一种杀优洛菌素链霉菌和含有杀优洛菌素链霉菌的杀菌剂及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种杀优洛菌素链霉菌和含有杀优洛菌素链霉菌的杀菌剂及其制备方法和应用，可高效抗植物病原真菌。本发明涉及抗植物病原真菌的杀优洛菌素链霉菌为杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomyces？sp.HU2014)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2015年4月7日，保藏号为CCTCC？NO:M2015207。本发明的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomyces？sp.HU2014)菌株，具有广泛的抗植物病原真菌活性，加以开发利用，可开发出适于农作物病害防治，且对环境和非靶标生物安全的高效、低毒微生物杀菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及抗植物病原真菌的菌株及其应用，具体涉及一种杀优洛菌素链霉菌和含有杀优洛菌素链霉菌的杀菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

微生物杀菌剂是利用微生物的寄生、拮抗、竞争、溶菌等作用来抑制甚至灭杀植物病原微生物生长的生物制剂。微生物杀菌剂开发潜力巨大、应用前景广阔，将可能成为继微生物杀虫剂之后第二个重要的商品化生物农药。

自然界中的有害细菌、真菌和病毒等是引起大量植物病害的主要原因之一，如农作物中常见的引起水稻纹枯病、棉花立枯病的立枯丝核菌等。在过去的几十年中，人们大都采用抗病品种与化学防治的方法对植物病害进行防治，取得了良好的成效。然而随着化学农药使用量的增大及使用范围的扩张，特别是高毒、高残留化学农药的持续使用，使得农药对环境的负面影响日趋严重。社会的进步和人类的发展要求开发出新型环保型农药产品，能够保护农产品稳产高产，又不影响农产品质量，不影响生态环境和其它生物安全。农药研究人员发现从生物中寻找防治有害生物的活性物质最有可能达到选择性强、效率高、成本低、不污染环境、对人畜无害的理想要求。有效利用微生物间的拮抗作用及其代谢产物的有效活性成分制备生物农药进行有害生物防治将是一个必然的发展方向。

微生物源农药不仅具有高效、安全、低残留、易降解等特点，而且微生物源农药作用机理复杂，作用位点多样，能够有效的抑制害物抗药性的发展，因此倍受人们所关注。放线菌是应用最广泛的生防微生物之一，是具有巨大实用价值的一类微生物。目前从微生物发现的大约8000种生物活性物质中，近70％是由放线菌产生的。放线菌产生的抗生素在农作物病虫害防治方面有重要作用。目前，主要应用的农用抗生素有9种，如杀菌剂有春日霉素、链霉素、多氧霉素、有效霉素、灰黄霉素、灭瘟素、灭胞素；杀螨剂有杀螨素；除草剂有双丙胺麟等。我国农用抗生素的研究和应用始于20世纪50年代初。我国于20世纪60年代研制成功了放线菌酮和灭瘟素，70年代研制成功了春雷霉素、庆丰霉素、井冈霉素、多抗霉素，80年代研制成功了公主岭霉素、多效霉素、农抗120、浏阳霉素、莫能霉素等抗生素，90年代又研制成功了阿维菌素、中生菌素、宁南霉素和华光霉素等农用抗生素品种。在微生物农药的研究与开发领域做出了重大贡献。

杀优洛菌素链霉菌(Streptomyceseurocidicus)的研究始于上世纪中页。Osata(1955年)和Lancini(1967年)等人先后从杀优洛菌素链霉菌(Streptomyceseurocidicus)菌株中分离到叔霉素(tertiomycin)、优洛杀菌素(eurocidin)和氮霉素(azomycin)等特殊结构。但关于杀优洛菌素链霉菌的抗真菌活性未见研究与报道。本发明确定杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)对抗植物病原真菌具有较强的抗菌活性，在不同种类病原真菌间具备一定的选择性。该菌株代谢产物及菌体提取物对小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)等病原真菌均有很好的抑制效果，适用于开展植物病害领域的的防治研究。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种杀优洛菌素链霉菌和含有杀优洛菌素链霉菌的杀菌剂及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：一种杀优洛菌素链霉菌，所述杀优洛菌素链霉菌为杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M2015207。

本发明的另一目的在于提供一种抗植物病原真菌的杀菌剂，包含上述的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)。

作为本发明的优选实施方式，所述杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)的发酵培养基质为包括：酵母提取物5g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖20g，加入1000mL水后加热溶解，初始pH值为7.0。

本发明进一步改进是：所述杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)的发酵培养基为ME、GYM、GPY、PS或PD。

一种上述的杀优洛菌素链霉菌在制备抑制水稻纹枯病菌、灰霉病菌、小麦纹枯病菌XW药物中的应用。

本发明具有积极有益的效果：

本发明提供了防治作物中一些病害的微生物杀菌剂，其中杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)发酵产物对小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌和灰霉病菌等病原真菌均有很好的抑制效果，并具有广泛的温度、酸碱适应性和储藏稳定性，适于用于农作物病害防治加以开发利用。

本发明所述的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)已经保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)在PDA培养基、高氏一号培养基、ISP2和ISP5培养基中，生长状况良好，基内菌丝发达，淡黄色至黄色，气生菌丝丰富，白色。在ISP1培养基和LB培养基中菌落较湿润，基内菌丝发达，黄色，气生菌丝较稀疏，其中，在LB培养基上有黄色可溶性色素生成。在ISP4和ISP7培养基中生长状况一般，菌落略稀少，气生菌丝较不发达，基内菌丝淡黄色。在ISP3培养基和蔡氏培养基中生长状况较差，菌落少且细小，生长缓慢，气生菌丝白色。在显微镜下观察，菌种气生菌丝丰富，孢子丝波曲形至松螺旋形。

参照《链霉菌鉴定手册》对杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)进行鉴定，可初步鉴定该菌种为链霉菌属白色类群白孢亚群。

本发明的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)与NCBI数据库中相近菌株进行同源性比对分析，与链霉菌属(Streptomyces)的16SrDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、鉴定其为链霉菌属(Streptomyces)杀优洛菌素链霉菌(Streptomyceseurocidicus)。

附图说明

图1为杀优洛菌素链霉菌HU2014与NCBI数据库中相近菌株进行同源性比对构建的系统发育树图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

实施例1：

本实施方式抑制植物病原真菌的杀优洛菌素链霉菌为杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2015年4月7日，保藏号为CCTCCNO：M2015207。

本发明的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)在PDA培养基、高氏一号培养基、ISP2和ISP5培养基中，生长状况良好，基内菌丝发达，淡黄色至黄色，气生菌丝丰富，白色。在ISP1培养基和LB培养基中菌落较湿润，基内菌丝发达，黄色，气生菌丝较稀疏，其中，在LB培养基上有黄色可溶性色素生成。在ISP4和ISP7培养基中生长状况一般，菌落略稀少，气生菌丝较不发达，基内菌丝淡黄色。在ISP3培养基和蔡氏培养基中生长状况较差，菌落少且细小，生长缓慢，气生菌丝白色。在显微镜下观察，菌种气生菌丝丰富，孢子丝波曲形至松螺旋形。

参照《链霉菌鉴定手册》和国际链霉菌计划(ISP)对杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)生长形态进行鉴定，可初步判断该菌种为链霉菌属白色类群白孢亚群。

本发明的杀优洛菌素链霉菌HU2014(Streptomycessp.HU2014)与NCBI数据库中相近菌株进行同源性比对分析，与链霉菌属(Streptomyces)的16SrDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、鉴定结果确定其为链霉菌属(Streptomyces)杀优洛菌素链霉菌(Streptomyceseurocidicus)菌株。

实施例2：杀优洛菌素链霉菌HU2014菌体抑菌活性测定

将杀优洛菌素链霉菌HU2014预先培养制备成菌悬液，浓度为1×10⁵cfu/mL。将1mL菌悬液用熔化的PDA培养基定容至10mL，混匀后制备成带菌平板，用灭菌后的打孔器(直径为4mm)在预培养的灰霉病菌(Botrytiscinerea)，小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)，小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)，水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)，辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和苹果炭疽病菌(Glomrerllacigulata)的菌落边缘打制菌饼，按无菌操作将菌饼倒扣在带菌平板中央，每处理重复3次。设置等量的灭菌水作为对照。接好菌种的平板放入恒温培养箱(25±1℃)培养，用十字交叉法分别测量72h的菌落直径，按以下公式计算抑制率，结果见表1。

菌落生长直径＝菌落直径-4

表1杀优洛菌素链霉菌HU2014菌体抑菌活性

注：表中数据为三次重复的平均值，同列数据后不同字母表示数据间差异显著(P＜0.05，Duncan新复极差法)；“-”表示未检测到抑菌活性。

抑菌活性结果表明带菌平板对水稻纹枯病菌、灰霉病菌、小麦纹枯病菌有较好的抑菌效果。

实施例3：杀优洛菌素链霉菌HU2014发酵培养基优化

(1)培养基

ME培养基：麦芽提取物20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，自来水1000mL，加热溶解，pH为7.0左右。

PD培养基：洗净去皮的马铃薯200g，切片，自来水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加水补足至1000mL，再加葡萄糖12g，加热溶解，pH为7.0左右。

PS培养基：洗净去皮的马铃薯200g，切片，自来水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加水补足至1000mL，再加蔗糖12g，加热溶解，pH为7.0左右。

GPY培养基：酵母提取物5g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖20g，自来水1000mL，加热溶解，pH为7.0左右。

GYM培养基：麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，自来水1000mL，加热溶解，pH为7.0左右。

(2)发酵培养药剂制作方法

将预先用PD培养基制作好的杀优洛菌素链霉菌HU2014种子定量接种到以上不同培养基中，在恒温振荡器25℃培养1个月，得到五种发酵液，用孔径0.45μm滤膜过滤后得滤液。

(3)供试菌种

水稻纹枯病菌，灰霉病菌，小麦纹枯病菌。供试菌种提前一周转接至PDA平板上供试。

(4)试验方法

采用生长速率法对不同培养基的发酵液的抑菌活性进行测定。用移液枪吸取1mL过滤好的发酵液于刻度试管中，用熔化的PDA培养基定容至10mL，混匀后倒入直径90mm培皿中制成带药平板。再用移液枪吸取2mL过滤好的发酵液于25mL刻度试管，用熔化的PDA培养基定容至10mL，混匀后倒入直径90mm培皿中制成带药平板。以上混药平板中发酵液的浓度分别为10倍稀释和5倍稀释。用灭菌后的打孔器在培养好的供试菌种上打菌饼(直径为4mm)，然后将菌饼倒扣在带药平板中央，每处理重复3次。设置等量的PDA培养基作为对照，对照重复3次。接好的菌种平板放入恒温培养箱(25±1℃)培养，用十字交叉法分别测量48h和72h的菌落直径。按实施例1中的公式计算抑制率。

表2五种培养基发酵产物对水稻纹枯病菌抑菌活性

注：表中数据为三次重复的平均值，同列数据后不同字母表示数据间差异显著(P＜0.05，Duncan新复极差法)

表35种培养基发酵产物对灰霉病菌抑菌活性

注：表中数据为三次重复的平均值，同列数据后不同字母表示数据间差异显著(P＜0.05，Duncan新复极差法)

表45种培养基发酵产物对小麦纹枯病菌抑菌活性

注：表中数据为三次重复的平均值，同列数据后不同字母表示数据间差异显著(P＜0.05，Duncan新复极差法)

(5)结果分析

活性测定结果表明，GPY培养基的提取物对水稻纹枯病菌的抑制率在89.36％～100.00％之间，对灰霉病菌的抑制率在76.44％～98.26％之间，对小麦纹枯病菌XW的抑菌率在94.08％～100.00％之间。GPY培养产物对供试3种病原菌具有较好的抗菌活性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。