一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法

摘要

本发明属于水产动物繁殖生物学技术领域，公开了一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，是用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理后进行持续性显微观察，可以包括胰蛋白酶溶液的配制、大刺鳅受精卵的获得及处理和受精卵的持续显微观察及日常管理等步骤。所用胰蛋白酶溶液的浓度是1~3g/L，用量是每个培养皿加3~5mL。本发明用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵进行处理后，使受精卵外膜变薄，透明，可进行持续性显微观察，观察过程视野清晰，结果可靠，与未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静脉血循环系统的形成等特征，将鱼类胚胎发育研究水平提高到新的阶段，具有巨大的研究及参考价值。

说明书

技术领域

本发明属于水产动物繁殖生物学技术领域，具体涉及一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法。

背景技术

大刺鳅（Mastacembelusarmatus）在分类上隶属于鲈形目，刺鳅亚目，刺鳅科，刺鳅属。俗称纳锥，石锥，粗麻割，辣椒鱼，刀枪鱼。成年鱼体长30~50厘米，体重200~500克，最大个体可达2.5kg，肉细坚实，香甜可口，营养丰富。主要分布于长江以南的各水系，以广东、广西、福建等地江河中的野生资源尤为丰富。20世纪80年代以后，由于酷渔滥捕和江河环境污染，大刺鳅的江河野生资源遭到严重破坏，资源枯竭，广东、福建、贵州等省份已将其列入重点保护的野生水生动物之一。目前，尽管已有大刺鳅胚胎发育观察方面的研究，但由于受精卵卵壳厚，一般只能局限于定期显微拍摄再用Photoshop软件处理，未能实现持续性显微观察，难于得到清晰的胚胎发育图像以保证正确的观察结果，从而极大影响大刺鳅繁殖生物学方面研究进展，不利于大刺鳅规模化人工繁殖技术研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可持续性观察大刺鳅胚胎发育的方法，是用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理后进行持续性显微观察。

进一步地，所述胰蛋白酶溶液的浓度是1~3g/L。

进一步地，所述胰蛋白酶的比活为200~300U/mg。

进一步地，所述胰蛋白酶溶液的用量为用量为每个培养皿加3~5mL。

进一步地，所述用胰蛋白酶溶液对大刺鳅受精卵处理具体为：往装有大刺鳅受精卵的培养皿加入胰蛋白酶溶液，每隔1min震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/3~1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用。

进一步地，所述持续性显微观察具体为：将受精卵放在体视显微镜进行连续观察，在每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄。

进一步地，该方法包括以下步骤：

（1）胰蛋白酶溶液的配制：称量0.2g胰蛋白酶于容器瓶中，加入100mL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成2g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用；

（2）大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在25~35粒，从获得受精卵到开始加入胰蛋白酶溶液在3min内完成，然后往培养皿加入胰蛋白酶溶液，每隔1min震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/3~1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成；

（3）受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄，并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。

本发明具有以下有益效果：

采用本发明的方法观察大刺鳅胚胎发育，利用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵进行处理后，使受精卵外膜变薄，透明，可进行持续性显微观察，观察过程视野清晰，结果可靠。与前人研究相比，其发育时间、持续时间及发育特征出现较大差别；与未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静脉血循环系统的形成等特征，将鱼类胚胎发育研究水平提高到新的阶段，具有巨大的研究及参考价值。本发明为大刺鳅胚胎发育持续性观察提供了有效的途径和方法，保证了观察结果的正确性，能极大推动大刺鳅繁殖生物学方面研究。

附图说明

图1为实验组的受精卵，

图2为实验组的肌肉效应期，

图3和图4分别是未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵（对照组）的受精卵时期和肌肉效应期。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1

按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程：

1实验条件的准备

实验材料包括经人工催产大刺鳅亲本获得的受精卵、胰蛋白酶、蒸馏水、培养皿等，以及可进行显微摄影的双目体视显微镜、电脑、摄像装置等一套；实验操作及观察过程均在恒温实验室中进行，室内气温控制在26±0.5℃；

2胰蛋白酶溶液的配制

称量0.2g胰蛋白酶（比活为250U/mg）于容器瓶中，加入100mL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成2g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用；

3大刺鳅受精卵的获得及处理

经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地分布在12个培养皿中，其中实验组8个，对照组4个，每个培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入胰蛋白酶溶液在3min内完成，然后往实验组每个培养皿加入4mL胰蛋白酶溶液，每隔1min轻轻震荡培养皿5~10s，使受精卵与胰蛋白酶溶液充分混和，当培养皿中1/3左右的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3~5次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成；

4受精卵的持续显微观察及日常管理

将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄，与此同时观察并拍摄对照组的受精卵，并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3；

5观察结果

在26±0.5℃条件下，大刺鳅受精卵从人工授精到鱼苗孵出整个过程历时72.5h，分别经过受精卵、胚盘隆起、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和出膜等8个连续发育阶段，根据大刺鳅胚胎发育顺序及形态变化情况，将整个发育过程分为23个时期，如表1所示，根据胚胎发育各阶段持续时间长短及水温，推算出整个胚胎发育过程需要的总积温为1885±36.25℃·h。

表1大刺鳅的胚胎发育过程

发育期发育时间（h）持续时间（h）主要特征受精卵0.01.0呈卵圆形，金黄色，出现放射状受精孔胚盘隆起1.00.3帽状隆起即为胚盘2细胞1.30.15第一次经裂，呈2个分裂球4细胞1.450.15第二次经裂，呈4个分裂球8细胞1.60.2第三次经裂，呈8个分裂球16细胞1.80.3出现纬裂，呈16个分裂球32细胞2.10.3继续卵裂呈，呈32个分裂球多细胞2.40.7继续卵裂，分裂球几何级增长桑椹胚3.10.7继续卵裂，分裂球呈桑椹状囊胚早期3.81.5囊胚层高举在卵黄上囊胚中期5.31.7囊胚层高度降低囊胚晚期7.03.0囊胚层变扁平，细胞明显下包原肠早期10.06.5胚盘下包至1/3-1/2，出现胚环原肠中期16.56.3胚盘下包至1/2-2/3，出现胚盾原肠晚期22.87.6胚盘下包至2/3-3/4，出现胚孔神经胚期30.45.3胚盘下包至2/3-3/4，胚盾继续伸长胚孔封闭期35.76.0胚孔关闭肌节出现期41.71.5胚体中部出现2-3肌节视泡期43.26.8胚体头部出现原基尾牙期55.06.4胚胎尾部伸出芽状突起肌肉效应期61.44.0肌节增加，胚体出现微弱颤动心跳期65.47.1心脏出现，微弱跳动，出现清晰红色血流出膜期72.5—头部胚膜变薄，逐步膨胀，破膜而出

图1为实验组的受精卵，图2为实验组的肌肉效应期，图3和图4分别是未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵（对照组）的受精卵时期和肌肉效应期。

由表1和图1~4可知，利用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵处理后，使受精卵外膜变薄，透明，可进行持续性显微观察，视野清晰，结果可靠，与未经胰蛋白酶处理的同批次受精卵相比，胚胎发育过程中，各发育阶段特征更清晰，尤其是放射状受精孔出现，红色动、静脉血循环系统的形成等特征。

在现有技术（参见大刺鳅胚胎发育观察，淡水渔业，2014（3）：101~104）中，没有用胰蛋白酶对大刺鳅受精卵处理，图片要用Photoshop处理，观察到的胚胎发育过程没有本实施例清晰可靠。

实施例2

按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程：

（1）胰蛋白酶溶液的配制：称量0.1g胰蛋白酶（比活为200U/mg）于容器瓶中，加入100mL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成1g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用；

（2）大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入胰蛋白酶溶液在3min内完成，然后往每个培养皿加入3mL胰蛋白酶溶液，每隔1min轻轻震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/2的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗5次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成；

（3）受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄，并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。

实施例3

按照以下步骤观察大刺鳅胚胎发育的过程：

（1）胰蛋白酶溶液的配制：称量0.3g胰蛋白酶（比活为300U/mg）于容器瓶中，加入100mL蒸馏水，加盖后不停摇晃，让胰蛋白酶充分溶解，配成3g/L的胰蛋白酶溶液，放置在恒温实验室待用；

（2）大刺鳅受精卵的获得及处理：经人工催产大刺鳅亲本获得受精卵，将受精卵均匀地分布在培养皿中，培养皿的受精卵数量控制在30粒左右，从获得受精卵到开始加入胰蛋白酶溶液在3min内完成，然后往每个培养皿加入5mL胰蛋白酶溶液，每隔1min轻轻震荡培养皿5~10s，当培养皿中1/3左右的受精卵开始变得透亮，即倒出胰蛋白酶溶液，并用蒸馏水清洗3次以终止胰蛋白酶的作用，从受精卵加入胰蛋白酶溶液到终止在7~8min完成；

（3）受精卵的持续显微观察及日常管理：将经胰蛋白酶处理后的受精卵放在体视显微镜进行连续观察，每次卵裂和每个发育阶段的关节点对受精卵的重要特征进行显微拍摄，并记录相应的时间；受精卵每天换水2次，每次换水量1/3。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。