一种新型水产养殖益生菌剂及其生产方法和用途

摘要

本发明涉及一种新型水产养殖益生菌剂及其生产和用途，属于饲料添加剂、水产养殖和生物技术领域。本发明采用的菌株是枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SZX11菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC？No.8188。本发明是以无机盐、维生素、微量元素与枸杞、香菇、马齿苋、地锦草提取物复合而成的培养基，接种SZX11株进行好氧发酵，制成活菌含量≥2×109CFU/mL的菌剂，该菌剂含有丰富的活性多糖和活菌体及其代谢产物全组分。将该菌剂混入南美白对虾饲料，对南美白对虾的肠道病害和免疫失调有良好的预防作用。可以显著提高养殖成活率和产量，显示出这种新型水产养殖益生菌剂具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种复合生物提取物经枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SZX11菌株发酵制成活菌制剂的生产方法及其在对虾养殖中的应用，属于饲料添加剂、水产养殖和生物技术领域。

背景技术

2005年我国的南美白对虾淡、海水总养殖面积达到150万亩，至2010年仅淡水养殖南美白对虾的面积就达140万亩；加上海水养殖近300万亩，产量90-100万吨。但自2011年以来，南美白对虾养殖的成功率越来越低，病害死亡率越来越高，多数地区排塘率50%以上；到2011年上半年在海南、广东和广西这些省份的产量比同期下降了80%以上，给白对虾养殖业带来巨大损失。其主要原因是白对虾白斑病、胃肠道病害和肝胰脏坏死综合症蔓延，使这一行业遇到了前所未有的困难。

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，大小(0.8~1.2)μm×(1.5~4.0)μm，革兰氏染色阳性，可产荚膜，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。随着对枯草芽孢杆菌研究的不断深入，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值。例如：中国发明专利（申请号：201110116641.X）中公开了一株枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.4628，具有良好的抗逆性功能和益生功能：可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液、可以耐受0.3％的人工胆盐、可以耐受80℃的制粒温度；对大肠杆菌K88、K99和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，产纤维素酶能力较强，可以降解纤维素；该菌株用于制备饲料添加剂，可提高动物免疫力和饲料转化率。

利用中草药添加剂防治对虾病害的技术也有文献报道，例如：中国发明专利（申请号：201010109404.6）中公开了一种对虾饲料的中草药添加剂，其组成包括：穿心莲1-9份，通天藤1-9份，龙胆草2-8份，益母草3-20份，鱼腥草1-9份；这种中草药添加剂不仅具有调节对虾机体平衡与生理功能，提高对虾机体特异性和非特异性免疫力，提高消化吸收，促进生长的作用，而且富含对虾生长必需的矿物质及少量碳水化合物和蛋白质，并且不会产生耐药性，无药物残留，不会影响消费群体的身体健康和环境安全。

本发明将采用中草药提取物为主要培养基原料，以枯草芽孢杆菌SZX11菌株为益生菌发酵菌种，制备南美白对虾养殖的新型饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型水产养殖益生菌剂及其生产和使用方法。

本发明所使用的菌株是由发明人从自然界分离筛选出来的一株具有动物益生作用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SZX11菌株，该菌株于2013年9月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.8188，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的水产养殖益生菌剂的生产方法如下：

（1）液体菌种的制备：所用菌种培养基配制方法（以1L为例）：磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钙50mg，硫酸铵0.5g，硫酸镁300mg，硫酸锰4mg，硫酸铜2mg，钼酸钠0.6mg，对氨基苯甲酸0.25mg，生物素、维生素B1、维生素B6、烟酰胺各0.2mg，葡萄糖6.2g，蒸馏水1升；用氢氧化钠溶液调pH至6.8-7.8，分装到500mL三角瓶中，每瓶200mL培养基，于121℃灭菌20min；灭菌的培养基降温至30-35℃，在无菌操作台接种斜面保存的菌种，置于恒温振荡器，恒温30℃-35℃；转速150r/min,避光震荡培养30h制成液体菌种，菌种枯草芽孢杆菌含量4×10⁹CFU/mL。

（2）枯草芽孢杆菌所用复合中药培养液制备方法（以1000L为例）：选购无腐烂、虫蛀、霉变的枸杞子、香菇、马齿苋、地锦草优质干品各15kg，投放到2000L中药提取罐内，加水至1100-1200L，浸泡1h后50-60转/min搅拌加温，加温至100℃搅拌1h，降温至40℃-50℃过滤，收集滤液约1000L。称取磷酸二氢钾600g，磷酸氢二钾300g，氯化钙30g，硫酸铵300g，硫酸镁180g，葡萄糖1800g，乳酸1000mL，加入到滤液搅拌均匀，如总量不足1000L时加水至1000L，用氢氧化钠溶液调pH至6.8-7.8；115℃灭菌20min。

（3）灭菌后的复合中药培养液降温至30℃-35℃接种第（1）步得到的枯草芽孢杆菌液体菌种；接种量5%-10%，于恒温30℃-35℃的发酵罐中，通入净化空气发酵28-30h；制成液体菌悬液，菌液枯草芽孢杆菌含量≥2×10⁹CFU/mL，即得到一种新型水产养殖益生菌剂。质检后灌装，于阴凉干燥处保存。

本发明所述的水产养殖益生菌剂的使用方法如下：

1、将上述水产养殖益生菌剂按饲料重量的1%-3%添加入饲料中，混合均匀；

2、每日添加2次；早、晚各拌喂一次，提前1-2小时预混，使菌剂充分渗透到饲料中；

3、投喂时将拌混均匀的饲料直接投放到养殖池塘的料台上。

具体实施方式：

实施例1：水产养殖益生菌剂的生产方法

（1）液体菌种的制备：称取磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钙50mg，硫酸铵0.5g，硫酸镁300mg，硫酸锰4mg，硫酸铜2mg，钼酸钠0.6mg，对氨基苯甲酸0.25mg，生物素、维生素B1、维生素B6、烟酰胺各0.2mg，葡萄糖6.2g，蒸馏水1升；用氢氧化钠溶液调pH至7.5，分装到500mL三角瓶中，每瓶200mL培养基，于121℃灭菌20min；灭菌的培养基降温至35℃，在无菌操作台接种斜面保存的菌种，置于恒温振荡器，恒温35℃；转速150r/min,避光震荡培养30h制成液体菌种，菌种枯草芽孢杆菌含量4×10⁹CFU/mL。

2、枯草芽孢杆菌所用复合中药培养液制备方法（以1000L为例）：选购无腐烂、虫蛀、霉变的枸杞子、香菇、马齿苋、地锦草优质干品各15kg，投放到2000L中药提取罐内，加水至1100L，浸泡1h后50转/min搅拌加温，加温至100℃搅拌1h，降温至50℃过滤，收集滤液约1000L。称取磷酸二氢钾600g，磷酸氢二钾300g，氯化钙30g，硫酸铵300g，硫酸镁180g，葡萄糖1800g，乳酸1000mL，加入到滤液搅拌均匀，如总量不足1000L时加水至1000L，用氢氧化钠溶液调pH至7.5；115℃灭菌20min。

3、灭菌后的复合中药培养液降温至35℃接种第（1）步得到的枯草芽孢杆菌液体菌种；接种量10%，于恒温35℃的发酵罐中，通入净化空气发酵28h；制成液体菌悬液，菌液枯草芽孢杆菌含量≥2×10⁹CFU/mL，即得到一种新型水产养殖益生菌剂。质检后灌装，于阴凉干燥处保存。

实施例2：南美白对虾80天喂养实验

地点：广东省番禺区海鸥岛梁建新虾场，低盐度土塘精养塘。

实验方法：采用同批次虾苗，同日投放。选用正大饲料，设定实验1按1.5%、实验2按2.0%、实验3按2.5%拌喂上述饲料添加剂，每天早晚拌喂两次。对照组拌喂同等量温开水，每天从排底污管套网中收集死虾计数。

养殖水体平均盐度1.5/1000；平均水温27℃；时间：2013年9.20-12.10

实施例3、南美白对虾90天喂养实验

地点：广东省湛江市麻章区湖光镇黄景明虾场高盐度高位养殖塘。

实验方法：采用同批次正大虾苗，选用正大饲料。设定实验1按1.5%、实验2按2.0%、实验3按2.5%拌喂上述饲料添加剂，每天早晚拌喂两次。对照组拌喂同等量温开水。每天从排底污管套网中收集死虾计数。

养殖水体平均盐度14/1000；平均水温29.6℃；时间：2013年8.16-11.17

实施例4、南美白对虾90天喂养实验

地点：广东省湛江市东海岛林场骆小龙虾场中盐度高位冬棚养殖塘。

实验方法：采用同批次正大虾苗，选广东粤海饲料，设定实验1按1.5%、实验2按2.0%、实验3按2.5%拌喂上述饲料添加剂，每天早晚拌喂两次。对照组拌喂同等量温开水，每天从排底污管套网中收集死虾计数。

养殖水体平均盐度8/1000；平均水温24.5℃；2013年10月19日-2014年1月20日

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