一株伪鱼腥藻SCSIO S3及其应用

摘要

本发明公开了一株伪鱼腥藻SCSIO？S3及其应用。本发明提供一株从中国海南省陵水新村湾海草海菖蒲(Enhalus？acodoides)叶片上分离获得的蓝藻新种SCSIO？S3，其于2015年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其具有较高的固氮生物活性并能够产生植物生长激素吲哚乙酸的蓝藻新种，由此该伪鱼腥藻(Pseudanabaena？sp.)SCSIO？S3在海洋微生物肥力制备方面具较高的价值和广阔的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株伪鱼腥藻SCSIOS3及其应用。

背景技术：

原核生物能够将大多数生物不能直接利用空气中氮素还原为可被生物体利用的氮素形态，该过程为生物固氮。固氮生物主要包括蓝藻(蓝细菌)、放线菌、变形菌等细菌和产甲烷古菌等，约涵盖38属1500种细菌，20属87种蓝藻和2属古菌(DixonandWheeler,1986)。蓝藻除了能够通过生物固氮为生态系统提供新氮源，还能够产生一系列的活性代谢物如植物生长调节剂、氨基酸和多糖等物质来调节植物的生长(Ahmedetal.,2010；Mandaletal.,2011)。在根际，蓝藻通过一系列的次级代谢产物与植株直接作用，如蓝藻分泌的植物激素，如类似生长素吲哚乙酸(Indole-3-AceticAcid,IAA)经常被植株根际所吸收利用，同样的，植株根际也会分泌丰富的有机和无机化合物，来吸引和促进根际蓝藻等微生物的生长(Lambers,Mougel,Jaillard,&Hinsinger,2009)。

蓝藻构成了多样性较高的原核生物群落，在地球上具有广泛的分布，如海洋、淡水、陆地土壤甚至是热泉沙漠和北极等寒冷区域都蓝藻的分布(Whitton&Potts,2000)。蓝藻的进化大约从3.5亿年前开始(Schopf,2000)，它们的祖先最先将水最为电子供体进行有氧光合作用，在整个进化的过程中，蓝藻始终作为初级生产者是陆地和海洋生态系统的重要组成，是生物固氮功能的重要执行功能者(Knoll,2008)。

蓝藻在生产力方面具有双重的作用，首先可以固氮二氧化碳，其次可以固定大气中的氮气，氮素通常是很多生态系统中初级生产力的主要限制因素。蓝藻是异养生物的重要食物来源，如在海草生态系统中课可以通过异养生物分解蓝藻进行无机碳的释放，来维持该海洋生态系统的生产力(Yamamuro,1999)。

海草能够进行光合自养，在全球的温带、热带和亚热带的滨海生态系统中具有广泛的分布，是典型热带海洋生态系统的重要的组成，同时也是自然界中生产力最高的生态系统之一。海草大多数分布在寡营养海域，氮素通常是生产力的主要限制因子，固氮微生物通过进行生物固氮作用为生态系统提供新氮源，从而一定程度上减缓了氮限制，促进海草生长。Hamisi等(2009)对西印度洋海岸坦桑尼亚海草床中固氮微生物研究，发现蓝藻是固氮微生物群落的主要组成部分，如颤藻、鞘丝藻、假鱼腥藻、微鞘藻、粘球藻、席藻、色球藻和拟色球藻等。此外，蓝藻还能够分泌吲哚乙酸(IAA)，其能够参加植物的细胞伸长生长、形成层细胞分裂、维管组织分化、叶片和花的脱落等许多生理生化过程的调节与控制，对植物的顶端优势、向性、同化物的运输等也有调节作用(苑博华等,2005)。

印度De于1939年将固氮蓝藻作为肥料用于稻田水稻中，之后美国、英国、日本和埃及等10多个国家也开展了相关研究，我国最早开始这方面研究的是黎尚豪等(1959)，证实了在稻田中接种固氮蓝藻可以有效地为水稻支出提供氮肥、培肥土壤，使稻谷增产10％-30％；施用固氮蓝藻能够有效地促进小麦根和芽的生长以及田间出苗率(王少梅等,1991)，但是关于固氮蓝藻作为促进生长作用的菌肥应用于海洋湿地等生态系统中鲜有相关的报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一株从中国海南省陵水新村湾海草海菖蒲(Enhalusacodoides)叶片上分离获得的，具有较高的固氮生物活性并能够产生植物生长激素吲哚乙酸的蓝藻新种伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3，其于2015年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2015342。

根据乙炔还原法(AcetyleneReducingActivity,ARA)采用气相色谱仪测定伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3固氮活性，研究结果显示伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3具有较高的固氮活性，为2.8±0.66nmolN₂μg^-1Chlah^-1。

用伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的培养液培养红树植物红海榄的种子，发现其能够有效的促进种子的萌发、出芽和生长，对其具有很好的促生作用。因此，本发明所提供的伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3可以进一步制作成生物固氮菌肥，应用于红树林生态系统等典型海洋生态系统的的保护和修复中。

因此，本发明的第二个目的是提供伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3在制备促生固氮菌肥中的应用。

利用Salkowski比色法测定伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3能分泌植物生长激素类物质，标准曲线采用纯的3-IAA(3-吲哚乙酸)制作，其产量为12.6±0.90μg/mg。

因此，本发明的第三个目的是提供伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3在制备3-吲哚乙酸中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从海菖蒲叶面分离筛选到一株蓝藻新种-伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3，其具有良好的固氮活性和能分泌产生3-吲哚乙酸，由此该伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3在海洋微生物肥力制备方面具较高的价值和广阔的应用前景。

Pseudanabaenasp.SCSIOS3于2015年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2015342。

附图说明：

图1是伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的16SrDNA的系统进化发育树，图中的SCSIOS3表示伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3；

图2是伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的nifH的系统进化发育树，图中的SCSIOS3表示伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的分离、纯化和鉴定

1、伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的分离和纯化

收集从中国海南省陵水新村湾采集的海草泰来藻，加入海水搓洗，过滤即可获得蓝藻液。挑取蓝藻菌丝分别于海洋蓝藻培养基ATCCMedium957、固氮蓝藻培养基ATCCMedium819和海洋固氮蓝藻培养基ATCCMedium1077和BG-11Medium进行培养，持续光照强度为150μE/m²/s，光照周期为12:12h(光：暗周期)，温度为23-27℃，光照培养箱中(型号为LRH-250一GH微电脑控制光照培养箱)，每两周转入新鲜培养基中，直至镜检为单一菌丝体。由此分离纯化得到蓝藻SCSIOS3。

2、伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3的鉴定

1)形态学鉴定：光学显微镜下，挑取培养两周的蓝藻SCSIOS3置于载玻片上，通过盖玻片加以固定，进行观察。本实施例中获得的蓝藻SCSIOS3，为丝状非异形胞蓝藻，简单成束，宽度小于4μm，长大于宽，具有顶类囊体、囊泡和缢痕。

2)蓝藻固氮活性的测定

本实施例蓝藻的固氮酶活性采用气相色谱仪测固氮菌的乙炔还原活性(Acetylene-reducingActivity，ARA)(参考Capone1993，CaponeDG(1993)Determinationofnitrogenaseactivityinaquaticsamplesusingtheacetylenereductionprocedure.AquaticMicrobialEcology,621–631)。

本实施例分实验组和空白对照组。

实验组：分离纯化得到的蓝藻SCSIOS3，将该其接种于100mL选择性液体无氮液体改良培养基内，持续光照强度为150μE/m²/s，光照周期为12:12h(光：暗周期)，温度为23-27℃，培养2周后，取5mL于灭菌的20mL小瓶中，盖上橡皮塞，瓶盖边缘以石蜡封口，用注射器将1mL的乙炔注入20mL小瓶中，于30℃反应12h，然后取40μL反应后气体，待测；每个实验组设三个重复。

所述的选择性液体无氮液体改良培养基，其配方为：MgSO₄·7H2O,0.08g；CaCl₂0.04g；K₂HPO₄0.04g；NaHCO₃0.04g；Fe-EDTA2ml；TA52ml；VB120.32ml，蒸馏水500ml，灭菌海水1500ml，灭菌备用。

TracemetalmixA5(TA5):H₃BO₃2.86g；MnCl₂4H₂O1.81g；ZnSO₄7H₂O0.222g；NaMoO₄2H₂O0.39g；CuSO₄5H₂O0.079g；Co(NO₃)₂6H₂O49.4mg；Distilledwater1.0L，灭菌备用。

空白对照组：对照容器中加入乙炔气体但是不加入蓝藻，其他同实验组。

所有样品用气相色谱检测乙烯的生成量。

取40μL反应后气体在上海精科仪电气相色谱仪器(GC-112A)上测定乙烯峰值，标准气乙烯的浓度为138ppm。气相色谱仪的工作条件设置为：检测室温度200℃，柱箱温度60℃，进样口120℃。表头载气压力氮气为0.95kg·cm^-2，氢气为0.8kg·cm^-2，空气为0.6kg·cm^-2。乙炔还原活性计算方法为：

ARA(nmolCH·H^-1·Culture^-1)＝Vst×Cst×Asa×Vtu/Vsa/Ast/H/22.4

其中，Vst是注入标准气的体积(ml)，Cst是标准气的浓度，Vtu是所用试管体积(ml)，Asa是样品乙烯峰的面积(cm)，Vsa是样品注入体积(ml)，Ast是标准气峰面积(cm)，H是培养时间。

检测结果表明本实施例分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSIOS3可以利用N₂作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为2.8±0.66nmolN₂μg^-1Chlah^-1。

实施例2蓝藻吲哚乙酸产生量的测定

测定采用salkowski比色法测定分离物产生植物生长激素类物质的能力，标准曲线采用纯的3-IAA(3-吲哚乙酸)制作。将蓝藻SCSIOS3接种于100mL选择性液体无氮液体改良培养基(配方同实施例1)内，持续光照强度为150μE/m²/s，光照周期为12:12h(光：暗周期)，温度为25-28℃，培养120h，每隔24h取蓝藻培养液上清5mL在10000r/min离心10min，取上清液加比色液在黑暗中静止0.5h，取出，立即用分光光度计测定，波长是530nm(GlickmannandDessauxY.A)。

样品中吲哚乙酸含量(μg/mg)＝(A×V1)/(W×V2)×1000

式中：A——标准曲线上查得的IAA量(μg)

V1——样品提取液体积(mL)

W——样品重量(g)

V2——样品反应液体积(mL)

本发明获得的蓝藻SCSIOS3的3-IAA生成量约为10.35±0.64μg/mg。

实施例3菌株的16SRNA和固氮基因扩增

选择实施例1分离纯化得到的纯菌株蓝藻SCSIOS3进行DNA提取和纯化，本实施例DNA的提取与纯化，其操作方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P₄₀₉。采用固氮细菌的16S27F/1492R(Weisenburgetal.,1991，16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudy.，Journalofbacteriology，1991173(2):697-703和nifH基因通用引物PolF/PolR(参考Polyetal.,2001，ComparisonofnifHGenePoolsinSoilsandSoilMicroenvironmentswithContrastingProperties，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2001，67(5)：2255-2262)进行PCR扩增：PCR反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系

PCR反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共30个循环；后延伸72℃10min。

取2μlPCR反应产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，若有目的条带的出现，则将剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系统测序，并将测序分析得到的16SrDNA(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)和固氮基因序列nifH(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)通过GenBank中的BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对，对其种属鉴定进行初步的确定。建立系统发育树，系统发育树如图1和图2所示，从系统发育树可以看出与蓝藻SCSIOS3的16SrDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自鞘丝藻属，并且与已知菌种的伪鱼腥藻PseudanabaenatremulaUTCC471(AF218371)的16SrDNA序列具有91.69％的相似性，固氮基因与鞘丝藻属的赖氏鞘氏藻相似度最高，仅为91％，表明该株蓝藻SCSIOS3为一株潜在新种，其属于伪鱼腥藻，将其命名为伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3，其于2015年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2015342。

实施例4蓝藻培养液在红树种子萌发和生根过程促生作用的有效性试验

将用选择性液体无氮液体改良培养基(配方同实施例1)培养2周后的伪鱼腥藻(sp.)SCSIOS3菌液的上清液，分别取出5mL加入含有红树林植物红海榄种子的培养瓶中，其中对照组中仅仅只加入5mL的超纯水，各三个重复，然后将其放入培养箱中，置于12h:12h光：黑暗周期(200μE/m²/s)的光照强度，27℃培养，20天后，点数根的条数并且测量根的长度，结果如表2所示。

表2：不同处理组的红海榄的根数和平均根长

如表2所示，通过实验组和对照组的生长20天后的实验结果对比可以发现，实验组的生根数和平均根长度均明显高于对照组，根数约是对照组的2.6倍和平均根长约为对照组的2倍，显示了伪鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)SCSIOS3对红树植物的生根具有较好的促生效果，具有应用于红树林等海洋生态系统的修复和保护中的巨大潜力。