一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用

摘要

本发明公开了一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用，将SEQ？ID？NO.1所示基因序列通过分子手段转入到广占63黄华苗中，得到新的转987基因突变株。新的转987基因突变株能部分回补广占63黄华苗的生长性状，使其在长江流域能够生长，能分蘖并且结籽，并且带有黄色选择标记，恢复其不育系的作用。

说明书

技术领域

本发明属于蓝藻基因工程领域。具体涉及一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿 润气候区生长的水稻中的应用。

背景技术

水稻(sativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，70年代培育成功的三系杂交水稻是我 国水稻育种事业的重大突破。但是，三系法杂交水稻是建立在质核互作型雄性不育系基础之 上的，在三系法(不育系、保持系、恢复系)杂交水稻的应用过程中，种子生产要经过两个 步骤；恢复系在现有品种中存在的比例也很低；三系不育系的细胞质对杂种的产量性状存在 有不同程度的负效应，影响了杂种优势的充分发挥。两系法杂交水稻是建立在光温敏核不育 系的基础之上的，这类不育系的花粉育性随发育期间所经历的不同光照长度或不同的高低温 度而表现出不育或可育，在不育的时期用做母本进行制种，在可育的时期用来自身繁殖，不 需要保持系。所以称为两系法杂交水稻。两系法杂交水稻比三系法杂交水稻具有更加深远的 意义(尹华奇，1997年)。

广占63s是用N422s与矮广占63杂交后自交选育成的光温敏感型核不育系，已经组 配了较多组合，有些组合因不育系纯度不够，在生产实践中存在诸如不育系繁殖去杂、制种 母本去杂、杂交种纯度鉴定难等问题，如能用隐性标记性状标记纯度，可解决上述问题(陈 庭木，2010年)。广占63黄华苗(或称广占63黄叶突变体)是广占63S一隐性基因发生突 变得到的突变体，该突变体叶片黄色，可作为筛选标记。但是由于该基因的突变，导致该突 变体在长江流域(以武汉为例)生长缓慢，不分蘖不结籽，因而失去了其不育系的作用。目 前广占63黄华苗仅在海南可生长，分蘖并结籽，实现其不育系的作用。

本发明将聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A0987通过分子手段转入到广占63黄华 苗中，得到新的转987基因突变株。新的转987基因突变株能部分回补广占63黄华苗的生 长性状，使其在长江流域能够生长，能分蘖并且结籽，并且带有黄色选择标记，恢复其不育 系的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的 水稻中的应用，所述的聚球藻基因为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.2所 示。将该基因通过转基因手段转入广占63黄华苗(本发明或称广占63黄叶突变体)中，得 到的转基因水稻在武汉地区生长分蘖且结籽。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用，将SEQ IDNO.1所示的基因通过分子生物学的方式转入广占63黄华苗中，获得的转基因植株可在 武汉地区生长分蘖且结籽。

更详细的方案请详见具体实施方式。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明将聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A0987通过分子手段转入到广占63黄叶突 变体中，得到新的转987基因突变株。新的转987基因突变株能部分回补广占63黄叶突变 体的生长性状，使其在长江流域能够生长，能分蘖并且结籽，并且带有黄色选择标记，恢复 其不育系的作用。黄叶不育系在繁殖与制种过程中可以将全部青叶株去除，在杂交种应用时 将黄叶株去除或移栽时剔除。依靠黄叶不育系自身携带的黄色选择标记，可在生产实践中解 决不育系繁殖去杂、制种母本去杂、杂交种纯度鉴定难等问题。

附图说明

图1为基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄叶突变体(D31)PCR检测结果图。

图2为目的基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄华苗生长情况图。

图3为广占63黄叶突变体生长情况图。

图4为目的基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄华苗F1代生长情况图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或原料，如未 特别说明，均来自于商业渠道。

实施例1：

一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用，应用过程包括：

1)以提取的野生型聚球藻PCC7002(Synechococcussp.PCC7002)基因组(编号 NC_010475.1)为模板，引物987F/987R扩增基因SYNPCC7002_A0987，编号gi|169885277。 PCR条件为94℃4min预变性，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最 后72℃延伸10min。

987F：GTGATTACCCTCGCTGAACCC，987R：ACATCCAATAACCAAGAGCCCAA

2)PCR产物电泳后切胶，用DNA凝胶回收试剂盒回收(AXYGEN公司)。连接体系 包括PCR回收产物4ul，T载体(pEASY-T1，全式金生物技术有限公司)0.8ul，轻轻混合， 25℃恒温培养15min。于超净台中将连接体系加入到50ul大肠菌感受态细胞(Trans1-T1， 全式金生物技术有限公司)之中，冰浴30min，42℃热击90s。冰浴2min后加入500ulLB 培养基，37℃，180r/min恢复1小时。将菌液6000r/min离心1min，吸弃上清液400ul，向 剩余的100ul加入50ulX-gal(25mg/ml)和5ulIPTG(1mol/L)，将菌液均匀的涂在氨苄抗性 (Amp+)LB平板上，37℃温箱倒置过夜。得到阳性重组质粒987-T1。

3)用限制性内切酶BamHl和Xba1双酶切重组质粒987-T1和水稻表达载体 pBWA(V)HS(武汉伯远生物技术有限公司提供)，电泳检测酶切结果，切胶回收酶切产物。经 纯化的基因片段SYNPCC7002_A0987和纯化的pBWA(V)HS载体片段按摩尔比1:3混合， 在连接酶作用下，16℃水浴过夜酶连。构建转基因载体pBWA(V)HS-A0987。

3)将转基因载体导入根瘤农杆菌中。取农杆菌感受态细胞，冰上融化以后，加入lug 构建好的质粒pBWA(V)HS-A0987DNA，混匀，依次置于冰浴、液N₂和37℃水浴中各5min， 加入800微升新鲜的YM培养基，于28℃100rpm振荡培养2-4小时。取200uL涂布于含 潮霉素的YM培养基上，28℃培养2-3天。重组质粒酶切鉴定。

4)以水稻(广占63黄华苗，市售)成熟胚为试材诱导愈伤组织，取水稻成熟种子， 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70％酒精消毒2分钟；倒去酒精，加入100ml20％次氯 酸钠(NaClO)溶液，浸泡30分钟；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍， 最后一遍浸泡30分钟。

种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；操作完毕用封 口膜(MicroporeTMSurgicalTape)封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；在超净工 作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继 代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。

5)农杆菌培养，挑取农杆菌单克隆于4mlYM(含50mg/l潮霉素)培养液中，28℃， 250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中， 4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/lAs的30mlAAM感菌液制成悬浮液， 使菌液OD600的终浓度为0.01；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液 侵染5分钟；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将愈伤组织置于共培 养基上。25℃暗培养2.5天。

6)将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢 拉定(或头孢噻肟钠)的无菌水清洗1～2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；将晾干的愈 伤转入含500mg/l头孢拉定和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照 培养14天；

7)将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和50mg/l潮 霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。

8)挑取颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿(每皿或每瓶放置5-7颗)， 用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)。待苗长至1cm左右，放入 生根培养基中壮苗。

9)将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打 开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3天至一周左右，然后洗去 琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。

10)采用PCR的方法用两种引物hyg(280)F/R，987F/R对突变株进行检测，检测目的基 因是否转入到突变株水稻苗之中。hyg(280)F/R是潮霉素抗性基因片段，长度280bp；987F/R 是目的基因SYNPCC7002_A0987片段，长度200bp；引物序列如下：hyg(280)F： ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC，hyg(280)R：TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA 987F：GTGATTACCCTCGCTGAACCC，987R：ACATCCAATAACCAAGAGCCCAA。以提 取的水稻基因组为模板，引物hyg(280)F/R，987F/R进行PCR扩增，PCR条件为94℃4min 预变性，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

检测结果显示，目的基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄叶突变体16株，其中有 阳性突变株9株。

11)观察F0代水稻的生长情况，目的基因SYNPCC7002_A0987转化的广占63黄华苗 生长与野生型比较，有明显的优势性状，野生型的广占63黄华苗在武汉地区气候条件下， 生长不分蘖不结籽，而SYNPCC7002_A0987转化广占63黄华苗在同样的条件下，生长分 蘖且结籽，说明目的基因能回补广占63黄华苗的生长。

12)图1为基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄叶突变体(D31)PCR检测结果图， 每个样本用两对引物987F/R，hyg(280)F/R进行检测，检测结果为阳性的植株在图中标出， 图中1-4表示，检测的样本编号为D30-1-4，987F/R检测阳性，hyg(280)F/R检测阳性，依 次类推，所有的检测结果统计见表1。两种结果都是阳性的，则认为此植株为阳性。

表1

987转黄化 987(200) hyg(280) 987转黄化 987(200) hyg(280) WT(黄化) - - D31-1-1 - - D31-2-1 + + D31-1-2 - - D31-2-2 - - D31-1-3 - - D31-2-3 - - D31-1-4 + + D31-2-4 - - D31-1-5 + - D31-2-5 - - D31-1-6 + - D31-2-6 - - D31-1-7 + - D31-2-7 - - D31-1-8 - - D31-2-8 - - D31-1-9 - - D31-2-9 + + D31-1-10 - - D31-2-10 - - D31-1-11 - - D31-2-11 - - D31-2-12 - -

观察F0代水稻的生长情况，目的基因SYNPCC7002_A0987转化广占63黄华苗生长与 野生型比较，有明显的优势性状，野生型的广占63黄华苗在武汉地区气候条件下，生长不 分蘖不结籽，而SYNPCC7002_A0987转化的广占63黄华苗在同样的条件下，生长分蘖且 结籽，说明目的基因能回补广占63黄叶突变体的生长。

图2为目的基因SYNPCC7002_A0987转化的广占63黄华苗，可见叶片较广占63黄华 苗绿，且植株分蘖且结籽。

图3为广占63黄华苗，可见其叶片发黄，且不分蘖不结籽。

T0代检测阳性的植株，收集种子，种植即得F1代。在F1代出现性状分离，采集样本， 使用检测T0代的方法检测F1代，在检测为阳性的样本中，其生长情况与T0代一致，即在 武汉地区能生长，分蘖，结籽，说明该目的基因确能回补广占63黄叶突变体的性状，使其 恢复不育系的功能。

图4为目的基因SYNPCC7002_A0987转化广占6广占63黄华苗F1代，可见其性状与 T0代一致。

序列表