这一方法克服了设计上的要求并且较好的实现了双重放大效果。

本发明涉及以下技术方案：

一种双重放大反应方法，其特征是：Hg²⁺存在时，其能够与颈环结构探针和单链探针中T-T错配碱基相互作用，形成Hg²⁺介导的金属碱基对，加入ExoIII后释放出Hg²⁺、DNAzyme和单链探针，自由的Hg²⁺和单链探针引发与颈环结构探针之间的杂交反应，产生大量的DNAzyme序列，完成信号一级放大；DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号，并重新释放DNAzyme，进行信号的二级放大；当Hg²⁺不存在时，颈环结构的探针与单链探针的T-rich部分存在T-T碱基错配，不产生自由的DNAzyme序列来产生信号。

一种双重放大反应方法，包括探针H-DNA(发卡DNA)和A-DNA(辅助DNA)，H-DNA包含悬垂在3’末端的T-rich部分和封闭在发卡结构中的DNAzyme部分，T-rich部分含有用于选择性识别Hg²⁺的T碱基和辅助Hg-Complex形成的G/C碱基，DNAzyme被封闭在发卡的颈环结构中，用来进行随后的DNAzyme切割循环。A-DNA是一条单链结构的DNA，自5’到3’依次为保护部分、互补部分和T-rich部分，A-DNA中T-rich部分与H-DNA中的类似，两者共同作用完成对Hg²⁺的特异性结合和H-DNA和A-DNA双链的形成，互补部分和保护部分引发链置换反应、打开封闭有DNAzyme的发卡结构并进一步辅助ExoIII介导的循环。

当Hg²⁺存在时，其能够与H-DNA和A-DNA中T-T错配碱基相互作用，形成Hg²⁺介导的金属碱基对，T-Hg²⁺-T，目标物的识别将H-DNA与A-DNA结合起来，引发它们之间的链置换反应，获得Hg²⁺介导的带有悬垂的保护部分和DNAzyme部分的双链结构(称为Hg-Complex)，在ExoIII的作用下，催化Hg-Complex双链部分由3’平末端的核苷酸逐步水解，最终，释放出Hg²⁺和A-DNA，自由的Hg²⁺和A-DNA能够引发与另一个H-DNA之间的杂交反应，产生大量的DNAzyme序列，产生的DNAzyme序列能够与加入的MB杂交，在辅助因子Zn²⁺存在下，重复地催化MB的断裂。因此，实现了基于ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的新型双重放大策略，两种探针，H-DNA和A-DNA被合理的设计用来获得最佳的结果。如图1所示。

所述探针H-DNA和A-DNA的T-rich部分的G/C碱基个数为3、4、5、6、7或8个，优选6个。

优选：H-DNA3(SEQIDNO:1)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCG与A-DNA3(SEQIDNO:2)：CGTTTCCATCTCTTCAAAAAG；

H-DNA4(SEQIDNO:3)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCGG与A-DNA4(SEQIDNO:4)：CCGTTTCCATCTCTTCAAAAAG；

H-DNA5(SEQIDNO:5)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCGGG与A-DNA5(SEQIDNO:6)：CCCGTTTCCATCTCTTCAAAAAG；

更优选：H-DNA6(SEQIDNO:7)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCGGGG与A-DNA6(SEQIDNO:8)：CCCCGTTTCCATCTCTTCAAAAAG；

H-DNA7(SEQIDNO:9)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCGGGGG与A-DNA7(SEQIDNO:10)：CCCCCGTTTCCATCTCTTCAAAAAG；

或H-DNA8(SEQIDNO:11)：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAATGAAGAGATGGTTTCGGGGGG与A-DNA8(SEQIDNO:12)：CCCCCCGTTTCCATCTCTTCAAAAAG。

优选分子信标为SEQIDNO:13：FAM-CCACCACACTGAAATTGACCCACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCGGTGGTGG-Dacyl，rA为核糖核酸。

DNAzyme序列：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAA。

H-DNA的互补序列：TGAAGAGATG。

A-DNA的互补序列：CATCTCTTCA。

H-DNA的T-rich序列：GTTTCG。

A-DNA的T-rich序列：CGTTTC。

A-DNA的保护序列：AAAAG。

H-DNA的发卡结构的颈部序列：CATCTCTTC；GAAGAGATG。

MB中发卡结构的颈部序列：CCACCAC；GTGGTGG。

本反应方法的关键点在于H-DNA与A-DNA之间双链结构的形成，此双链结构包括Hg²⁺介导的金属碱基对和邻近的沃森-克里克碱基对。因此，特异性的形成H-DNA与A-DNA之间的T-Hg²⁺-T碱基对与邻近的碱基有关。发明人设计了六种T-rich部分具有不同G/C碱基数量的DNA探针。如图2所示，随着G/C碱基个数的增加，阳性体系的荧光强度逐渐增加，当G/C碱基个数达到6个后趋于平衡，这是由于随着G/C碱基个数的增加，Hg-Complex越容易形成。比较阴性结果，当G/C碱基个数从3增加到6时，信号略微增加；而当G/C碱基个数从6增加到8时，信号显著增长，因为H-DNA与A-DNA之间T-rich部分氢键的形成。考虑到上述情况，发明人利用相对强光强度来衡量实验结果。如图2所示，H-DNA和A-DNA的T-rich部分具有6个G/C碱基的设计相对荧光强度最大。

一种基于ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg²⁺的方法，步骤如下：

(1)将发卡结构的H-DNA、A-DNA和待检测的样品加入到TM缓冲溶液中，37℃下孵育，形成T-Hg²⁺-T结构；所述H-DNA包含悬垂在3’末端的T-rich部分和封闭在发卡结构中的DNAzyme部分，T-rich部分含有用于选择性识别Hg²⁺的T碱基和辅助Hg-Complex形成的G/C碱基，DNAzyme被封闭在发卡的颈环结构中，所述A-DNA是一条单链结构的DNA，自5’到3’依次为保护部分、与H-DNA配对的互补部分和与H-DNA的T-rich部分作为识别单元结合Hg²⁺的T-rich部分；

(2)向步骤(1)中得到的反应溶液中加入ExoIII，37℃下孵育，进行水解反应后使ExoIII失活(所述酶失活的方法：将反应溶液在85℃下保持20min，冷却至室温即可)；

(3)将发卡结构的分子信标(MB)、Zn²⁺和10×HEPES缓冲溶液加入到步骤(2)的溶液中，37℃下孵育；

(4)利用荧光光谱仪记录结果。

分子信标为具有茎环结构的分子信标，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，与DNAzyme杂交，从而引发自身二级裂分，释放荧光信号。

所述发卡结构的H-DNA和发卡结构的MB的制备方法，将H-DNA或MB稀释到TM或HEPES缓冲溶液中，混匀，95℃退火5min，自然冷却至室温即得。

所述待检测的样品为水样时的制备方法如下，将待检测的水样经0.22μm的滤膜过滤，将标准Hg²⁺溶液加入水样中，再向上述水样中加入硝酸酸化，备用。

一种基于ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg²⁺的试剂盒，包括探针H-DNA、探针A-DNA、ExoIII、MB、Zn²⁺、TM缓冲溶液和HEPES缓冲溶液。

所述试剂盒在检测水样中Hg²⁺污染中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明设计了一种基于ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的新型双重放大荧光方法来灵敏和选择性的检测Hg²⁺，本发明方法不仅能鉴别水样是否被汞污染并且能够准确定量其含量。

2.T-T碱基错配被引入到此方法中用来特异性的识别Hg²⁺，实现了高选择性。

3.通过有效的将ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环结合起来，此方法表现出良好的灵敏度，其检测限为7.2×10^-11mol·L^-1，能够与已报导的借助T-Hg²⁺-T形成的荧光放大方法相当。此外，此策略成功地用于污水样品中Hg²⁺的检测，其结果具有良好的精确度和准确度，且能够与电感耦合等离子体质谱的检测结果相比较。所设计的探针无需引物和特殊的识别位点，大大简化了探针设计。

4.本发明方法用到的探针不需要引物和特殊的识别位点。

附图说明

图1为基于ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的双重放大荧光策略用于灵敏检测Hg²⁺的原理；

图2为(A)不同情况下双重放大策略典型荧光发射光谱；(B)聚丙烯酰胺凝胶电泳表征ExoIII辅助的目标物循环；

图3为H-DNA和A-DNA中T-rich部分不同数量G/C碱基对荧光信号的影响；

图4为不同浓度的Hg²⁺进行检测来获得方法的线性范围和灵敏度，A：不同浓度Hg²⁺的荧光光谱，B为不同浓度的Hg²⁺的线性范围；

图5为其他金属离子、Hg²⁺和混合物的相对荧光强度柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

试剂和仪器

核酸序列由生工生物工程有限公司(中国，上海)合成和纯化；核酸序列的热力学参数和二级结构由IDT网上工具模拟。含2-5％硝酸的标准汞溶液购自百灵威科技有限公司(中国，北京)。ExoIII购自赛默飞世尔科技公司(中国，上海)。其他药品和试剂(均为分析纯)购自标准供应商。所有溶液均由超纯水(>18.25MΩ·cm^-1)配制。自来水取自实验室。湖水取自白云湖(中国，济南)。河水取自黄河(中国，济南)。污水样品取自污水处理厂。

HitachiF-7000荧光光谱仪(日立有限公司，日本，东京)被用来记录荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，激发波长为494nm。520nm处荧光发射强度被用来衡量实验结果。雷磁PHS-3C型pH计(中国，上海)被用来测量溶液的pH值。ThermoFisherScientificXSeries2型电感耦合等离子体质谱仪(赛默飞世尔科技公司，德国，不莱梅)被用来测定实验结果。超纯水通过MilliporeMilli-Q净化系统获得。

凝胶电泳表征

为了形成发卡结构，将H-DNA稀释到TM缓冲溶液中，混匀，95℃退火5min，自然冷却至室温。对于典型的双重放大实验，3.0×10^-7mol·L^-1H-DNA,2.5×10^-7mol·L^-1A-DNA,1.0×10^-6mol·L^-1Hg²⁺和50UExoIII分别被加入到TM缓冲溶液中，进行反应。15％的聚丙烯酰胺凝胶在实验室中新鲜制备。在上样之前，反应样品与上样缓冲液溶液按照5:1的体积比进行混合。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验在TBE缓冲体系中进行电泳分离实验。随后，利用溴化乙锭进行染色，借助紫外成像系统(伯乐公司，美国)进行成像。

Hg²⁺检测过程

为了获得发卡结构的H-DNA和MB，将H-DNA和MB分别稀释到TM和HEPES缓冲溶液中，混匀，95℃退火5min，自然冷却至室温。对于典型的Hg²⁺检测实验，将制备好的H-DNA、A-DNA和不同浓度的Hg²⁺加入到TM缓冲溶液中，37℃下孵育，形成T-Hg²⁺-T结构。随后，向上述反应溶液中加入50U的ExoIII，37℃下孵育，进行水解反应。将反应溶液在85℃下保持20min，缓慢冷却至室温，使ExoIII失活。然后将制备好的MB、Zn²⁺和10×HEPES缓冲溶液加入到上述溶液中，37℃下孵育。利用荧光光谱仪记录实验结果，测定的光谱条件为：激发波长494nm，电压700V，狭缝宽度均为5nm。阴性控制实验所加试剂与阳性相同，但不加入Hg²⁺。所有的实验均重复三次。

环境水样的制备

自来水、湖水、河水和污水样品分别经0.22μm的滤膜过滤来去除不溶性杂质。分别制备含标准Hg²⁺浓度为2.5×10^-9mol·L^-1和8.0×10^-9mol·L^-1的自来水、湖水和河水样品。再向上述四种样品中分别加入硝酸酸化，备用。利用双重放大策略和标准电感耦合等离子体质谱对样品进行检测。

本发明方法的可行性分析

为了验证此策略的可行性和放大能力，发明人研究了各种情况下反应体系的荧光发射光谱。如图2A所示，在阴性条件下，荧光强度非常低(curvec)，表明当目标物不存在时，H-DNA与A-DNA之间几乎不会发生相互作用，这是由于在它们的T-rich部分存在T-T错配碱基。当目标物存在时，荧光强度有所增加(curveb)，这是因为通过T-Hg²⁺-T金属碱基对的形成，链置换反应能够释放出悬垂的DNAzyme序列。当ExoIII被引入来进行消化反应后，荧光强度会显著增强(curvea)，表明ExoIII能够通过目标物循环来有效的扩增信号。然而，当体系中缺少H-DNA或A-DNA时，荧光强度(curved和curvee)比阴性信号(curvec)稍低，这就更加确定了增强的荧光信号是由Hg²⁺与H-DNA和A-DNA之间的相互作用产生。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳实验被用来证实所提出的策略。如图2B所示，条带1和条带2分别仅含有H-DNA和A-DNA。条带3含有H-DNA和A-DNA，并没有产生新的亮带，表明H-DNA与A-DNA之间很难发生相互作用。然而，当Hg²⁺存在时，如条带4所示，产生了新的亮带为DNAzyme序列，并且A-DNA的亮度几乎与条带2中相同。这一结果表明，ExoIII能够催化Hg-Complex中部分H-DNA水解，产生A-DNA用于另一个杂交反应和DNAzyme来进行循环切割，此为双重信号放大策略。

本发明方法用到的DNA探针设计

本发明的关键点在于H-DNA与A-DNA之间双链结构的形成，此双链结构包括Hg²⁺介导的金属碱基对和邻近的沃森-克里克碱基对。因此，特异性的形成H-DNA与A-DNA之间的T-Hg²⁺-T碱基对与邻近的碱基有关¹¹。在这一观点的基础上，发明人设计了六种T-rich部分具有不同G/C碱基数量的DNA探针，研究并获得了最佳设计。如图3所示，随着G/C碱基个数的增加，阳性体系的荧光强度逐渐增加，当G/C碱基个数达到6个后趋于平衡，这是由于随着G/C碱基个数的增加，Hg-Complex越容易形成。比较阴性结果，当G/C碱基个数从3增加到6时，信号略微增加；而当G/C碱基个数从6增加到8时，信号显著增长，因为H-DNA与A-DNA之间T-rich部分氢键的形成。考虑到上述情况，发明人利用相对强光强度来衡量实验结果。如图2所示，H-DNA和A-DNA的T-rich部分具有6个G/C碱基的设计相对荧光强度最大。因此，申请人选择此设计来进行后续实验。

本发明方法的灵敏度

在最优实验条件下，发明人对不同浓度的Hg²⁺进行检测来获得方法的线性范围和灵敏度。不同浓度Hg²⁺的荧光光谱在图4A中展示出来。随着目标物浓度的增加，荧光强度显著增加。如图4B所示，相对荧光强度与2.0×10^-10mol·L^-1到1.0×10^-8mol·L^-1范围的目标物呈良好的线性关系，其相关系数为0.998。根据3δ规则，计算Hg²⁺的检测限为7.2×10^-11mol·L^-1，与已报导的荧光放大策略检测Hg²⁺的方法相当。高灵敏度的获得依赖于基于ExoIII辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的双重放大策略，此策略依赖于特殊设计的DNA探针，而这些探针不需要引物和特殊的识别位点。

本发明方法的选择性

本发明方法用于Hg²⁺检测的选择性通过测定Hg²⁺、其他金属离子(K⁺,Ba²⁺,Zn²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Cr³⁺,Ag⁺)和混合物来验证。图5展示的为其他金属离子、Hg²⁺和混合物的相对荧光强度柱状图。Hg²⁺检测体系信号显著，而其他金属离子相对强度较低，这就表明此策略对于Hg²⁺具有良好的选择性，这是由于特殊的T-Hg²⁺-T的形成。进一步来说，混合物的信号强度与仅含Hg²⁺体系的信号强度相当。这就表明，此方法具有检测环境水样的潜力。

环境水样中Hg²⁺的检测

本发明方法的应用通过研究标准加入的Hg²⁺在自来水、湖水和河水样品中的回收率来验证。如表1所示，所提策略的精密度和回收率均令人满意。随后，污水样品的信号响应也在表1中列出来。污水中Hg²⁺的含量能够通过双重放大策略精确定量，且几乎不受背景干扰。为了确保双重放大策略的准确度和可靠性，水样中Hg²⁺含量通过标准电感耦合等离子体质谱进行定量。数据显示，双重放大策略与电感耦合等离子体质谱的测定结果无明显差别。此结果进一步证实，发明人所提出的双重放大策略能够鉴别水样是否被汞污染并且能够准确定量其含量。因此，此策略能够成功地用于水样中Hg²⁺的分析。

表1.双重放大策略和电感耦合等离子体质谱检测环境水样中Hg²⁺的比较

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。