一种基于PEG修饰的J亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽

摘要

本发明提供了一种基于PEG修饰的J亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽，提供了一种基于N-末端α-NH

说明书

技术领域

本发明涉及分子免疫学和病毒学领域，具体涉及了一种基于PEG修饰的J 亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一种肿瘤性疾病， 主要临床表现为髓细胞性白血病，并以免疫耐受、高死亡率、生长迟缓和多组 织器官出现肿瘤等为主要特征。持久的免疫应答损害导致继发感染和混合感染 频发，严重危害着养殖业的健康发展。对我国近十年来J亚群禽白血病流行状 况跟踪调查显示，J亚群禽白血病的早期感染、多重感染已相当普遍，呈现高 感染率、高发病率；混合感染多发/频发；肿瘤谱扩展；病理变化日益复杂， 加之严重的免疫抑制降低了群体疫病的基本抵抗力，不仅造成了疾病的多样 性，增加了继发其它疾病的机率，而且显著降低了疫苗对禽群的免疫保护，致 使新城疫、禽流感等一类传染病频频出现免疫失败，对于禽群的健康养殖危害 严重。

由于ALV-J病毒囊膜蛋白的超变性及其自身的免疫逃避能力，加之药物、 疫苗研制的周期性，至今尚无有效控制和防治的药物或疫苗用于临床使用。国 外是通过净化来控制本病的发生。由于净化周期长、成本高、加之多元化的养 殖模式，目前，净化在我国还未能有效实施，大型养殖公司采用净化，但内源 性病毒的误淘问题严重；不合理、不科学的净化措施，还会加速病毒的进化和 突变，使疾病愈加复杂。中小型养殖公司只能通过临床症状观察淘汰鸡只。从 1999年至2014年以来，国内学者对J亚群禽白血病的研究显示：ALV-J的感染 率从未低于10％，基于临床上对J亚群禽白血病防控的技术需求，研制安全高效 的抗J亚群禽白血病毒药物、疫苗成为有效控制J亚群禽白血病亟待解决的问 题。

发明内容

针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种基于PEG修饰的J亚群禽白 血病病毒免疫抑制性多肽，提供了一种基于N-末端α-NH₂PEG修饰的免疫抑制 性多肽(ISU)及其制备方法，采用本发明提供的PEG修饰后的ISU肽与现有技 术中ISU免疫抑制肽相比能更为显著地抑制ALV-J复制，为J亚群禽白血病的 防治和制备PEG化多肽疫苗提供科学基础和技术支撑，有效降低养禽业因ALV-J 感染造成的经济损失。

本发明是基于下述理论基础进行的深入研究获得的：

天然多肽参与调控各种生理功能，在临床应用上具有非常重要的开发价值。 随着小分子化学和大分子蛋白药物开发难度的增大，越来越多地人们把注意力 投向多肽和蛋白质类药物。多肽具有选择性强，特异性强，副作用小，在常温 下更稳定，技术成熟且成本低等特点。但相对半衰期短，体内稳定性差，改造 修饰或与其他材料组成稳定的复合物来提高其稳定性是目前多肽药物研发的热 点。其中应用最广泛的修饰剂为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)及其衍生物。目前， PEG已应用于多种蛋白药物的修饰，如PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素α2a和 2b等多种蛋白质药物已陆续通过FDA批准应用与临床。PEG修饰化药物有如下 优点：改善药物的动力学性质(半衰期延长，清除率下降，血药峰浓度下降)； 血浆药物浓度波动减小；增强药物在体内的活性；降低药物的毒性及免疫原性； 增强药物的理化稳定性并避免蛋白药物的水解；增加蛋白质药物的可溶性等。

ALV-J是具有囊膜的反转录病毒，ALV-J前病毒具有典型慢性转化型反转录 病毒完整的基因结构，基因排列顺序为LTR-Leader-gag-pol-env-LTR主要包 含gag、pol和env三个基因。其中，env基因含有表面膜蛋白合成的遗传信息， 能够编码病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亚单位gp85和跨膜蛋白亚单 位gp37。gp85蛋白是病毒的主要抗原，病毒中和反应的作用位点，含有病毒- 受体决定簇，主要起病毒粘附于易感动物细胞的作用，同时也能诱导有免疫力 的鸡群产生特异性抗体，称为表面膜蛋白(SU)；gp37包含，介导病毒与细胞的 融合过程，称为跨膜蛋白(TM)。TM内包括折叠的一段高度保守的免疫抑制序列 (免疫抑制区)ISU，ISU肽称为免疫抑制性多肽，可以在体内、外抑制淋巴细 胞的活性，由27个氨基酸组成：LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，不同ALV毒 株ISU不存在毒株之间的差异，具有极为显著的临床学意义。(ok)

基于上述的PEG修饰技术，以及J亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽ISU 的研究，发明人获得了本发明的具体技术方案：

人工合成ISU肽并对其鉴定；检测ISU肽的免疫活性；优化高修饰率的 PEG-ISU肽制备条件；检测PEG-ISU肽的修饰率；确证ISU肽与PEG-ISU肽体外 抑制病毒复制效果确定其有效剂量，更为具体步骤如下：

已知禽白血病病毒各亚群代表毒株中TM蛋白内高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，该氨基酸序列如序列表SEQIDNO：1所示， 采用现有技术人工合成上述序列所示的ISU肽，经高效液相色谱法分析纯化，纯 度为97％以上；

上述获得的人工合成ISU肽的免疫活性检测：

通过无菌研磨SPF鸡的脾脏细胞获取实验所需要的淋巴细胞，分别加入人 工合成的ISU肽、ALV-JNX0101病毒液，同时设空白对照组和鸡IgG作为无关蛋 白组，培养12h后经流式细胞定量检测；结果显示，接种人工合成ISU肽和ALV-J NX0101两个组的CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞明显少于接种无关蛋白鸡IgG 和空白对照组。由此可见，人工合成ISU肽对淋巴细胞的生长具有良好的抑制 作用。由于ALV-JNX0101感染细胞后需要经过对淋巴细胞进行一系列作用才能 产生免疫抑制效果，因此，12h后检测结果显示人工合成ISU肽直接作用于淋巴 细胞的抑制效果比相同条件下ALV-JNX0101产生的抑制效果更明显；

对mPEG-ALD修饰ISU肽的制备条件筛选：首先设置mPEG-ALD的初始修饰 条件：蛋白质的反应浓度为1.6mg/mL，反应物摩尔质量比ISU：PEG＝1:5，NaBH₃CN 的终浓度1mg/ml，反应体系的pH为5，反应温度为4℃，修饰反应时间为 24h，加入过量甘氨酸终止反应。分别对初始修饰条件中的PH、反应物的摩尔比、 反应时间、反应温度进行优化。结果显示，在50mmol/L磷酸盐缓冲液中，pH＝6.0、 4℃(PEG/protein)摩尔比为3:1，反应24h为PEG-ALD修饰的最优条件。 其具体过程如下：

在pH＝6的磷酸盐缓冲液中，取适量的ISU肽，使其反应浓度为1.6mg/mL； 再加入一定量NaBH₃CN，使其终浓度为1mg/ml；之后按反应物摩尔比ISU：PEG＝1:3 来称取mPEG-ALD并加入到上述溶液中，在4℃下充分搅拌混匀24h后加入过量 的甘氨酸终止反应即得PEG修饰后的ISU肽，即目标产物PEG-ISU肽。

PEG-ISU肽与ISU肽在体外抑制病毒复制检测：对ALV-JNX0101病毒进行 TCID₅₀测定，结果显示其TCID₅₀＝10^-4.5/100μL，说明ALV-JNX0101稀释10^4.5接 种100μL可使50％的细胞感染该病毒。将ISU肽与PEG-ISU肽分别接种在已经 接种ALV-J中国野毒株NX0101的DF1细胞上，以同等条件下只接种同剂量ALV-J 中国野毒株NX0101的细胞作为阳性对照，正常细胞作为阴性对照，提取细胞RNA， 荧光定量PCR法进行病毒含量检测。结果显示，DF1细胞维持培养7天后，ISU 组与PEG-ISU组病毒含量均低于仅接种ALV-J组，而且PEG-ISU组病毒含量低 于ISU组，说明经过PEG修饰的ISU具有比单纯的ISU更好的免疫效果。

PEG-ISU抑制病毒复制有效剂量的检测：将DF1细胞接种30μL TCID₅₀＝10^-4.5/100μL的ALV-J中国野毒株NX0101，12h后接种2倍比稀释的 PEG-ISU，以同等条件下只接种同等剂量ALV-J中国野毒株NX0101的细胞作为 阳性对照，正常细胞作为阴性对照，培养2天后，提取细胞RNA，荧光定量PCR 法检测病毒含量。结果显示，接种2倍比稀释PEG-ISU的4个组中，病毒含量 均明显低于仅接ALV-J的阳性对照组。与正常组检测结果对比，发现30μL 1.6mg/mL的PEG-ISU肽可以完全抑制30μLTCID_50＝10^-4.5/100μLALV-J复制， 并且在一定范围内随着多抗接种量的减少病毒含量增多。由此可见，PEG-ISU肽 能明显地抑制ALV-J复制，且PEG-ISU肽的最适浓度为1.6mg/mL。

综上所述，与现有技术相比，本发明提供了提供了mPEG-ALD修饰ISU肽的 具体制备条件和制病毒复制的有效剂量，进而提供了一种可有效控制J亚群禽 白血病病毒感染的方法，解决了养禽业J亚群禽白血病病毒感染有效控制的难 题，与传统方法相比较，能大幅度的降低J亚群禽白血病造成的直接和间接经 济损失，开创了禽肿瘤性病毒防治研究的新思路。

附图说明

图1为人工合成的ISU肽HPLC纯化图；

图2为人工合成的ISU肽的MS鉴定图；

图3为人工合成的ISU肽I体外免疫活性流式细胞定量检测结果示意图；

图4和图5为图3的柱状示意图；

图6-10为mPEG-ALD修饰ISU肽的制备条件筛选过程参考图；

图11为PEG单修饰率检测结果示意图；

图12为RNA电泳及荧光定量PCR结果结果示意图。

具体实施方式

本实施例中除特殊说明外，其他均采用现有技术完成。

实施例1人工合成ISU肽并对其鉴定

根据已知禽白血病病毒各亚群代表毒株中TM蛋白内高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，该氨基酸序列如序列表SEQIDNO：1所示， 采用现有技术人工合成上述序列所示的ISU肽。经高效液相色谱法分析纯化(如 图1所示)和MS鉴定(如图2所示)，鉴定其纯度为97％以上。

实施例2ISU肽的免疫活性检测

通过无菌研磨SPF鸡的脾脏细胞获取实验所需要的淋巴细胞，为ISU免疫 活性实验提供所必需的实验细胞。将来源于脾脏的淋巴细胞培养于12孔细胞培 养板，经过细胞计数调整细胞密度为1.0×10⁶/孔，分成4个组别，组别1加入 ISU肽浓度为每孔20μg/ml，组别2加入30μlALV-JNX0101病毒液，组别3 加入鸡IgG作为无关蛋白对照，浓度为每孔20μg/ml，组别4以正常生长的淋 巴细胞作为空白对照，然后相同条件下，每组别做3个平行对照，在37℃的5％ CO₂培养箱内培养12h后进行流式细胞定量检测。

流式细胞术的检测方法

收集脾细胞，分别加入2％FacsBuffer溶液1ml，吹匀，4℃2000rpm离心 5min，然后倒掉上清液。加入2％FacsBuffer溶液200μL，吹匀。每管取出 10μL加入三管，作为阴性对照组、CD4⁺抗体单染组和CD8⁺抗体单染组，然后4 ℃2000rpm离心5min，然后倒掉上清液，加入适量的CD4⁺抗体和CD8⁺抗体混合 液，CD4⁺抗体单染组和CD8⁺抗体单染组分别只加入适量的CD4⁺抗体液和CD8⁺抗体 液，然后分别吹匀，4℃避光染色30min。分别加入2％FacsBuffer溶液1ml冲 洗，4℃2000rpm离心5min，然后倒掉上清液。分别加入100-200μL2％多聚甲 醛吹匀后4℃固定，然后在流式细胞仪上进行检测。检测结果如图3-5所示，通 过分析，接种人工ISU肽和ALV-JNX0101两个组的CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋 巴细胞明显少于接种无关蛋白鸡IgG和空白对照组。

实施例3对mPEG-ALD修饰ISU肽的制备条件筛选

1)对修饰缓冲体系的pH优化：分别将磷酸缓冲液按pH梯度调为4、5、 6、7、8、9、10。按一定比例，加入ISU肽。按其5倍质量称取mPEG-ALD，称 取适量NaBH₃CN加入反应体系中，混合均匀后采用SDS-PAGE检测，检测结果 如图6所示，pH＝6时，mPEG-ALD对ISU肽的修饰选择性较好，修饰率最高；

2)对反应物的摩尔比的优化，分别按ISU:PEG摩尔质量比为1:1、1:2、 1:3、1:4、1:5、1:6的比例混合，其他反应条件按初始修饰条件进行，24h后 取样SDS-PAGE检测，检测结果如图7所示,mPEG-ALD修饰ISU肽的最佳反应 物摩尔比为3:1；

3)对反应时间的优化，分别在反应时间6h、12h、24h、30h取样，其他条 件按初始修饰条件进行，采用SDS-PAGE检测修饰结果，检测结果如图8所示， mPEG-ALD在与ISU肽混合24h后修饰率较高；

4)对反应的温度的优化，设置4℃、室温，37℃按照初始修饰条件进行PEG 修饰。其他条件按初始修饰条件进行，取样SDS-PAGE检测，检测结果如图9 所示，温度为4℃时mPEG-ALD在与ISU肽修饰选择性较好；

5)PEG单修饰率检测：通过上述试验分析，在mPEG-ALD最优修饰条件下， SDS-PAGE检验其修饰结果，结果如图10所示，目的条带清晰，杂质条带较少， mPEG-ALD修饰率较高且修饰产物单一；同时采用TNBS法来验证，其修饰率为 97.6％。

通过上述对反应条件的筛选所得出最佳制备方法为：

在pH＝6的50mmol/L磷酸盐缓冲液中，取适量的ISU肽，使其反应浓度为 1.6mg/mL；再加入一定量NaBH₃CN，使其终浓度为1mg/ml；之后按反应物摩尔比 ISU：PEG＝1:3来称取mPEG-ALD并加入到上述溶液中，在4℃下充分搅拌混匀 24h后加入过量的甘氨酸终止反应即得PEG修饰后的ISU肽，即目标产物PEG-ISU 肽。

实施例4ALV-JNX0101病毒TCID₅₀的测定

将病毒接种到96孔微量培养板中，做连续10倍稀释，从10^-1-10^-10，每一稀 释度接种一纵排共8空，每孔100μL；在每孔加入细胞悬液100μL，使细胞量达 到2-3×10⁵个/ml；设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排(100μL生长液+100μL 细胞液)；观察、培养5-7天，按Karber法计算结果，结果如表1所示，其 TCID₅₀＝10^-4.5/100μL，说明ALV-JNX0101稀释10^4.5接种100μL可使50％的细胞 感染该病毒。

表1ALV-JNX0101TCID₅₀测定

Table1DetectionofALV-JNX0101TCID₅₀

Karber法：lgTCID₅₀＝L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数；D：稀释度对数之间的差

S：阳性孔比率总和

lgTCID₅₀＝-1-1×(4.0-0.5)＝-4.5TCID₅₀＝10^-4.5/100μL

实施例5PEG-ISU肽与ISU肽在体外抑制病毒复制检测

将DF1细胞接种于6孔板，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，待细胞 长满单层后，分2个实验组，第1个实验组为30μLTCID50＝10^-4.5/100μL的 ALV-J中国野毒株NX0101接种DF1细胞上，12h后接种ISU肽；第2实验组为 同剂量ALV-J中国野毒株NX0101接种DF1细胞，12h后加入同等剂量的PEG-ISU 肽，37℃温箱(5％CO₂)孵育，2h后换成1％胎牛血清维持液，培养7天，相同 条件下，以免疫前血清分别作以上2个组别的平行对照，然后提取细胞RNA，荧 光定量PCR法进行病毒含量检测。分别以同等条件下只接种同剂量ALV-J中国 野毒株NX0101的细胞作为阳性对照，正常细胞作为阴性对照：

1.细胞RNA提取：

1)收集细胞：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS， 向细胞中加入含有0.25％的胰蛋白酶溶液处理细胞，当细胞脱落细胞板壁时，加 入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中， 300×g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸取所有上清。

2)裂解细胞：轻弹离心管底部，是细胞沉淀松散，加入适量裂解液，涡旋 振荡混匀。

3)将所有溶液转移至过滤柱上(过滤柱放在收集管中)，12000rpm离心2min， 收集滤液。

4)向滤液中加入1倍体积的70％乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入 吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中废液， 将吸附柱放回收集管中。

5)向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管 中废液，将吸附柱放回收集管。

6)DNaseI工作液配制：取10μLDNaseI储存液放入新的RNase-free离 心管中，加入70μLROD溶液，轻柔混匀。

7)向吸附柱中加入80μL的DNaseI工作液，室温放置15min。

8)向吸附柱加入350μL去蛋白液，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中 废液，将吸附柱放回收集管。

9)向吸附柱中加入500μL漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心30-60s， 倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管。

10)重复步骤9

11)12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温放置数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残存的漂洗液，否则会影响后续的RT等实验。

12)将吸附柱转入新的RNase-free的离心管中，加入30-100μLRNase-free ddH₂O室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，于-80℃保存。

2.反转录PCR

检测RNA纯度和浓度，用eppendorfBioPhotometerPlus核酸蛋白测定仪 进行测定，进行反转录PCR。20μL反应体系：

混匀，65℃孵育5min。

总体积20μL混匀，42℃60min，70℃5min。反转录PCR在eppendorfPCR 仪上进行。

3.荧光定量PCR

根据ALV-J中国野毒株NX0101基因组内高度保守的gag基因序列设计目的 引物，引物序列为F:5’-GCAGCGAGATGCGAAGATG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.2 所示，R:5’-CCAGGGAAGGATACAAACCACT-3’其核苷酸序列如SEQIDNO.3所 示，；禽内参基因的引物序列为F:5’-GAACATCATCCCAGCGTCCA-3’，其核苷酸序 列如SEQIDNO.4所示，R:5’-CGGCAGGTCAGGTCAACAAC-3’，其核苷酸序列如 SEQIDNO.5所示，引物由上海BioSune生物技术有限公司合成。25μL反应体 系:12.5μLSYBRPremixExTaqTM(2×)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引 物，2μLDNA，9.5μLdH₂O。采用3步法PCR反应条件：95℃预变性30s；95 ℃变性5s；55℃退火10s；72℃延伸15s，40个循环。

结果如图11所示，DF1细胞维持培养7天后，ISU组与PEG-ISU组病毒含 量均低于仅接种ALV-J组，而且PEG-ISU组病毒含量低于ISU组，说明经过PEG 修饰的ISU具有比单纯的ISU更好的免疫效果。

实施例6PEG-ISU抑制病毒复制有效剂量的检测

将DF1细胞接种30μLTCID₅₀＝10^-4.5/100μL的ALV-J中国野毒株NX0101， 12h后接种2倍比稀释的PEG-ISU，37℃温箱(5％CO₂)孵育，2h后更换为含1％ 胎牛血清的维持液，并分别以同等条件下只接种同等剂量ALV-J中国野毒株 NX0101的细胞作为阳性对照，正常细胞作为阴性对照，培养2天后，提取细胞 RNA，荧光定量PCR法检测病毒含量，具体操作方法与实施例5中相同。结果如 图12所示，接种2倍比稀释PEG-ISU的4个组中，病毒含量均明显低于仅接ALV-J 的阳性对照组。与正常组检测结果对比，发现30μL1.6mg/mL的PEG-ISU肽可 以完全抑制30μLTCID₅₀＝10^-4.5/100μLALV-J复制，并且在一定范围内随着多 抗接种量的减少病毒含量增多。由此可见，PEG-ISU肽能明显地抑制ALV-J复制， 且PEG-ISU肽的最适浓度为1.6mg/mL。