用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物及应用

摘要

本发明公开了用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物及应用，化合物的结构式如下：；化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中的应用。一种药物组合物，包括该环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药。本发明的系列化合物，在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中，具有较好的前景。本发明的系列化合物，在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中，具有较好的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物及应用。

背景技术

哮喘是一种以可逆性气道阻塞和非特异性气道高反应性为特征的慢性炎症疾病，涉及一系列炎性细胞和炎性递质的复杂过程。哮喘患者的常见症状是发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽，少数患者还可能有胸痛表现。目前，哮喘是一种常见病、多发病，严重影响人们的身心健康。

支气管哮喘(哮喘)时气道阻塞的机制与气道平滑肌收缩，血管渗漏所致粘膜水肿、粘液分泌增加及以嗜酸细胞为主导的炎症细胞浸润等引起的支气管痉挛有关，多种炎性介质如组胺、白三烯(LTs)、血栓素、前列腺素等，参与上、下气道的炎症反应。哮喘涉及一系列炎性细胞和炎性介质的复杂过程[BritishMedicalJournal1998,316(15):1257-1258]，有研究表明白三烯在哮喘发病中起着重要作用[SampsonA，HolgateS.Leukotriencemodiilersinthetreatmentofasthma[J].BMJ，1998，316(5)：1257—1258.]。它对于哮喘的发生、发展起着关键作用。因而，白三烯受体拮抗剂成为哮喘临床治疗中最有效的介质拮抗剂，这类药物的使用可能实现哮喘治疗的重要突破。

20世纪70年代晚期发现半胱氨酰白三烯(CysLT)是哮喘的重要介质。白三烯由炎症细胞如肥大细胞和嗜酸细胞等生成，在哮喘发病中有多方面生物学作用：增加血管通透性和水肿形成；增加黏液生成，减弱黏膜纤毛转运；吸引炎症细胞(如嗜酸细胞)从血液迁移到气道并释放炎性介质，损伤气道上皮；直接引起支气管痉挛，刺激平滑肌细胞增殖。白三烯通过其受体发挥作用。平滑肌细胞、树突状细胞、嗜酸细胞、单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞均有白三烯受体分布。免疫荧光检查显示，肺组织中无论是中央大气道还是外周小气道的平滑肌均有CysLT1受体的分布。白三烯受体拮抗剂(LTRA)在哮喘病人中可以改善通气和减轻症状，进一步支持了白三烯在哮喘中的作用。

随着LTs在哮喘气道高反应性中的作用逐渐被认识，以及LTs受体部位被确认，白三烯受体拮抗剂(LTRA)与LTs合成抑制剂在防治哮喘中的地位引起关注。第一个白三烯D4(LTD4)受体拮抗剂异丁司特(ibudilast,ketas)于1989年在临床应用。1996年新一代LTRAzafirlukast(商品名，安可来)作为抗哮喘、抗炎及抗过敏药物在国外上市，并已有一定临床应用经验。此类具有拮抗LTs作用的药物，为当前治疗哮喘的一种新趋势。

白三烯受体拮抗剂(LTRAs)作用机理主要有以下几个方面：1.抗炎作用，预防和减轻粘膜炎性细胞浸润过敏性哮喘患者服用扎鲁司特或孟鲁司特，随着肺功能的改善，患者的痰液、外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的淋巴细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和巨噬细胞数显著减少，而且减少的程度与肺活量及白天症状改善程度相关。2.舒张支气管平滑肌。3.抑制运动诱发的支气管收缩。在哮喘患者中，运动引起的支气管收缩约占70％～80％，LTRAs可显著抑制运动诱发的支气管收缩。4.对不耐受阿司匹林性哮喘(AIA)的作用。不能耐受阿司匹林的哮喘患者，具有慢性鼻炎、反复发生鼻息肉、哮喘及不耐受类似阿司匹林药物的特征，这种哮喘用常规治疗是很难控制的，此类患者常伴有半胱氨酸白三烯的过度产生及LTC4合成酶的上调。许多研究证实与耐受阿斯匹林性哮喘患者和正常人相比，AIA的支气管活检组织LTC4合成酶过度表达，同时伴有肺泡灌洗液半胱氨酸白三烯水平的提高。

LTRAs的耐受性好，近几年进行的大规模临床试验，证实LTRAs与安慰剂相比，具有显著的临床疗效，长期使用未发现明显的副作用，耐受性好，在儿童亦非常有效、安全。没有发生死亡和严重不良反应的报道。

目前已上市和临床应用的LTRAs主要有扎鲁司特(Zafirlukast，安可来，Acolate)、普鲁司特(Pranukast)和孟鲁司特(Montelukast，顺尔宁，Singulair)。其中孟鲁司特是近年来开发的新型选择性高、耐受性好的强效半胱氨酰白三烯受体1(CysLTR.)阻滞剂类药物，能竞争性拮抗白三烯D4(LTD4)与Cys—LT1受体的结合，而抑制白三烯的活性，减少血管内皮生长因子的表达而调整血管渗透性，改善呼吸道水肿。能有效预防和抑制白三烯所导致的血管通透性增加、支气管痉挛、气道粘液高分泌，降低气道高反应性,对重要器官或系统无明显不良反应,依从性较好，作为炎症介质拮抗剂其抗喘作用已得到肯定[MarkhamA，FauldsD.Montelukast[J].Drugs，1998，56(2)：251—7.]。临床主要用于成人及儿童哮喘病的预防和长期治疗[LEEKS，KIMSR，PARKHS，eta1.Cysteinylleukotrienereceptorantagonistregulatesvascularpermeabilitybyreducingvascularendothelialgrowthfactorexpression[J].AllergyClinlmmunol，2004，114(5)：1093—1099.]。一项双盲、随机、交叉、对照的临床研究显示，孟鲁司特可显著抑制吸入LTD4而引起支气管收缩[LepeleiveID，ReissTF，RocheHeF，et.Montelukastcausesprolonged，potentleukotrieneD4一receptorantagonismintheairwaysofpatientswithasthma[J].cfinPharmacolTher，1997，61(1)：83.]。孟鲁司特也可抑制运动引起的支气管收缩，BronskvEA等[BronskyEA，KempJP，ZhangJ，et“.Doserelatedprotection

ofexecfisebronchoconstrictionbymontelukast，acysteinyl

leukotriene—receptorantagonist，attheandofa.once—daily

dosinginterval[Jj.cfinPharmacolTher，1997，62(5)：556.]在哮喘患者身上试验了孟鲁司特对运动诱发的支气管收缩的抑制情况。

孟鲁司特钠(顺尔宁)是第一个口服的白三烯受体拮抗剂。白三烯是支气管哮喘发病中一系列炎性细胞和炎性介质中的重要介质之一，对支气管哮喘的发生、发展，在哮喘的病理生理中起着关键作用。

孟鲁司特钠(Montelukast，顺尔宁)是目前唯一一种每日服一次的强选择性白三烯受体拮抗剂，适用于成人及儿童哮喘和哮喘和过敏性鼻炎哮喘综合症的治疗。由于其应用范围较广，服用方便，尽管生产及用于临床较晚，目前已经得到临床医师的广泛认同及临床应用。

最近，美国食品和药品管理局(FDA)药物不良事件报告委员会(AERS)已经收到许多有关孟鲁司特钠(顺尔宁)等抗白三烯药物的神经精神方面的副作用报告，大部分报告都与孟鲁司特钠(顺尔宁)可以诱发自杀倾向有关。该药是目前最常用的抗白三烯处方药物，从一些患者自杀报告的临床描述看，自杀不良事件确为药物引起的。2008年3月27日美国食品和药品管理局(FDA)向医务工作者和患者发出通告[公告03/27/2008]，认为使用顺尔宁可能引起行为/情绪的改变和自杀的倾向和行为。患者暂时不用停药，但临床医生应密切监测使用这些药物的患者是否有行为/情绪的改变，以及有无自杀倾向和行为。对于服孟鲁司特钠(顺尔宁)的孩子，应该关注孩子是否会出现好动、注意力不集中、是否有攻击行为、嗜睡、情绪低落等表现。

2009年FDA在调查后正式表示，孟鲁司特钠(顺尔宁)等3种哮喘药有引发精神问题的可能性，有关抗白三烯药物的生产商需要在药品标签上标注用药风险。FDA在网站上发表声明指出，一些服用孟鲁司特钠(顺尔宁)、安可来和齐留通的哮喘患者出现了抑郁、焦虑以及自杀倾向等副作用，FDA调查证实孟鲁司特钠(顺尔宁)等3种抗白三烯类哮喘药有可能引发精神方面的问题。FDA称，临床医生和哮喘患者均应需要清楚这些药物对精神健康的潜在风险。

孟鲁司特钠(顺尔宁)的生产厂商默沙东公司的一名发言人表示，已在孟鲁司特钠(顺尔宁)的使用说明书上“不良反应”部分标注了上述神经精神副作用的风险，今后将在药品的注意事项部分给予说明。

现有技术已叙述了一些作为拮抗物对白细胞三烯有作用活性的含喹啉化合物。

例如，EP318,093(Merck)和CN1061407A(麦克弗罗特，加拿大有限公司)叙述了具有结构A的化合物。结构式B的化合物WO89/12629(Rorer)和US005565473A中已公开。

发明内容

本发明的目的在于提供用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物及应用。

本发明所采取的技术方案是：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

其中：

R¹,R²代表H，卤素，—CF₃，—CN，—NO₂，或N₃；

R³代表低级烷基，低级链烯基，—CF₃，—CH₂F，—CHF₂，CH₂CF₃，取代或未取代苯基，取代或未取代苄基，取代或未取代的2-苯乙基，或两个R²基团连接到同一碳上形成含有0—2个杂原子，多至8元的环，其中所述的杂原子选自O，S和N；

R⁴代表H或R³；

R⁵代表H或药学上可以接受的盐对应的阳离子；

R⁶,R⁷代表H，卤素，—CF₃，—CN，—NO₂，或N₃。

所述的低级烷基为C1-8的烷基，所述的低级链烯基为C1-8的链烯基。

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中的应用。

一种药物组合物，包括上述的用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药。

上述的一种药物组合物，还包括药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果是：

本发明的系列化合物，在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中，具有较好的前景。

具体来说：

本发明制备的一系列环丙基的不饱和喹啉化合物，对KM小鼠的急性毒性作用试验显示，在治疗剂量范围内是相对安全、可靠、无毒的。

体内平喘药效学试验结果表明，尤其是一种异构体化合物，对哮喘模型豚鼠具有较好的平喘作用，比同等剂量的孟鲁司特对照组效果明显，是研发高效低毒的平喘药物的一个很有前途的候选先导化合物。

本发明的系列化合物，在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中，具有较好的前景。

具体实施方式

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，其结构式如下所示：

优选的：

R¹,R²代表H，卤素，—CF₃，—CN，—NO₂，或N₃；

R³代表低级烷基，低级链烯基，—CF₃，—CH₂F，—CHF₂，CH₂CF₃，取代或未取代苯基，取代或未取代苄基，取代或未取代的2-苯乙基，或两个R²基团连接到同一碳上形成含有0—2个杂原子，多至8元的环，其中所述的杂原子选自O，S和N；

R⁴代表H或R³；

R⁵代表H或药学上可以接受的盐对应的阳离子；

R⁶,R⁷代表H，卤素，—CF₃，—CN，—NO₂，或N₃。

进一步优选的，所述的低级烷基为C1-8的烷基，所述的低级链烯基为C1-8的链烯基。

上述所列化合物，其中的酸性基团可与碱成盐，这些与碱成盐的例子包括但不限于：与无机碱碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属氢氧化物、碱土金属碳酸盐、碱土金属碳酸氢盐成盐；与有机碱如普鲁卡因成盐、与碱性氨基酸如赖氨酸成盐。

优选的，用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药，为下列化合物中的至少一种：

上述所列化合物，其中的碱性基团可与酸成盐，这些与酸成盐的例子包括：与无机酸，尤其氢卤酸(如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸)、硝酸、硫酸、磷酸、碳酸等形成的盐；低级烷基磺酸，如甲磺酸，三氟甲磺酸形成的盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对甲苯磺酸形成的盐；与有机酸，如乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、马来酸、苹果酸或琥珀酸形成的盐；与氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸形成的盐。

用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗哮喘和/或过敏性鼻炎哮喘综合症的药物中的应用。

一种药物组合物，包括上述的用作白三烯受体拮抗剂的环丙基不饱和喹啉化合物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或前药。

上述的一种药物组合物，还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

本发明的药物组合物可制成各种剂型：按照剂型的分散系统进行分类：具体来说，可以制成以下剂型：溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型、固体分散型；按照形态分类，具体来说，可以制成以下剂型：液体剂型(如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等)，气体剂型(如气雾剂、喷雾剂等)，固体剂型(如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体剂型(如软膏剂、栓剂、糊剂等)；按照给药途径分类：具体来说，可以制成以下剂型：经胃肠道给药的剂型、不经胃肠道给药的剂型。

以下是本发明化合物合成路线：

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1：片段化合物2的合成：

合成路线：

(1)化合物2-2的合成

0-5℃下，向溶于乙腈(150mL)的丙二酸二乙酯(87mmol)溶液中依次加入三乙胺(104mmol)和溶于乙腈(100mL)的对甲苯磺酰叠氮(20.5g,104mmol)溶液。滴加完毕，室温搅拌过夜。反应结束后，将反应液减压浓缩，再加入100mL乙醚溶液，有机层依次用1N氢氧化钠水溶液(50mL)，水(50mL)，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩得到17g化合物2-2(产率100％)。

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ4.30-4.25(q,J＝6,4H),δ1.31-1.27(t,J＝6,6H).

(2)化合物2-3的合成

在-60℃下，向四(三苯基乙酸)二铑(II)(48g)和粉末分子筛(720g)的二氯甲烷(20L)悬浊液中加入1-氯-1-氟乙烯(14.9mol)，然后将反应液升温至-35～-40℃，加入化合物2-2(11.47mol)的二氯甲烷(4L)溶液。加料完毕，室温搅拌过夜。将反应液过滤，滤液浓缩得2.9Kg黄色油状粗品化合物2-3，不进一步纯化直接投入下一步反应。

(3)化合物2-4的合成

在80℃下，向化合物2-3(3.35mol)粗品的N-甲基吡咯烷酮(4.5L)溶液中加入雷尼镍(380g),乙二胺(632g)，并充氢气，反应过夜。反应结束后，将反应液降至室温，加入乙酸乙酯(15L)，过滤，滤液依次用2N盐酸水溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，

过滤，滤液减压浓缩，柱层析纯化得518g化合物2-4(产率65％).

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ4.75-4.48(m,1H),δ4.29-4.25(q,J＝6,4H),δ1.77-1.53(m,2H),δ1.33-1.28(t,J＝6,6H).

(4)化合物2-5的合成

0℃下，将化合物2-4(10.7mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液中缓慢滴加到LiAlH₄(35.4mmol)的四氢呋喃(100mL)悬浊液中，然后室温搅拌1小时。反应结束后加水淬灭，悬浊液液通过硅藻土过滤，滤液减压浓缩，柱层析纯化得到1g化合物2-5(产率78％).

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ4.70-4.54(m,1H),δ4.09-2.98(m,6H),δ0.95-0.82(m,2H).

(5)化合物2-6的合成

将化合物2-5(250mmol)的DMF(225mL)溶液置于1L的反应瓶中，并装配减压蒸馏装置，当反应温度达到75℃/50torr时，DMF可蒸馏出25mL，然后往反应液中加入亚硫酸二异丙酯的甲苯溶液(81.6mL，300mmol，在52℃/55torr时，可收集到50mL甲苯。然后向反应液中加入叔丁醇钠(2MinTHF,2.0mL)，于35^°/50torr条件下蒸馏，可收集到30mL馏分，继续升高温度至70℃/50torr蒸馏，可收集到60mL馏分。然后加入叔丁醇钠(2MinTHF,1.0mL)，于60-75℃/50torr条件下，继续蒸馏可收集到60mL馏分。之后再加入叔丁醇钠(2MinTHF,0.5mL)，继续于70-75℃/50torr条件下蒸馏，收集到30mL馏分后，停止蒸馏，反应液在70℃下搅拌1小时，然后冷却到室温，经过后处理可得化合物2-6溶液。

(6)化合物2-7的合成

往上述化合物2-6溶液中加入氰化钠(275mmol)，碘化钠(50mmol)，升温至70℃搅拌反应1小时，然后加大力度搅拌4小时，接着在70℃下缓慢加入甲苯(400mL)，之后再缓慢滴加水(6mL)持续30min。滴加完毕，减压蒸馏，可蒸出100mL甲苯，然后将反应液冷却到10℃，过滤，滤饼用甲苯冲洗(100mL)，合并滤液，浓缩，柱层析纯化得到24g化合物2-7(两步产率74％)。

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ4.67-4.48(m,1H),δ3.88-3.33(m,2H),δ2.76-2.34(m,2H),δ1.11-0.91(m,2H).

(7)化合物2-8的合成

将三苯基膦(0.28mol)溶于300mL乙腈中，冷却到-8℃，缓慢滴加溴素(0.27mol)，反应液05℃下搅拌至黄色消失，滴加化合物2-7(0.27mol)的乙腈溶液，温度保持在10℃以下，滴加完毕，将反应液加热至60℃并搅拌15-20min。然后将反应液冷却至-10℃以下并保持1小时，然后过滤，滤饼用低温乙腈(2×100mL)冲洗，合并滤液并减压浓缩，浓缩物用甲基叔丁基醚(100mL)溶解，然后于-8℃～-3℃温度下搅拌1小时以上，之后过滤，滤饼用低温甲基叔丁基醚(2×100mL)冲洗，合并滤液，浓缩得到45g化合物2-8(产率：87％)。

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ4.69-4.50(m,1H),δ3.51-3.24(m,2H),δ2.56-2.37(m,2H),δ1.18-1.01(m,2H).

(8)化合物2-9的合成

将化合物2-8(0.187mol)，丙酮(165mL)，硫脲(0.189mol)置于500mL两口瓶中，反应液加热回流12小时，然后将反应液冷却至-8℃～-3℃,持续搅拌1小时以上，过滤，滤饼用低温丙酮(2×25mL)冲洗，之后滤饼再用87mL丙酮打浆5小时,过滤，滤饼再次用低温丙酮(2×25mL)冲洗，抽干，真空干燥得到44g化合物2-9(产率90％)。

(9)片段化合物2的合成

在氮气保护下，将化合物2-9(0.04mol)与20％脱气氢氧化钠溶液(38.3mL)置于100mL三口瓶中，加热回流14小时。然后冷却至室温，加入脱气乙酸乙酯，继续降温至-5～5℃之间，然后加入85％甲酸调pH值至3.5～4.0之间。分离有机相，水相继续用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用水清洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗品，粗品进一步用正己烷结晶得到5g片段化合物2(产率76％)

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.87(br,1H),δ4.61-4.43(m,1H),δ2.91-2.66(m,2H),δ2.56-2.22(m,2H),δ1.49-1.45(m,1H),δ0.99-0.84(m,2H).

¹³CNMR(CDCl₃500MHz):δ178,δ177；δ77,δ76；δ36,δ33；δ29,δ26；δ24,δ23；δ18,δ16.

¹⁹FNMR(CDCl₃470MHz):δ-214；δ-219.

实施例2化合物4的合成

合成路线如下：

(1)化合物3的合成

将(2-氟-环丙基)-1-巯甲基乙酸(33mmol)，碳酸铯(98mmol)及聚乙二醇-400(10g)置于烧瓶中，加入DMF(50mL)，室温下搅拌1小时。反应液冷却到-15℃，滴加化合物1(33mol)的THF(45mL)溶液，滴加完毕，反应液升至室温搅拌8小时。加入1M盐酸溶液(100mL)，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥浓缩得到粗品，粗品通过乙酸乙酯/石油醚结晶得到16g黄色固体化合物3(产率80％)。

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.09-8.06(m,2H),δ7.75-7.48(m,4H),δ7.45-7.31(m,6H),δ7.16-7.11(m,3H),δ5.20(br,1H),δ4.61-4.36(m,1H),δ4.01-3.98(m,1H),δ3.23-3.02(m,1H),δ2.94-2.51(m,4H),δ2.35-2.08(m,4H),δ1.62-1.61(d,6H),δ0.93-0.86(m,2H).

MS:[M+H],605.2.

(2)化合物3的手性拆分

通过手性柱分离，可得到化合物3-1(cis)和化合物3-2(trans)。

化合物3-1(cis):

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.08-8.04(m,2H),δ7.75-7.47(m,4H),δ7.45-7.32(m,6H),δ7.17-7.11(m,3H),δ4.84(br,1H),δ4.52-4.27(m,1H),δ4.01-3.93(m,1H),δ3.19-3.14(m,1H),δ2.93-2.52(m,4H),δ2.38-2.18(m,4H),δ1.61-1.60(d,6H),δ0.98-0.76(m,2H).

¹⁹FNMR(CDCl₃470MHz):δ-216.

化合物3-2(trans):

¹HNMR(CDCl₃400MHz):¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.07-8.04(m,2H),δ7.76-7.47(m,4H),δ7.45-7.33(m,6H),δ7.17-7.10(m,3H),δ4.63(br,1H),δ4.74-4.36(m,1H),δ4.07-3.99(m,1H),δ3.24-3.13(m,1H),δ2.94-2.53(m,4H),δ2.39-2.18(m,4H),δ1.62-1.60(d,6H),δ0.93-0.81(m,2H).¹⁹FNMR(CDCl₃470MHz):δ-217.

(3)化合物4的合成

室温下，先将NaOH(8.7mol)溶于甲醇(30mL)中，然后将此碱液加入化合物3(8.5mol)的甲醇(32mL)溶液中，搅拌30min，之后加入适量活性炭，搅拌30min，铺硅藻土过滤，滤液旋干，真空干燥得化合物4(产率90％)。

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.03-8.00(m,2H),δ7.67-7.55(m,4H),δ7.43-7.33(m,6H),δ7.09-7.02(m,3H),δ4.58-4.31(m,1H),δ4.00-3.93(m,1H),δ3.28-3.16(m,1H),δ2.86-2.53(m,4H),δ2.23-2.09(m,4H),δ1.59-1.55(d,6H),δ0.70-0.53(m,2H).

MS:[M+H],605.2.

(2)化合物4的手性拆分

将化合物4通过手性柱分离，以得到四个不同绝对构型的化合物，化学反应式如下：

通过手性柱分离，得到了cis化合物的一对对映异构体，分别是2.4g的化合物4-1和2.2g的化合物4-2。

化合物4-1(CS-0090-1)：

LC-MS:4.758min,96.7％；[M+H],605.2.

SFC:4.56min,de值97.79％.

化合物4-2(CS-0090-2)：

LC-MS:4.758min,99.1％；[M+H],605.2.

SFC:6.36min,de值100％.

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.06-8.04(m,2H),δ7.69-7.57(m,4H),δ7.46-7.33(m,6H),δ7.18-7.08(m,3H),δ4.41-4.24(m,1H),δ3.97-3.93(m,1H),δ3.23-3.16(m,1H),δ2.90-2.45(m,4H),δ2.24-2.15(m,4H),δ1.61-1.59(d,6H),δ0.93-0.68(m,2H).

¹³CNMR(CDCl₃500MHz):δ176.3,δ156.8,δ148.1,δ145.2,δ143.4,δ143.2,δ140.1,δ136.5,δ136.4,δ135.7,δ135.3,δ131.5,δ129.1,δ128.7,δ128.5,δ127.6,δ127.2,δ127.1,δ126.7,δ126.4,δ125.7,δ125.6,δ125.4,δ119.2,δ75.4,δ73.7,δ50.3,δ39.8,δ36.1,δ34.5,δ32.3,δ31.8,δ31.7,δ21.4,δ17.8.

¹⁹FNMR(CDCl₃470MHz):δ-215.

通过手性柱分离，只得到了30gtrans化合物的消旋体(化合物4-3和4-4(1：1)无法通过手性柱分离开)。

化合物4-4(CS-0090-4)

LC-MS:9.322min,99.1％；[M+H],605.2.

HPLC:8.689min,99.1％.

¹HNMR(CDCl₃400MHz):δ8.07-8.04(m,2H),δ7.76-7.55(m,4H),δ7.47-7.33(m,6H),δ7.17-7.10(m,3H),δ4.63-4.36(m,1H),δ4.06-4.01(m,1H),δ3.19-3.16(m,1H),δ2.91-2.37(m,4H),δ2.26-2.22(m,4H),δ1.62-1.57(d,6H),δ0.93-0.81(m,2H).

¹³CNMR(CDCl₃500MHz):δ174.7,δ156.9,δ147.8,δ145.1,δ143.6,δ143.4,δ140.1,δ136.5,δ136.3,δ135.8,δ135.7,δ131.5,δ129.1,δ128.7,δ128.6,δ127.4,δ127.2,δ127.1,δ126.7,δ126.4,δ125.6,δ125.5,δ125.4,δ119.1,δ76.7,δ73.8,δ50.5,δ39.9,δ38.1,δ32.8,δ32.2,δ31.8,δ31.6,δ21.9,δ18.4.

¹⁹FNMR(CDCl₃470MHz):δ-216.

测试部分：

白三烯受体拮抗剂CS-0090系列化合物平喘药效学实验：

第一部分、小鼠急性毒性试验

1仪器和材料

1.1实验动物

1.1.1品系和级别：KM小鼠，普通级；

1.1.2数量及性别：40只，雌雄各半；

1.1.3体重：购入时小鼠为18～22g；

1.1.4提供单位：由广东中医药大学实验动物中心提供；

1.1.5识别方法：采用被毛染色法。使用饱和苦味酸对小鼠进行编号，在小鼠体表不同部位的被毛涂染斑点，以示不同号码。以小鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别；

1.1.6饲养管理：动物饲养在普通级动物房，实验动物使用许可证号：SCXK(粤)2013‐0020。动物饲养条件：10只/笼，群养，饲养温度与湿度：20～25℃，40～70％，采用10h:14h昼夜间断照明，试验期间动物自由进食饮水。饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。

1.1.7检疫：对购入小鼠检疫7天。期间每日检查动物一次，如发现不健康的动物立即剔除，选用健康动物进行实验。

1.2主要试剂

无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，吐温‐80(江苏省海安石油化工厂)，去离子水(广东药学院药科学院实验室自制)，苦味酸(北京鑫鼎鹏飞科技发展有限公司)，甲醛溶液(天津市大茂化学试剂厂)生理盐水(广东药学院药科学院实验室自配)，孟鲁司特(广州康瑞泰药业有限公司)，CS‐0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4(广州康瑞泰药业有限公司提供，LotNo：20141012)。

1.3主要仪器与材料

十万分之一电子天平(日本岛津，型号AUW120D)，电子天平(日本岛津，型号AUY120)，V7型快速混匀器(美国Essenscien)，电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司，型号DK‐8D)，1mL一次性无菌注射器(美国碧迪)。

2实验方法

2.1剂量设计与分组

2.1.1剂量设计

2.1.1.1孟鲁司特：孟鲁司特的人体推荐量是10mg/d，按标准人60kg计算，则小鼠的等效剂量为1.52mg·kg^-1·d^-1，以等效剂量的1500倍作为给药剂量，即2280mg·kg^-1·d^-1，具体给药方案为：760mg·kg^-1，0.01ml/g，3次/天。

2.1.1.2CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4：为方便对照结果，设定CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4的给药方案同孟鲁司特。

2.1.2动物分组

适应期结束后动物按体重随机分成4组，即阳性药雄性对照组、阳性药雌性对照组、CS‐0090^-1雄性实验组和CS‐0090-1雌性实验组，10只/组。

2.2CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4对KM小鼠的急性毒性作用

2.2.1药物配制方法

2.2.1.1孟鲁司特：称取一定量的孟鲁司特，加入适量吐温‐80使之浓度为0.2％和适量无水乙醇使之浓度为10％，并涡旋使其完全溶解，再加入适量的去离子水，配制成浓度为76mg/mL的药液，现配现用。

2.2.1.2CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4：称取一定量的CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4，加入适量吐温‐80使之浓度为0.2％和适量无水乙醇使之浓度为10％，并涡旋使其完全溶解，再加入适量的去离子水，配制成浓度为76mg/mL的药液，现配现用。

2.2.2试验方法

适应期结束后动物按体重随机分成4组，即阳性药雄性对照组、阳性药雌性对照组、受试药雄性实验组，受试药雌性实验组，10只/组。给药前各组小鼠禁食不禁水12h，各组动物按照0.01ml/g体重灌胃给予相应的治疗药物，3次/天，共给药1天。于第8天解剖取其肺和支气管用甲醛溶液固定保存。

2.2.3检测指标

2.2.3.1日常观察：在给药后的前30min内，至少每个动物观察一次，给药后24h内要定时观察(观察时间间隔视中毒反应、发作时间以及恢复周期的长短而决定，在给药后4h内要特别注意)，之后每天观察1次，共7天。观察并记录给药过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况。

2.2.3.2持续中毒症状观察：如果动物继续出现中毒征兆，则必须进行额外的观察。观察应该包括皮肤和毛皮、眼睛和黏膜、呼吸、循环、自主神经核中枢神经系统、肢体活动和行为模式的改变。应重点放在震颤、抽筋、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷的观察上，啮齿类动物中毒表现观察项目见表1。

表1啮齿类动物中毒表现观察项目表

2.2.3.3解剖：对观察期间死亡动物进行尸检解剖；观察期结束后，颈椎脱臼处死存活小鼠进行尸检解剖。记录每个动物的肺及支气管的病理变化，对观察到病变的脏器进行组织病理学检查。

3结果

根据阳性药孟鲁司特对人体的推荐给药量10mg/d换算得到小鼠的给药剂量，作为受试药物CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4的初始给药剂量(1.52mg.kg-1)，通过预实验，测得以500倍初始给药剂量(760mg.kg-1)给予小鼠灌胃仍无法使实验组小鼠100％死亡(LD100)，由于CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4在水中溶解度很低，给药剂型只能为混悬剂，若再提高给药浓度，则药物更难与溶媒形成较稳定的体系，导致灌胃给药剂量不准确，即实验无法测定CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4的LD50，故只能测定小鼠对CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4的最大给药量。

由广州康瑞泰药业有限公司提供的孟鲁司特对KM小鼠的急性毒性作用试验显示除阳性药雌性组第二天死亡一只外，其余小鼠均无死亡，摄食、活动行为、大小便正常、无特殊分泌物，无神经系统的毒性反应，如活动减少，静伏少动，惊动后醉酒样走动等症状，于第8天解剖观察各小鼠肺和支气管均正常。考虑到存在个体差异现象，故可认为孟鲁司特的最大给药量为760mg.kg^-1*3＝2280mg.kg^-1。

由广州康瑞泰药业有限公司提供的CS-0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4对KM小鼠的急性毒性作用试验显示所有小鼠均无死亡，摄食、活动行为、大小便正常、无特殊分泌物，无神经系统的毒性反应，如活动减少，静伏少动，惊动后醉酒样走动等症状，于第8天解剖观察各小鼠肺和支气管均正常。故可认为CS‐0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐3的最大给药量也分别为760mg.kg^-1*3＝2280mg.kg^-1、763mg.kg^-1*3＝2289mg.kg^-1、754mg.kg^-1*3＝2262mg.kg^-1，这表明CS‐0090-1、CS‐0090‐2、CS‐0090‐4在治疗剂量范围内应该是相对安全、可靠、无毒的。

第二部分化合物CS-0090-1体内平喘药效学试验

1仪器和材料

1.1实验动物

1.1.1品系和级别：豚鼠，普通级；

1.1.2数量及性别：24只，雄性；

1.1.3体重：购入时豚鼠为180～220g；

1.1.4提供单位：由广东中医药大学实验动物中心提供；

1.1.5识别方法：采用被毛染色法。使用饱和苦味酸对豚鼠进行编号，在豚鼠体表不同部位的被毛涂染斑点，以示不同号码。以豚鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别；

1.1.6饲养管理：动物饲养在普通级动物房，实验动物使用许可证号：SCXK(粤)2013‐0020。动物饲养条件：6只/笼，群养，饲养温度与湿度：20～25℃，40～70％，采用10h:14h昼夜间断照明，试验期间动物自由进食饮水。饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。

1.1.7检疫：对购入豚鼠检疫3天。期间每日检查动物一次，如发现不健康的动物立即剔除，选用健康动物进行实验。

1.2主要试剂

氯化乙酰胆碱(上海三爱思试剂有限公司)，组胺(北京绿源博德生物科技有限公司)，无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，吐温‐80(江苏省海安石油化工厂)，苦味酸(北京鑫鼎鹏飞科技发展有限公司)，去离子水(广东药学院药科学院实验室自制)，孟鲁司特(广州康瑞泰药业有限公司)，CS-0090-1(广州康瑞泰药业有限公司)。

1.3主要仪器与材料

V7型快速混匀器(美国Essenscien)，电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司，型号DK‐8D)，鱼跃402AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)，电子天平(日本岛津，型号AUY120)，十万分之一电子天平(日本岛津，型号AUW120D)，1mL一次性无菌注射器(美国碧迪)。

2实验方法

2.1豚鼠哮喘模型的建立

采用0.1％组胺和2％乙酰胆碱溶液混合雾化诱导哮喘法。取180～220g健康雄性豚鼠，实验前一天置于自制密闭容器(2L)内，超声雾化吸入0.1％组胺和2％乙酰胆碱混合溶液，调节最大雾化量，喷雾持续至豚鼠出现咳嗽症状，观察豚鼠吸入开始至发生抽搐跌倒的时间(即诱导哮喘潜伏期)。诱导哮喘潜伏期在120s内的豚鼠视为合格的敏感动物，筛选出合格的动物以备分组及给药。

2.2剂量设计与分组

2.2.1剂量设计

2.2.1.1孟鲁司特：孟鲁司特的人体推荐量是10mg/d，按标准人60kg计算，则豚鼠的等效剂量为1mg·kg^-1·d^-1，以等效剂量的3倍作为给药剂量，即3mg·kg^-1·d^-1。

2.2.1.2CS-0090-1：以孟鲁司特等效剂量的1倍作为CS‐0090^-1的低剂量，即1mg·kg^-1·d^-1；以孟鲁司特等效剂量的3倍作为CS‐0090^-1的中剂量，即3mg·kg^-1·d^-1；以孟鲁司特等效剂量的9倍作为CS-0090-1的高剂量，即9mg·kg^-1·d^-1。

2.2.2动物分组

诱导哮喘潜伏期合格的豚鼠按体重随机分成4组，即孟鲁司特对照组、CS-0090-1低剂量实验组、CS-0090-1中剂量实验组、CS‐0090-1高剂量实验组，6只/组。

2.3CS‐0090-1对豚鼠哮喘模型的平喘作用

2.3.1药物配制方法

2.3.1.1孟鲁司特：称取一定量的孟鲁司特，加入适量吐温‐80使之浓度为0.2％和适量无水乙醇使之浓度为10％，并涡旋使其完全溶解，再加入适量的去离子水，配制成浓度为0.6mg/mL的药液，现配现用。

2.3.1.2CS-0090-1：称取一定量的CS-0090-1，加入适量吐温‐80使之浓度为0.2％和适量无水乙醇使之浓度为10％，并涡旋使其完全溶解，再加入适量的去离子水，配成高剂量溶液，浓度为0.2mg/mL。同法配制浓度为0.6mg/mL的中剂量溶液、浓度为1.8mg/mL的低剂量溶液，现配现用。

2.3.1.30.1％组胺和2％乙酰胆碱混合溶液：称取一定量的组胺，加入适量的去离子水，配成浓度为0.1％的组胺溶液；称取一定量的乙酰胆碱，加入适量的去离子水，配成浓度为2％的乙酰胆碱溶液；再将上述两种溶液等容混合，现配现用。

2.3.2试验方法

将诱导哮喘潜伏期合格的24只豚鼠按体重随机分成4组，即孟鲁司特对照组、CS-0090-1低剂量实验组、CS-0090-1中剂量实验组、CS-0090-1高剂量实验组，6只/组。给药前各组豚鼠禁食不禁水12h，各组豚鼠每天按1ml/100g体重灌胃给予相应的治疗药物，1次/天，连续给药7天。于第7天末次给药1h后，再次将豚鼠置于自制密闭容器(2L)内，以制备哮喘模型相同的条件进行诱导哮喘，观察并记录豚鼠给药后的诱导哮喘潜伏期，潜伏期超过6min者以6min计。

2.3.3统计分析

采用Excel进行统计分析。所有实验结果的数据以均数±标准差(x±s)表示，采用T检验，当P≤0.05时，两组数据有显著性差异；当P＞0.05时，两组数据无显著性差异。

3结果

本实验不设计空白对照组而采用给药前后自身对照法，动物数量满足统计学要求，每组包括已造模成功的豚鼠6只。如下表所示，CS-0090-1中剂量组给药后诱导哮喘潜伏期与本组给药前诱导哮喘潜伏期相比，P<0.05，表明有显著性差异，CS-0090-1中剂量使豚鼠诱导哮喘潜伏期明显延长，比同等剂量的孟鲁司特对照组效果明显，但CS-0090-1低剂量组与CS-0090-1高剂量组的P>0.05，与本组给药前诱导哮喘潜伏期相比无显著性差异，即CS-0090-1低剂量组与CS-0090-1高剂量组对哮喘模型豚鼠的平喘作用不明显，其原因可能是低剂量的CS-0090-1未能达到平喘的最小有效量，对哮喘模型豚鼠的平喘作用不明显；而中剂量的CS-0090-1已达到治疗极量，因此继续提高剂量，也使哮喘模型豚鼠的平喘作用不明显。

表2CS‐0090‐1对哮喘模型豚鼠的平喘作用结果

注：*与本组给药前诱导哮喘潜伏期比较，P＜0.05，有显著性差异；

#与阳性对照药孟鲁司特诱导哮喘潜伏期比较，P＜0.05，有显著性差异。

4小结

体内药效学试验中，与阳性对照药孟鲁司特相比，CS-0090-1中剂量、高剂量均可使豚鼠诱导哮喘潜伏期明显延长(P值均小于0.05)，表明其对豚鼠哮喘模型具有较好的平喘作用，是一个很有成药性前途的候选先导化合物。对其进行药剂学研究以提高CS‐0090-1的生物利用度，将为进一步的成药性评价提供更多实验依据。

第三部分：化合物CS-0090-2体内平喘药效学研究

1仪器和材料

1.1药品与试剂

孟鲁司特和受试药物CS‐0090‐2均由广东康瑞泰药业有限公司提供；氯化乙酰胆碱(乙酰胆碱，上海三爱思试剂有限公司)；磷酸组胺(组织胺，北京绿源博德生物科技有限公司)；无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；吐温80(江苏省海安石油化工厂)；氯化钠(NaCl，广东光华科技股份有限公司)；氯化钾(KCl，天津市百世化工有限公司)；氯化钙(CaCl₂，天津市致远化学试剂有限公司)；碳酸氢钠(NaHCO₃，天津市致远化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(KH₂PO₄，天津市福晨化学试剂厂)；硫酸镁(MgSO₄，天津市大茂化学试剂厂)；葡萄糖(Glucose，天津市百世化工有限公司)；甲醛(天津市大茂化学试剂厂)；生理盐水(广东药学院药科学院实验室自配)；苦味酸(北京鑫鼎鹏飞科技发展有限公司)

1.2实验动物

豚鼠：体重180～220g(诱导哮喘)，健康雄性。

小白鼠：昆明种，体重20～25g，雌雄各半。

以上动物均由广州中医药大学实验动物中心提供，小鼠合格证号：SCXK(粤)

2013‐0020；豚鼠使用许可证号：SCXK(粤)2013‐0020。

1.3实验仪器

鱼跃402AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；ZC^-10智能型超级恒温水槽(宁波天恒仪器厂)；新航JZ100型张力换能器(北京新航兴业科贸有限公司)；MedLab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)；万分之一电子天平(日本岛津，型号AUY120)；十万分之一电子天平(日本岛津，型号AUW120D)；电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司，型号DK‐8D)；博翎BIOLAB漩涡混匀器MB(上海博翎仪器设备有限公司)；超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)

2实验方法

2.1豚鼠组织胺和乙酰胆碱诱导哮喘动物模型建立

2.1.1剂量设置

孟鲁司特的临床剂量是10mg/d，每日给药一次。将人的标准体重设为60kg，则临床剂量为0.17mg.kg^-1。根据人与豚鼠按体表面积折算的等效剂量比值，将豚鼠的给药剂量设为3mg.kg^-1。同前述，为方便对照药效，设定受试药CS‐0090‐2的高、中、低剂量分别为9mg.kg^-1、3mg.kg^-1和1mg.kg^-1。

2.1.2造模和给药方法

取体重180～220g健康豚鼠，先将豚鼠逐一放在密闭玻璃钟罩内，待安静后，启动雾化装置，喷入诱导哮喘药液(2％氯化乙酰胆碱与0.1％磷酸组胺的等体积混合液)15s，停止喷雾后，观察哮喘潜伏期(从喷雾开始到哮喘发作、呼吸困难，直止抽搐跌倒的时间)，筛选哮喘潜伏期≤120s的合格动物。将筛选合格的豚鼠随机分为4组，分别为高、中、低剂量组和阳性对照组。

次日，挑选合格的豚鼠42只，随机分为4组，6只/组，分别为孟鲁司特3mg.kg^-1组，CS‐0090‐2受试药1、3、9mg.kg^-1组。各组豚鼠按1ml/100g连续灌胃给药7天。于最后一天给药后1小时将豚鼠逐个放入密闭玻璃钟罩，同筛选实验条件进行喷雾诱导哮喘。记录豚鼠的哮喘潜伏期和抽搐动物数，大于360s不跌倒者按360s计算。

2.2统计检验

实验数据以±s表示，数据统计用SPSS11.0软件进行处理。

喘潜伏期明显延长(P<0.05)。CS‐0090‐2(1、3、9mg.kg^-1)给药7天后，通过给药前后自身对照发现，豚鼠哮喘潜伏期没有明显变化。

表3CS-0090-2对组织胺和乙酰胆碱致喘的豚鼠平喘作用

注：与给药前比较：*P＜0.05：**P＜0.01

4小结

在豚鼠诱导哮喘实验中，新化合物CS‐0090‐2对豚鼠哮喘并没有拮抗作用。

第四部分化合物CS-0090-4体内平喘药效学研究

1仪器和材料

1.1实验动物

健康豚鼠雄性体重180‐220g(由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤)2013‐0020)

1.2主要仪器

十万分之一电子天平(日本岛津，型号AUY120)，电子天平(日本岛津，型号AUY120)V7快速混匀器(美国Essenscien)，鱼跃牌402AI超声雾化器(江苏鱼跃医药设备股份有限公司)电子天平(SHIMADZU/岛津，型号：AUW120D)

1.3主要试剂及材料

氯化乙酰胆碱(上海三爱思试剂有限公司，批号20021018)，磷酸组织胺(上海丽珠东方生物技术有限公司，批号010310)孟鲁斯特(广州康瑞泰药业有限公司提供)，CS‐009‐04(广州康瑞泰药业有限公司提供)

2实验方法

2.1诱导哮喘溶液的配置

称取0.2g胆碱和0.01g组胺分别至于烧杯中，各加蒸馏水10ml后混匀。

2.2CS‐009‐04对豚鼠哮喘潜伏期的影响

2.2.1诱发豚鼠哮喘动物模型建立

对购入豚鼠检疫3d。期间每日检查动物一次，如发现不健康的动物立即剔除，选用健康动物进行实验。取体重180～220g健康豚鼠，先将豚鼠逐一放在密闭玻璃钟罩内，待安静后，启动雾化装置，喷入诱导哮喘药液(2％氯化乙酰胆碱与0.1％磷酸组织胺的等体积混合液)直至豚鼠跌倒，观察诱导哮喘潜伏期(从喷雾开始到哮喘发作、呼吸困难，直止抽搐跌倒的时间)，筛选诱导哮喘潜伏期≤120s的合格动物。

2.2.2剂量设置

据文献报道，孟鲁司特的人体推荐量是10mg/d，按标准人60kg计算，每日的剂量为0.17mg.kg^-1，根据成人量换算成动物剂量的倍数简表，可知豚鼠的CS‐009‐04的给药剂量为低剂量(1mg.kg^-1)、中剂量(3mg.kg^-1)、高剂量(9mg.kg^-1)阳性对照组孟鲁斯特的给药剂量为中剂量(3mg.kg^-1)。

2.2.3给药方法

将筛选合格的豚鼠随机分为4组，分别为高、中、低剂量组和阳性对照组。各组豚鼠按1ml/100g灌胃给药，每天一次，连续7天，于最后一天给药后1小时测定诱导哮喘潜伏期。

3结果

3.1CS‐009‐04对豚鼠哮喘潜伏期的影响

豚鼠吸入的组织胺、乙酰胆碱作用于豚鼠气道上皮细胞的H1、M受体，使气道平滑肌收缩，使豚鼠呼吸困难，这个模型可以模拟哮喘病发时呼吸道阻塞症状。由表4可知CS‐009‐04剂量组中9mg.kg^-1组给药前后潜伏期存在显著性差异(P＜0.05)，CS‐009‐04剂量组中1mg.kg^-1和3mg.kg^-1组给药前后潜伏期不存在显著性差异(P＞0.05)。表明CS‐009‐04在9mg.kg^-1剂量下能显著的延长哮喘的潜伏期，而在1mg.kg^-1和3mg.kg^-1剂量下不能显著的延长哮喘的潜伏期。

3.2孟鲁斯特对豚鼠哮喘潜伏期的影响

由表3可知孟鲁斯特3mg.kg^-1剂量组给药前后的哮喘潜伏期存在显著性差异(P＜0.05)，表明孟鲁斯特在3mg.kg^-1剂量下能显著性延长哮喘的潜伏期。

表4CS-0090-2对组织胺和乙酰胆碱致喘的豚鼠平喘作用

与给药前诱导哮喘潜伏期比较，*P＜0.05

4小结

在豚鼠体内平喘实验中，CS‐009‐04在9mg.kg^-1给药剂量下对乙酰胆碱‐组织胺所致的豚鼠哮喘有明显的平喘作用，能显著性地延长豚鼠的哮喘潜伏期。而孟鲁斯特在3mg.kg^-1给药剂量下，即对乙酰胆碱‐组织胺所致的豚鼠哮喘有明显的平喘作用(P<0.05)。由此可知，CS‐009‐04的平喘作用不如孟鲁斯特。

结论部分：

1.急性毒性实验结果表明：广州康瑞泰药业有限公司提供的CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4对KM小鼠的急性毒性作用试验显示，所有小鼠均无死亡，摄食、活动行为、大小便正常、无特殊分泌物，无神经系统的毒性反应，如活动减少，静伏少动，惊动后醉酒样走动等症状，于第8天解剖观察各小鼠肺和支气管均正常。故可认为CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4的最大给药量分别为2280mg.kg-1、2289mg.kg-1、2262mg.kg-1，这表明CS-0090-1、CS-0090-2、CS-0090-4在治疗剂量范围内应该是相对安全、可靠、无毒的。

2.CS-0090-1体内平喘药效学试验结果表明：中高剂量的CS-0090-1使豚鼠诱导哮喘潜伏期明显延长，表明其对哮喘模型豚鼠具有较好的平喘作用，比同等剂量的孟鲁司特对照组效果明显(P<0.05)，是研发高效低毒的平喘药物的一个很有前途的候选先导化合物。在此基础上可以对其药剂学研究以提高CS-0090-1的生物利用度，为日后成药性评价提供更多实验依据。

3.CS-0090-2体内平喘药效学试验结果表明：化合物CS-0090-2对豚鼠哮喘并没有拮抗作用。

4.CS-0090-4体内平喘药效学试验结果表明：在豚鼠体内平喘实验中，在高剂量(9mg.kg^-1)给药条件下，CS-009-04对乙酰胆碱-组织胺所致的豚鼠哮喘有明显的平喘作用，能显著性地延长豚鼠的哮喘潜伏期。而孟鲁斯特在3mg.kg-1给药剂量下即对乙酰胆碱-组织胺所致的豚鼠哮喘有明显的平喘作用，能极其显著性地延长豚鼠的哮喘潜伏期。由此可知相对于阳性对照药孟鲁斯特，CS-009-04哮喘的治疗作用低于阳性对照药。