法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-06-27
授权
授权
2015-12-30
实质审查的生效 IPC(主分类):A01H1/08 申请日:20150828
实质审查的生效
2015-12-02
公开
公开
技术领域
本发明属于植物修复土壤重金属污染领域,具体涉及到一种利用染色 体加倍改良锌镉超积累植物东南景天基因型的方法。
背景技术
近年来土壤镉污染日益严重,土壤中的镉通过植物(或植物到动物) 进入人体,危害人类的健康。如何治理和减轻土壤中的镉污染,成为目前 急需解决的问题。植物修复是一种比较环保有前途的方式。东南景天是一 种锌镉超积累植物,能够将锌镉较多的吸收积累至地上部,从而减轻土壤 重金属污染。但是,东南景天的生物量相对较低,虽然相对积累量高,仍 难以满足植物修复的需求。如何利用这一优良资源,提高污染土壤植物修 复效率尤为重要。
例如,公开号为CN101444185A的中国发明专利申请文献公开了一种 重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法,其特征是采用叶片愈伤组织 诱导法,将东南景天叶片消毒,切去叶缘、叶脉和叶柄,切成0.2~0.3cm 的小片,接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5~5.8诱导培养基上, 将培养瓶放入温度为±25℃,无光照的培养箱中1~2周诱导愈伤组织,将 愈伤组织转移至已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5~5.8分化培养基中, 再将培养瓶放入温度为±25℃,每天保持光强为3000勒克司的光照16小 时的培养箱中培养40~50天,得到3~5cm高带有1cm以上幼根的幼苗, 然后将培养瓶移到室外,打开瓶口,加入少许蒸馏水放置2~3天后,用 水洗去培养基,移栽至蛭石:珍珠岩比例3∶1的基质,或有机质基质中, 2~4周得到种苗。
公开号为CN1973617A的中国发明专利申请文献公开了一种重金属 超积累植物东南景天种苗的繁殖方法,采用茎段扦插法,将东南景天剪成 3cm以上带腋芽的茎段,直接扦插到到受重金属污染的土壤中,按传统农 耕法管理生长,待植物生长至15cm~30cm收割地上部,作为种苗再次被 剪成3cm以上带腋芽的茎段,扦插到污染环境的土壤中;或者将东南景天 剪成3cm以上带腋芽的茎段,直接扦插到育苗基质或营养液中,按传统农 耕法管理生长,得到种苗。
发明内容
本发明提供一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方 法,通过诱导东南景天染色体加倍,再经过检测获得加倍材料,提高东南 景天对重金属的超积累能力。
一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法,包括如下 步骤:
(1)将离体的东南景天植株切成含有完整腋芽的茎段,浸入无菌秋 水仙素溶液中,密封避光,并放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡;
(2)取出步骤(1)处理后的离体带腋芽茎段经无菌水冲洗后接种于 分化培养基上,培养至腋芽处长出丛生芽;
(3)将所得的丛生芽接种于生根培养基中,进行生根培养;
(4)取生根培养后的完整植株的嫩叶在流式细胞仪上检测所获得株 系的倍性,选择变异植株;
(5)取变异植株,切成茎段,在生根培养基中培养获得无菌苗。
将变异植株即无菌苗与对照株在加镉的培养基中进行镉处理,检测其 体内镉积累量。
东南景天的超积累效应得益于其特异基因的表达,染色体的加倍能使 这些基因相对过表达,从而提高修复效果;同时,加倍后会使其茎秆粗壮, 生物量增大。
人工诱导染色体加倍的方法中,秋水仙素加倍技术比较简单有效,使 用最多。秋水仙素是一种从百合科植物秋水仙中提取出来生物碱,能抑制 有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期,在这样的有丝分裂中, 染色体虽然纵裂,但细胞不分裂,不能形成两个子细胞,因而使染色体加 倍。加倍后的多倍体通常具有更强的抗逆性与适应性。东南景天以无性繁 殖为主,能从叶腋处长出大量腋芽,快速繁殖。叶腋是东南景天分裂旺盛 的组织区域,以秋水仙素处理,效果最好。
优选地,所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.1~0.2%。最优选为0.2%。
优选地,步骤(1)中在摇床中震荡培养24-72h。进一步优选24h。
优选地,所述分化培养基的组成为:基础培养基MS+8.0g/L琼脂+30.0 g/L蔗糖+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,pH5.8。优选地,所述生根培养 基的组成为:1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L2,4-D,pH5.8。
优选地,步骤(4)中倍性检测的方法包括如下步骤:
(1)取嫩叶片放在预冷的培养皿中,加入预冷的OttoI,切碎,解离;
(2)吸取步骤(1)培养皿中的解离液,用400目滤膜过滤到离心管 中,于3~5℃孵育3~5min;
(3)离心弃去上清液,加入预冷的OttoI,再加入OttoII,最后加入 预冷PI染液,置于3~5℃条件下避光染色8~10min;OttoI、OttoII和PI 染液的体积比为1:4:5;
(5)移至上样管,上流式细胞仪检测。
进一步地:OttoI的组成为:0.1mol/L柠檬酸,0.5%(v/v)Tween20, pH2.0-3.0,4℃保存;OttoII的组成为:0.4mol/L十二水磷酸氢二钠,pH 2.0-3.0,常温保存;PI(碘化丙啶)染液浓度为0.05mg/ml,每ml加入 250μgRNA酶,锡纸包裹,避光,4℃保存。
步骤(4)中倍性检测的方法更进一步地,具体步骤为:
1)取约0.5g叶片放在预冷的培养皿中,加入1ml预冷的OttoI,用 锋利的刀片一次性快速切碎;
2)吸取培养皿中的解离液,用400目滤膜过滤到1.5ml离心管中, 于4℃冰箱孵育5min;
3)离心,转速1000r/min,温度4℃,时间5min;
4)弃去上清液,加入预冷的OttoI20μl,再加入OttoII80μl,最后加 入100μl预冷的碘化丙啶PI染液,每个样共约200μl细胞核悬浮液。置 于4℃冰箱,避光染色10min;
5)移至上样管,上机检测。
优选地,当步骤(3)中的植株长到5cm高后,上流式细胞仪上检测。
本发明方法处理条件简单易控制,重复性高,省时省力。
附图说明
图1A为Otto’s提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南景天叶片相 对DNA含量分布直方图,图1B为Otto’s提取、PI染液染色后流式细胞 仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。
图2为东南景天植株比较图,图2A为对照植株形态图,图2B为倍 性增加植株形态图。
图3为用Otto’s提取PI染色后,显微镜下观察到的细胞核。
图4为镉胁迫下东南景天对照植株与倍性增加植株体内镉含量。
图5A为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南 景天叶片相对DNA含量分布直方图,图5B为Tris.MgCl2提取剂提取、PI 染液染色后流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方 图。
具体实施方式
实施例1
(1)无菌苗的获得:取东南景天上半段植株经流水冲洗20分钟后, 用75%的乙醇浸泡杀菌60s,再置于0.1%的HgCl2消毒5min,用无菌水 冲洗4-5次后,将其平放在高压灭菌过的滤纸上,用无菌手术刀将片切成 小块,然后接入MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA的培养基上继代培养,生长一段时间后获得大量丛生芽,再转入 1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L2,4-D的培养基中进行生根培 养,获得大量的无菌苗供实验选用。
(2)秋水仙素加倍:选取健壮无菌苗放在无菌滤纸上,用无菌手术 刀把大叶片切去一半,再将茎杆切成茎段,茎段上包含完整腋芽,然后放 入高压灭菌过的0.2%的秋水仙素溶液中浸泡。将盛装离体带腋芽茎段和 秋水仙素溶液的锥形瓶用封口膜和橡皮筋进行封口,保证其与外界隔离, 用锡纸包裹避光,放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡24h,转速为100 rpm。
(3)增殖培养:在超净工作台上,将处理过的带腋芽茎段取出,无 菌水冲洗4-5遍,再用无菌滤纸吸干残留水分,接种于MS+8.0g/L琼脂 +30.0g/L蔗糖+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的培养基中,注意形态学上 端朝上插入培养基,在温度25℃,光强为1500lx组培专用LED灯下光照 16h,直到长出大量腋芽。
(4)生根培养:为了快速繁殖并获得大量植株,将腋芽切出,接种 于1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L2,4-D培养基中生根生长。
(5)倍性检测:培养约一个月,取嫩叶制样在流式细胞仪上检测所 获得株系的倍性,此时的诱变率能达27.3%。
具体步骤为:
1)取约0.5g叶片放在预冷的培养皿中,加入1ml预冷的OttoI,用 锋利的刀片一次性快速切碎;
2)吸取培养皿中的解离液,用400目滤膜过滤到1.5ml离心管中, 于4℃冰箱孵育5min;
3)离心,转速1000r/min,温度4℃,时间5min;
4)弃去上清液,加入预冷的OttoI20μl,再加入OttoII80μl,最后加 入100μl预冷的碘化丙啶PI染液,每个样共约200μl细胞核悬浮液,置 于4℃冰箱,避光染色10min;
5)移至上样管,上机检测。
OttoI的组成为:0.1mol/L柠檬酸,0.5%(v/v)Tween20,pH2.0-3.0,4℃ 保存;OttoII的组成为:0.4mol/L十二水磷酸氢二钠,pH2.0-3.0,常温保 存;PI(碘化丙啶)染液浓度为0.05mg/ml,每ml加入250μgRNA酶, 锡纸包裹,避光,4℃保存。
用Otto’s提取PI染色后,显微镜下观察到的细胞核如图3所示。
(6)扩繁:将已确定了的倍性增加植株大量扩繁,切成茎段,在 1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L2,4-D培养基中培养,保存无 菌苗。
图1A为流式细胞仪检测东南景天叶片相对DNA含量分布直方图; 图1B为流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。
图2为东南景天植株比较图,图2A为对照植株形态图,图2B为倍 性增加植株形态图。
利用流式细胞仪对植物细胞倍性进行检测,对照植物有四个峰,说明 未经秋水仙素加倍的东南景天本身体内含有四种DNA含量的细胞,即其 本身就是混倍体。对变异株进行DNA含量测定,发现有五个峰,染色体 的倍性增加,但其仍是混倍体。在外部形态上,变异株比对照的茎秆粗壮, 叶片厚实,根系发达。组培条件下倍性增加的苗明显壮于对照苗,生物量 大。组培条件下,同高度的苗,倍性增加苗的重量约是对照的2-3倍。
图5A为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南 景天叶片相对DNA含量分布直方图,图5B为Tris.MgCl2提取剂提取、PI 染液染色后流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方 图。用Tris.MgCl2提取剂提取,用PI染色,经流式细胞仪分析,有些峰不 是很明显,且有很多的背景碎片。相比,Otto’s提取方法效果更好。
Tris.MgCl2:0.2mol/LTris,4mmol/L六水氯化镁,0.5%(v/v)Triton X-100,pH7.5,4℃保存。
实施例2
(1)镉处理:选择长势相同的倍性增加苗与对照,移入MS+8.0g/L 琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L2,4-D培养基中,培养基中镉的浓度分别为 0,50,100,200μM,每个处理三次重复。
(2)收样:试验处理30d后收获取样。收获植物时,将植物置于20mM Na2EDTA溶液交换15分钟,去除表面吸附的Cd2+;然后用自来水和去离 子水分别洗三次。
(3)镉含量测定:将收取的植物置于105℃下杀青30min,然后在 65℃下烘干至恒重;用研钵将植物样品磨细,供元素分析测定用。称取 0.1g植物干燥粉末,使用HNO3/HClO4双酸法进行消煮。消煮后的溶液用 去离子水定容后,使用ICP-MS(Agilent7500a)进行镉含量测定。
图4为镉胁迫下东南景天对照植株与倍性增加植株体内镉含量。
机译: 用具有铅积累能力的苔藓植物生丝纯化铅的方法和设备
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