一种秸秆还田纤维分解性生防真菌及菌剂和应用

摘要

本发明提出一种秸秆还田纤维分解性生防真菌及菌剂和应用，其中该菌株F7JX993849的分类命名为绿木霉Trichoderma？virens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC？No.3.17613。本发明的绿木霉Trichoderma？virens？F7JX993849对农作物秸秆中的纤维素、半纤维素和果胶组分同时具有较强的分解能力。其次，本发明的绿木霉Trichoderma？virens？F7JX993849可以拮抗植物病源菌入侵，具有生物防治功能。再次，本发明的秸秆还田纤维分解性生防真菌所制成的菌剂，可以解决一般秸秆腐熟剂在应用过程中效果不理想、不稳定的问题，具有良好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其涉及一种秸秆还田纤维分解性生防真菌及菌剂和应用。

背景技术

我国作物秸秆养分资源十分丰富，利用秸秆还田技术将农作物秸秆转化为优质的有机肥，可以实现农田生态系统中物质的良性循环，能够有效的解决因重复耕种导致的土壤养分耗竭、肥力下降等问题，也能有效控制农村大气环境污染，是实现我国农业可持续发展和农村生态环境建设的重要措施。但是传统的秸秆原位还田技术中秸秆的降解速度缓慢，秸秆中的养分不能为当季作物充分利用，影响土壤耕作、种子萌发和作物苗期生长，此外还致使一些虫害和病原菌在土壤中长时间存活，给作物带来潜在危害，从而限制了其推广应用。

环境中的微生物可以通过生物催化作用对秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素等组分进行有效降解，从而达到农作物秸秆高效还田的目的。真菌一般具有相对完整的酶系，对农作物秸秆的降解能力更为强大，尤其是生防真菌在加速秸秆降解的过程中，还可以对植物的病害进行生物防治。如果在秸秆机械还田的基础上，配合接种筛选的高效分解生防真菌，必将能够加速和优化农作物秸秆的腐熟过程，对提高秸秆利用效率、防治病虫害、强化土壤有机质积累，改善土壤结构，提高土壤肥力水平具有重要作用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种秸秆还田纤维分解性生防真菌及其应用，该菌不仅具有较强的纤维素酶、半纤维素和果胶较强的分解能力，同时还具有潜在的抑制植物病原菌的能力，从而加速和优化了农作物秸秆的腐熟过程。其是通过以下技术方案实现的：一种秸秆还田纤维分解性生防真菌，该菌株F7JX993849的分类命名为绿木霉Trichodermavirens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.3.17613。

优选的，所述绿木霉F7JX993849对辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、西瓜蔓枯病菌、苹果腐烂病菌有抑菌作用。

其次，秸秆还田纤维分解性生防真菌在腐解水稻秸秆中的应用。

此外，本发明还提出一种含有上述秸秆还田纤维分解性生防真菌的腐熟菌剂，其是通过下述制备方法而成，A、种子液的制备：将绿木霉F7JX993849菌株的原始菌株无菌条件下接种于PDA固体培养基上，30℃，培养2d；将活化后的菌种无菌条件下接种于种子培养基中，30℃，180rpm条件下培养72h，制得种子液；B、发酵菌种的培养：将步骤A制得的种子液按液体发酵培养基体积比为20％的接种量，将种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，得到发酵菌种；C、腐熟菌剂的制成：将步骤B得到的发酵培养菌种接种于装有麦麸的固体发酵设备中，发酵培养7d后，经过常温干燥，粉碎后即可得本发明的F7JX993849腐熟菌剂成品。

进一步地，种子培养基组分为：葡萄糖20g，酵母膏1.0g，(NH₄)₂SO₄0.4g，KH₂PO₄0.25g，蛋白胨0.1g，MgSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水定容到1000mL。

进一步地，所述液体发酵培养基配方按质量百分比为：糖蜜15％，(NH₄)₂SO₄0.5％，蛋白胨0.5％、CaCO₃为3％、余量为水。

进一步地，所述高密度发酵期间通气量为15L/min，搅拌速度为300r/min，发酵温度30℃。

再次，本发明还提出含有秸秆还田纤维分解性生防真菌的腐熟菌剂在水稻秸秆还田中的应用。

进一步地，施用该腐熟菌剂提高了秸秆的腐解速度和有机质释放速度。

进一步地，将该腐熟菌剂应用于水稻秸秆，水稻秸秆的腐解率和有机质释放率分别为54.38％和49.76％。

本发明相对于现有技术所具有的优点为：本发明的绿木霉TrichodermavirensF7JX993849对农作物秸秆中的纤维素、半纤维素和果胶组分同时具有较强的分解能力。其次，本发明的绿木霉TrichodermavirensF7JX993849可以拮抗植物病原菌入侵，具有生物防治功能。再次，本发明的秸秆还田纤维分解性生防真菌所制成的菌剂，可以解决一般秸秆腐熟剂在应用过程中效果不理想、不稳定的问题，具有良好的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明绿木霉平板图。

图2为本发明绿木霉18SrDNAITS序列电泳图(marker从上到下依次为：1000，700，500，400，300，200和100bp)。

图3为水稻秸秆的腐解率。

图4为水稻秸秆腐解过程中有机质的释放率。

生物材料样品保藏信息：

绿木霉TrichodermavirensF7JX993849，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年6月29日，保藏编号为CGMCCNo.3.17613。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一，绿木霉F7JX993849的筛选

一、菌株的分离及纯化

采集水稻秸秆还田土壤样品5g，置于含有100mL富集培养基的摇瓶中，培养温度30℃，摇床转速为180rpm，恒温培养。每隔4d，以10％接种量接入另一富集培养基中，如此反复驯化5次。富集培养基采用水稻秸秆粉为唯一碳源。

取150μL经上述训化后的富集培养液在羧甲基纤维素钠-刚果红培养基上涂布，30℃，培养4d。挑取水解圈直径较大的菌体转接到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的无机盐培养基中，连续继代培养10代以上。边传代边挑选出降解能力保持较好的样品，以致驯化出高效和稳定的纤维素降解菌。菌落形态稳定后，即得纯培养，如图1所示。

二、绿木霉F7JX993849菌株的鉴定

A：形态特征：

该菌株在PDA培养基上广铺，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实丛束区，最后整个菌落全部变成绿色。用电镜观察绿木霉F7JX993849菌丝及孢子，菌丝透明、有隔、壁光滑、分枝繁复，厚坦孢子出现在菌丝中间，球形，壁光滑，分生孢子梗大部分有侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端，是典型的绿木霉分类特征。

B：分子遗传学分类鉴定：

提取到该菌株的DNA后进行真菌18SrDNAITS序列PCR扩增，将测序结果在NCBI上进行blast比对分析，发现其与绿木霉(Trichodermavirens，登录号为AF099008.1)的DNA序列同源性为99％。结合传统的形态特征鉴定结果，鉴定菌株为木霉，分类种名为绿木霉(Trichodermavirens)。

将该菌株命名为F7JX993849，进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年6月29日，绿木霉TrichodermavirensF7的保藏编号为CGMCCNo.3.17613。

实施例二，绿木霉F7JX993849对秸秆腐解作用的确定

2.1绿木霉F7JX993849菌悬液的制备：

将活化好的绿木霉F7JX993849菌株接种到灭菌的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)液体培养基中，该液体培养基的组分为：CMC-Na2.0g，酵母膏1.0g，(NH₄)₂SO₄0.4g，KH₂PO₄0.25g，蛋白胨0.1g，MgSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.0，28℃，180rpm，振荡培养24h，制成菌悬液即F7JX993849菌悬液。

2.2粗酶液的制备：

将2.1中制得的F7JX993849菌悬液按照5％接种量接种到水稻秸秆培养基中。水稻秸秆培养基的组分为：水稻秸秆干粉5g，酵母膏1.0g，(NH₄)₂SO₄0.4g，KH₂PO₄0.25g，蛋白胨0.1g，MgSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.0，(其中水稻秸秆干粉为水稻秸秆晾干粉碎后，过20目筛)。设置无菌水代替F7菌悬液的对照。28℃，200rpm震荡培养96h，4℃下离心收集发酵液，上清液即为粗酶液。

2.3酶活的测定：

内切型葡聚糖酶(CMCase)酶活测定：取25mL的刻度试管，加入经适当稀释的粗酶液0.5mL和质量分数为1％的CMC-Na缓冲溶液1mL，50℃保温30min。

滤纸酶(FPase)酶活测定：取25mL的刻度试管，加入经适当稀释的粗酶液0.5mL和质量分数为1％的柠檬酸缓冲溶液(pH5.4)1mL，并加入一条1cm×6cm的滤纸，50℃保温1h。

木聚糖酶酶活测定：取25mL的刻度试管，加入经适当稀释的粗酶液0.5mL和质量分数为1％的木聚糖溶液1mL，50℃保温30min。

果胶酶酶活测定：取25mL的刻度试管，加入经适当稀释的粗酶液0.5mL和质量分数为1％的果胶溶液1mL，50℃保温30min。

采用DNS法(Measurementofcellulaseactivities.GhoseTK,1987,PureAppl.Chem.,59:257-268)，分别测定与水稻降解有关的酶：即内切型葡聚糖酶(CMCase)和滤纸酶(FPase)、木聚糖酶和果胶酶的酶活。

测得粗酶液中的CMCase和FPase的活性分别为193.37U/mL和87.18U/mL；测定果胶酶和木聚糖酶的活性为16.53U/mL和39.42U/mL。其中，1mL酶液1min催化底物生成lug单糖为1个酶活单位，以U表示。这说明该菌株对水稻秸秆具有降解作用。

实施例四，菌株对植物病原菌的拮抗作用

本发明采用两点对峙培养法测定绿木霉F7JX993849对植物病原菌拮抗效果。分别在PDA平板上接种绿木霉F7JX993849和供试的4种植物病原菌(辣椒疫霉菌Phytophthoracapsici；番茄灰霉菌Botrytiscinerea；西瓜蔓枯病菌Didymellabryoniae；苹果腐烂病菌Valsaceratosperma)，上述四种病原菌均由青岛农业大学资源与环境学院实验中心分离并保存，本发明中的植物病原菌不局限于上述具体菌株，也可以选用现有技术中已经公开的其他具体菌株。

28℃黑暗条件下培养绿木霉F7JX993849和上述四种植物病原菌3d后，用灭过菌的直径5mm的打孔器沿菌落边缘打菌碟，将绿木霉F7JX993849分别与每种病原菌菌碟接种于PDA平板上，两者相距2-3cm，同时设置只接病原菌的平板作为对照，每处理重复三次。28℃，培养7d，每天定时观察，测量绿木霉F7和病原菌菌落生长的相向半径r木和r病，以及对照半径r0，计算病原菌的生长抑制率。

抑制率(％)＝(r0－r病)/r0×100％

在PDA平板上F7JX993849菌株对4种供试植物病原菌都产生抑菌带，说明F7菌株的某种分泌物可以抑制植物病原菌的生长，具有抗生作用。具体抑菌效果见表1。

表1绿木霉菌株F7JX993849对各病原菌的抑菌效果。

实施例四，绿木霉F7JX993849腐熟菌剂的制备

5.1种子液的制备

将绿木霉F7JX993849菌株的原始菌株无菌条件下接种于PDA固体培养基上，30℃，培养2d。将活化后的菌种无菌条件下接种于种子培养基中，30℃，180rpm条件下培养72h，制得种子液。

其中，种子培养基组分为：葡萄糖20g，酵母膏1.0g，(NH₄)₂SO₄0.4g，KH₂PO₄0.25g，蛋白胨0.1g，MgSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水定容到1000mL。

5.2发酵菌种的培养

按种子液与液体发酵培养基体积比为20％的接种量，将种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，得到发酵菌种。发酵期间通气量为15L/min，搅拌速度为300r/min，发酵温度30℃。

其中，所用的液体发酵培养基配方按质量百分比为：糖蜜15％，(NH₄)₂SO₄0.5％，蛋白胨0.5％、CaCO₃为3％、余量为水。高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为糖蜜，氮源为：(NH₄)₂SO₄、蛋白胨。

5.3腐熟菌剂的制成

将5.2得到的发酵培养菌种接种于装有麦麸的固体发酵设备中，固水比为1∶1.2，接种量为5％，发酵温度为30℃。发酵培养7d后，经过常温干燥，粉碎后即可得本发明的F7JX993849腐熟菌剂成品。

实施例五，绿木霉F7JX993849腐熟菌剂在水稻秸秆还田中的应用

称取刚收获的水稻秸秆35g，将其粉碎成长为2cm左右，取F7JX993849腐熟菌剂1.5g与水稻秸秆充分混匀后得到的混合物作为处理组，水分控制在50％左右，将上述混匀后的水稻秸秆和腐熟剂装入孔径为0.15cm、面积为20×30cm²的尼龙网袋中，于小麦播种后2d还入麦田小区，掩埋深度为10cm，以不添加菌剂的处理作为对照。每种处理的袋数按照取样次数计算；3袋/次×5次＝15袋。处理组和对照组的田间农艺措施(种植时间、作物品种、灌水量、施肥量、农药用量等)保持一致。

在麦季每隔15d分别取出还田的处理组及对照组3只尼龙网袋，用于测定秸秆腐解率和有机质释放率，一共取5次进行测定。每次取样均三个重复。秸秆腐解率＝(原始秸秆重量－剩余秸秆重量)/原始秸秆重量×100％，有机质释放率＝(原始秸秆有机质含量－剩余秸秆有机质含量)/原始秸秆有机质含量×100％。

本发明的含有腐熟菌剂的处理组在整个75天的时间内其秸秆腐熟率和有机质释放率均高于未添加腐熟菌剂的对照组，经过75d的腐解后，参考图3及图4，对照组即未施用腐熟菌剂的水稻秸秆腐解率和有机质释放率分别为42.27％和40.35％。而处理组即施用腐熟菌剂的水稻秸秆腐解率和有机质释放率分别为54.38％和49.76％，处理组的腐解速度和有机质释放速度分别提高了12.11％和9.41％。这说明添加腐熟剂的秸秆腐解速度及有机质释放速度快，如将本腐熟菌剂应用于收获的秸秆并将其投放入当季种植田内有利于增加土壤内有机质的含量，可以解决现有技术中的腐熟菌剂在应用过程中效果不理想、不稳定的问题，具有良好的应用前景。

本发明制得的菌剂作为有机肥的原料之一施用于种植田，从而达到农作物秸秆高效还田的目的。在秸秆机械还田的基础上，配合接种筛选的高效分解生防真菌，必将能够加速和优化农作物秸秆的腐熟过程，对提高秸秆利用效率、防治病虫害、强化土壤有机质积累，改善土壤结构，提高土壤肥力水平具有重要作用。利用微生物可将纤维素最终分解成为二氧化碳和水，而通过微生物自身的生长又可产生大量的菌体蛋白，因此运用微生物法处理秸秆，可以大幅度提高其营养价值，与物理化学方法相比，具有许多无可比拟的优点。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。