一种银杏品种分子检测引物组合物及其品种检测方法

摘要

本发明公开了一种银杏品种分子检测引物组合物及其品种检测方法，专用于果用银杏品种的快速分子检测与鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。设计了8对SSR引物，并利用它们成功构建了48个果用银杏品种指纹图谱，可快速、准确地区分各银杏品种。本发明基于8对SSR引物，进行一次PCR扩增反应，利用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，利用引物组合法，可直接根据产物的片段进行判断。本发明可直接应用于果用银杏种水平的鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于植物新品种鉴定技术领域，涉及一种银杏品种分子检测引物组合物及其品种检测方法，专用于银杏果用品种的快速分子检测和鉴定。

背景技术

银杏(GinkgobilobaL)是现存的种子植物中最古老的物种，被誉为历史和现实的珍稀纽带[Hui-LinL.Ginkgo-themaidenhairtree[J].Amer.Hort.Mag,1961,40:239-249.]。它具有树体高大挺拔、树形姿态多变优美、寿命极长等特点，同时又集果、叶、材等用途于一身，具有较高的经济、生态和文化价值[曹福亮.中国银杏志[M].中国林业出版社,2007.]。中国作为世界银杏的分布中心，拥有世界银杏种质资源90％以上。随着其价值的不断被发现，自20世纪80年代，银杏的良种选育与推广逐渐受到重视，就目前为止银杏栽培品种可以分为核用品种、叶用品种、雄株品种、观赏品种和材用品种5大类[刑世岩.中国银杏种质资源[M].中国林业出版社.2013]。其中，银杏核用品种较多，其分类多依据其来源以及某些种子特征，未有一个较为系统的分类方法，且品种命名方面也较为随意，存在同名异物或异名同物的现象，为银杏品种鉴定造成诸多不便。

传统的植物品种鉴定是基于形态学水平的，主要通过植物的某些表型特征对其加以区分与鉴定，该方法在品种较少、表型特征差异明显时较为可行。随着品种数目的不断增加，品种间差异逐渐缩小，且表型特征有时会随着环境的改变而发生变化，单独依靠形态学水平已很难达到对品种有效鉴定的目的了。我国银杏品种繁多且用途广泛，而近年来所选育的品种也多为核用品种，且选育手段集中为选择育种和无性系育种[郝明灼,曹福亮,汪贵斌,等.银杏杂交育种研究现状及展望[J].林业科技开发,2006,19(6):5-8.]，使得各品种间的差异越来越小，为银杏品种区分增加了难度。此外，在栽培过程中也出现了不少变异品种，银杏优良品种交易市场上也常有假冒伪劣品种滥竽充数。一系列问题的出现使银杏优良品种有效鉴定方法的建立显得越发重要。因此，现急需一种快速、方便、可靠的银杏品种分子鉴定技术。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种银杏品种分子检测引物组合物，克服以往银杏果用品种鉴定方法存在的缺陷，提供结果高度准确可靠、易于操作、灵敏度高的分子检测和诊断方法。本发明的另一目的是提供一种使用银杏品种分子检测引物组合物快速检测银杏品种方法，该方法可以直接应用于生产实践，对于银杏果用苗木的鉴定具有十分重要的意义。

技术方案，为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种银杏品种分子检测引物组合物，包括8对引物，其引物序列如下表所示：

应用所述的银杏品种分子检测引物组合物构建银杏品种指纹代码，所获得的48个银杏品种对应指纹代码如下表所示：

品种名称指纹代码泰兴2号1DF2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BB泰兴3号1CE2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BC泰兴4号1CC2DF3BC4CC5BB6CD7BB8BC洞庭佛手(新民2号)1CC2EG3CC4BC5BB6CC7BB8BB洞庭皇1CC2DF3BC4CC5BB6CC7BB8BC洞庭佛手1CE2EG3CC4CC5BB6CC7BB8BB洞庭佛手1CE2EG3CC4CC5AA6CC7BB8BB苏农佛手1CD2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BB曹1号1AF2DF3BB4CC5CC6BB7AA8BC曹2号1AF2DF3BB4CD5CC6BB7BB8BC塂西1号1AF2DF3BB4CC5CC6BB7BB8BC铁马2号1AF2DF3CC4CC5CC6BB7BB8BC铁马3号1AF2DF3CC4CD5CC6BB7BB8BC铁马4号1CE2EE3BB4CC5BB6BB7BB8BC小园子1DE2CE3BB4CC5BB6BC7BB8BC鸭屁股(佛指)1DE2CE3CC4CC5BB6BC7BB8BC大佛指1DE2CE3CC4CC5BB6BC7BB8BB郯城2311AD2DG3CC4CC5AC6CC7BB8CC

郯城2071CE2EE3CC4CC5BB6CC7BB8BC郯城马铃1号1CE2EE3BB4DD5BB6BB7BB8BC郯城马铃2号1BB2AB3AC4CC5BB6BC7BB8BC大马铃(徐仁)1AF2DF3AC4BC5CC6BB7BB8BC郯城3001AC2FF3BB4CC5AC6BB7BB8CC古银杏树(梅核)1BC2BC3AC4CC5BC6BB7BB8BB大龙眼(无翅)1CD2DD3CC4CC5AC6BB7BB8BC叶籽银杏1DE2CC3CC4CC5BB6BB7BB8BC新村18号1DE2CC3AC4CC5BB6BB7BB8BC正安2号1DE2BC3AC4CC5CC6BC7BB8BC正安4号1BC2BD3AC4CC5AC6BB7BB8AC正安5号1BC2CD3BB4DD5AC6BC7BB8BB园铃13号1CF2AE3BB4CC5CC6CC7BB8BC长糯白果1BE2BC3BB4CC5BC6BC7BB8CC园铃9号1CC2AC3BB4CC5BC6CC7BB8BB玉坠5号1AF2CE3BB4BC5CC6CC7BB8BC盘县长白果1CF2BC3AC4DD5AC6AD7BB8BB庆春7号1BB2BD3AC4CC5BC6CD7BB8BC长兴1号1BC2CE3BB4AC5BC6CC7CC8BC长兴3号1BC2AC3CC4BD5AC6BB7BB8BC长兴5号1BC2AC3BB4BD5AC6BB7BB8BC桂林2号1DE2CC3BC4DD5AC6BB7BB8BC桂林7号1AB2CC3BB4DD5BC6BC7BB8BC桂林9号1AF2CD3AC4BC5CC6BC7BB8BC延安1号1AF2CF3CC4CC5AC6BC7CC8BC塂西2号1AF2DF3AC4BC5CC6BB7AA8BC道真5号1CD2BC3BB4DD5CC6BC7BB8CC道真7号1CD2CC3BB4AD5CC6BB7CC8BC大龙眼1BB2CC3BB4CC5AB6BB7BB8BC滕久郎1BC2CC3BB4BC5AA6CC7BB8AA

。

使用所述银杏品种分子检测引物组合物快速鉴定银杏品种的方法，包括以下步骤：

1)待测样品DNA提取；

2)PCR扩增；使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对银杏的样本进行PCR扩增，直至完成鉴定；

10μl反应体系中包括：10Xbuffer1；0.2mmol/ldNTP；2.5mmol/lMgCl2；0.2μmol/lSSR引物；1UTaqDNA聚合酶和40ngDNA模版。

PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm55℃30s，72℃40s；延伸72℃1m，最终10℃保存；

3)对PCR产物用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测，根据扩增产物的有无和扩增产物大小来判定结果。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：

1)结果高度准确、可靠：本发明所用银杏果用材料来自江苏、山东、广西、浙江等银杏主要分布区，品种涵盖面较广，并利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，为检测结果提供了高度的可靠性。

2)操作简便快速：本实验方法对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可以判断结果。一般整个检测过程可在6个小时内完成。

3)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板DNA40ng即可准确鉴定其所属种。

4)取材方便、经济效益明显：本方法实验采样方便，叶片、冬芽、花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点限制。通过对银杏苗木进行分子鉴定可以避免苗木生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于银杏不同品种的苗木生产与销售具有十分重要的经济效益。

附图说明

图1为引物Gb_gSSR150对48个银杏果用品种的基因组DNA样本的PCR扩增电泳图。

图2为本发明中的8对SSR引物利用相同模板进行扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

采用454GSFLX高通量测序仪，分别对银杏的雌株花芽和幼叶的RNA及银杏DNA进行测序得到银杏EST和基因组序列，利用MISA软件对所得序列进行SSR位点的寻找，利用Primer5.0软件进行引物设计。最后成功设计556对EST-SSR引物，有417对引物能够稳定扩增；设计432对基因组SSR引物，随机合成200对引物，有132对可以稳定扩增。从银杏果用品种材料中随机选取6个个体对可稳定扩增的549对SSR引物(417对EST-SSR引物和132对基因组SSR引物)进行多态性检测，最后获得了176对EST-SSR和82对基因组SSR多态引物；随后，从中选取多态性表现良好，且条带清晰的40对SSR引物，包括30对EST-SSR和10对基因组SSR引物，对48个银杏果用品种无性系进行PCR扩增。应用POPGENE进行相关遗传参数计算，依据PIC值(多态性信息含量)、Shannon多样性指数以及na*值，最终选择8对多态性好、重复性高的引物进行排列组合，构建指纹代码。该8对SSR引物即为本发明的银杏品种分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示。

表1银杏品种分子检测引物

实施例2

应用实施例1的银杏品种分子检测引物组合物构建银杏品种指纹代码，所获得的48个银杏品种对应指纹代码如表2所示。

序号品种名称SSR指纹代码1泰兴2号1DF2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BB2泰兴3号1CE2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BC3泰兴4号1CC2DF3BC4CC5BB6CD7BB8BC4洞庭佛手(新民2号)1CC2EG3CC4BC5BB6CC7BB8BB5洞庭皇1CC2DF3BC4CC5BB6CC7BB8BC6洞庭佛手1CE2EG3CC4CC5BB6CC7BB8BB7洞庭佛手1CE2EG3CC4CC5AA6CC7BB8BB8苏农佛手1CD2CE3CC4CC5BC6CC7BB8BB9曹1号1AF2DF3BB4CC5CC6BB7AA8BC10曹2号1AF2DF3BB4CD5CC6BB7BB8BC11塂西1号1AF2DF3BB4CC5CC6BB7BB8BC12铁马2号1AF2DF3CC4CC5CC6BB7BB8BC13铁马3号1AF2DF3CC4CD5CC6BB7BB8BC14铁马4号1CE2EE3BB4CC5BB6BB7BB8BC15小园子1DE2CE3BB4CC5BB6BC7BB8BC

16鸭屁股(佛指)1DE2CE3CC4CC5BB6BC7BB8BC17大佛指1DE2CE3CC4CC5BB6BC7BB8BB18郯城2311AD2DG3CC4CC5AC6CC7BB8CC19郯城2071CE2EE3CC4CC5BB6CC7BB8BC20郯城马铃1号1CE2EE3BB4DD5BB6BB7BB8BC21郯城马铃2号1BB2AB3AC4CC5BB6BC7BB8BC22大马铃(徐仁)1AF2DF3AC4BC5CC6BB7BB8BC23郯城3001AC2FF3BB4CC5AC6BB7BB8CC24古银杏树(梅核)1BC2BC3AC4CC5BC6BB7BB8BB25大龙眼(无翅)1CD2DD3CC4CC5AC6BB7BB8BC26叶籽银杏1DE2CC3CC4CC5BB6BB7BB8BC27新村18号1DE2CC3AC4CC5BB6BB7BB8BC28正安2号1DE2BC3AC4CC5CC6BC7BB8BC29正安4号1BC2BD3AC4CC5AC6BB7BB8AC30正安5号1BC2CD3BB4DD5AC6BC7BB8BB31园铃13号1CF2AE3BB4CC5CC6CC7BB8BC32长糯白果1BE2BC3BB4CC5BC6BC7BB8CC33园铃9号1CC2AC3BB4CC5BC6CC7BB8BB34玉坠5号1AF2CE3BB4BC5CC6CC7BB8BC35盘县长白果1CF2BC3AC4DD5AC6AD7BB8BB36庆春7号1BB2BD3AC4CC5BC6CD7BB8BC37长兴1号1BC2CE3BB4AC5BC6CC7CC8BC38长兴3号1BC2AC3CC4BD5AC6BB7BB8BC39长兴5号1BC2AC3BB4BD5AC6BB7BB8BC40桂林2号1DE2CC3BC4DD5AC6BB7BB8BC41桂林7号1AB2CC3BB4DD5BC6BC7BB8BC42桂林9号1AF2CD3AC4BC5CC6BC7BB8BC43延安1号1AF2CF3CC4CC5AC6BC7CC8BC44塂西2号1AF2DF3AC4BC5CC6BB7AA8BC45道真5号1CD2BC3BB4DD5CC6BC7BB8CC46道真7号1CD2CC3BB4AD5CC6BB7CC8BC47大龙眼1BB2CC3BB4CC5AB6BB7BB8BC48滕久郎1BC2CC3BB4BC5AA6CC7BB8AA

注：代码中数字为引物序号，对应于表1相同序号所示序列，同一数字后相同字母代表同一等位基因。

该指纹代码简要构建过程如下：

1)PCR扩增及产物检测：利用实施例1筛选出的8对多态性SSR引物对48个银杏品种进行PCR扩增。所得产物利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测。10μLPCR反应体系中包括：10Xbuffer1；0.2mmol/ldNTP；2.5mmol/lMgCl₂；0.2μmol/lSSR引物；1UTaqDNA聚合酶和40ngDNA模版。PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm55℃30s，72℃40s；延伸72℃1m，最终10℃保存。

2)数据处理：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果读取采用大写英文字母表示，同一对引物而言，对不同模版的扩增产物会因其片段大小的不同而在电泳过程中表现为迁移速度的不同，在相同时间内，移动到同一位置的若干条带便认为是同一个等位基因。依据条带大小从大到小依次用字母A、B、C、D、E、F等表示。

3)指纹代码构建：该8对SSR引物即为本发明的银杏品种分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示；所构建48个银杏品种指纹代码如表2所示。

实施例3

应用实施例1银杏品种分子检测引物组合物快速鉴定银杏品种的方法，包括以下步骤：

1)DNA提取利用天跟生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)完成。

2)按照如下的PCR反应体系和反应程序据表1的引物顺序依次进行PCR扩增，直至完成鉴定。

PCR的反应体系10μL，包括模板DNA1μL(40ng)、1×Buffer1μL、10mMdNTPs0.2μL(Thermoscientific公司)、25mMMgCl₂1μL、F-primer0.2μL(上海捷瑞生物有限公司)、R-primer0.2μL(上海捷瑞生物有限公司)、Taq酶0.2μL(Thermoscientific公司)、ddH₂O6.2μL；

PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm30s，72℃40s；延伸72℃1m，最终10℃保存；所用PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。

3)对PCR产物加4μL溴酚蓝缓冲液，上样量为1μL，进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(500mL8％丙烯酰胺含尿素210g，甲叉1g，丙烯酰胺39g，10×TBE50ml)，120V电压下电泳120min，所用电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYCZ-30A型垂直电泳仪。

4)电泳完成后进行固定染色，固定10min(固定液10％乙醇，0.5％乙酸)，ddH₂O漂洗2次每次2min；再用0.15％硝酸银染色7min，ddH₂O漂洗2次每次2min，最后显影(1.5％氢氧化钠，0.00756％四硼酸钠，1％甲醛)至条带清晰，然后对扩增产物进行大小判断，并拍照记录。

5)依据读带情况对照不同品种指纹代码，即可完成鉴定。

实施例4

选择10个银杏品种(2个已知品种和8个疑似品种)，进行鉴定验证，具体步骤如实施例3。结果显示，鉴定出各品种所需引物数各不相同，具体鉴定结果如表3所示。

表310个银杏品种鉴定结果

样品12345678鉴定结果桂林7号ABCC桂林7号叶籽银杏DECCCC大龙眼(无翅)待测样品1AD郯城231待测样品2AFCF延安1号待测样品3BCACCC长兴3号待测样品4AFDFCCCD铁马3号待测样品5CEEGCCCCAA洞庭佛手待测样品6--------非银杏待测样品7AFDFBBCCCCBBAA曹1号待测样品8DECECCCCBBBCBBBB大佛指

注：数字编号所对应引物见实施例1中表1；-代表无扩增条带；

实施例5

选择4个银杏品种利用本发明进行鉴定，同时从实施例1中的176对EST-SSR和82对基因组SSR多态引物随机选择3对并对其进行鉴定。引物信息及鉴定结果如表4、表5所示。本发明中的引物组合可完成鉴定，而选取的3对引物无法完成品种鉴定。

表4随机选取3对引物信息

此外，任意选择48个品种中的6个银杏品种，利用本发明的8对SSR引物进行PCR扩增，具体方法如实施例3，结果如图2所示，显示不同引物扩增位点各不相同，表明本发明引物具有较高的灵敏性和特异性。

表53个银杏品种鉴定结果

样品123鉴定结果ABC鉴定结果待测样品1AFCE玉坠5号AAACAB无法鉴别

待测样品2BCCC滕久郎AABBAB无法鉴别待测样品3CEEECC郯城207AAACAB无法鉴别待测样品4DF泰兴2号AABBAB无法鉴别

注：各编号对应引物名称见实施例1中表1和实施例5中表4。

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>一种银杏品种分子检测引物组合物及其品种检测方法

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