一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX1及其编码基因与应用

摘要

一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX1及其编码基因，以及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

说明书

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一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX1及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于小盐芥的液泡 膜钠氢反向转运蛋白 NHX1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的 应用。

背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、 钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重 要的现实意义。 而植物抗盐碱、 耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高 经济和生态价值的植物种或品系的选育， 则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大 多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如>

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。 各国的科学家也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展， 特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面， 使该领域 的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53： 1247-1273； Zhang ZL. 2011. Arabidopsi s Floral Initiator SKBl Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Spl icing through Altering Hi stone H4R3 and Smal l Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cel l, 23 : 396 - 411 ) 。 高 等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化， 从而将胞外的信号变为胞 内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内， 激活转录因子， 而激 活转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。 尽 管研究者已从不同侧面开展了大量研究， 但由于其机制十分复杂， 植物抗盐中的许多 重要问题仍有待探索。 例如， 植物抗盐的关键因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并 不十分清楚。

发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆了小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白（本文命名为 NHX1 )的编码基因， 并测定了其 DNA序列。 并且发现通过转基因将其导入植株后， 可明显改善转基因植 株的耐盐性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX1 的编码基因 (本文命名为 7¾ tt ) ， 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的， 优选地， 所述表达载体是

PCAMBIA2300; 并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可 操作地连接； 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-ThNHXl-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将本发明第一方面所 述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条 件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的 植物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组 表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育 种的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明

图 1是 NHX1基因的植物表达载体 （35S-ThNHXl-2300) 构建流程 （图 la-lb) 。 图 2是 NHX1基因的植物表达载体 （35S-ThNHXl-2300) 的质粒图。 图 3是培养的供试植物拟南芥。 图 4是 ThNHXl转基因拟南芥的 T1代植株的耐盐实验结果， Tla4表现出明显的 耐盐性， Tlal7、 Tlal9的结果与其类似， 在此未示出。

图 5为利用反转录 1^1 对1代转基因烟草植株和非转基因对照植株中 ThNHXl基 因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-4为 不耐盐的对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThNHXl-2300质粒）， 5-12 为耐盐 T1代转基因拟南芥植株。

具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出 于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1. 盐胁迫下小盐芥 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select^TM>

( 1 ) 供试材料：

小盐芥 （ TheUungieUa halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色 植物园盐生植物繁育中心） 播种到灭菌的蛭石上， 在 22°C、 光周期 12 小时光照 /12 小时黑暗 （光强 3000-4000 Lx) 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 （含有 9.39 mM KN0₃>2P0₄，>4，>2，>3B0₃，>4，>4，>2Mo0₄，>2，>2EDTA,>4)>

( 2 ) 材料处理：

将供试植株分为 2组， 每组 4盆， 每盆 3株。 第一组为对照组， 正常地用 1/2MS 浇灌；第二组为盐处理组，浇灌含有 300 mM NaCl的 1/2MS溶液，将两组植物在 22°C、 光周期 12小时光照 /12小时黑暗 （光强 3000-4000 Lx) 条件下培养处理 10天， 然后 及时收集两组植株（用蒸熘水洗净根部）， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。 ( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的小盐芥 3.0 g， 用植物 RNA 提取试剂盒 （购自 Invitrogen)提取总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆。/OD₂₈。比值为>

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM>

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书， 将所述第二次正向差减杂 交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯 化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 在 200 l PCR管中 依次加入下列成分： 纯化第二次 PCR产物 3 μ 1、 2 Χ Τ4连接酶缓冲液 5 μ pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 T4 DNA连接酶 1 μ 1， 于 4°C连接过夜。 然后取 10 μ 1连接反应产 物， 加入到 100 μ 1感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA)中， 冰浴 30分钟、 42 °C 热休克 60秒、 冰浴 2分钟， 另加 250 μ 1 LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（ Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5%酵母提取物 （Yeast Extract, 购自 OXOID ) 禾 P 1% NaCl (购自国 药）） 后置于 37°C摇床中， 以 225 rpm振荡培养 30分钟， 然后从中取 200 μ 1菌液接 种于含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB (同上) /X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷) /IPTG (异丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷） ( X-gal/IPTG购自 TAKARA)培养板上， 37°C 培育 18小时。 计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落， 随机挑取 450个白 色菌落（编号： Th-S001至 Th-S450 ) 。 将所挑取白色菌落克隆接种于 96孔细胞培养 板 （CORNING) 中的含 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基， 37°C培养过夜后加 甘油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， 然后于 -80°C保存备用。 对所培养的菌落克隆 以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒） 进行菌液 PCR扩增验证， 得到 342个阳性克隆， 然后将所有 阳性克隆送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 301条有效 表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST ) ( Unigene ) 。

实施例 2小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白基因 ThNHXl的克隆

将所述鉴定的小盐芥 SSH文库中来自菌落 Th-S211的克隆子去掉冗余 DNA后， 序 列为 SEQ ID No : 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白属于液泡膜钠氢反向转运蛋 白。 本文将 SEQ ID No: 3序列对应的全长编码基因命名为 7¾NHJW， 其对应的蛋白 命名为 NHX1。

SEQ ID No: 3：

1 ACCTCTTCTT CACTAGCACA ATCCTCGGAA TTGCTGTGGG GTTAGTAACG TCTTATGTCC 61 TGAAAACCTT GTATTTTGGA AGACACTCAA CTACACGTGA ACTCGCGATC ATGGTTCTTA

121 TGGCATACCT TTCATATATG TTAGCTGAGC TCTTCTCATT AAGTGGGATT CTCACCGTTT

181 TCTTCTGTGG CGTTTTAATG TCGCATTATG CATCTTATAA TGTGACAGAA AGTTCAAGAA

241 TCACTTCAAG GCATGTGTTT GCAATGTTGT CCTTTATAGC GGAGACGTTC ATATTTTTAT

301 ATGTTGGAAC AGATGCTCTT GATCTTACAA AGTGGAAGAC AAGCAGCTTA AGCGTTGGGG 361 GT

ThNHXl全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计如下两条特异性引物， 作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。

ThNHXl GSP1 : SEQ ID No: 4：

TCTTCTGTGG CGTTTTAATG TC

ThNHXl GSP2: SEQ ID No: 5：

TCACTTCAAG GCATGTGTTT GCA

实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。

用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。 所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72 °C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产 物中片段约为 800 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中 （具体方法同上）， 并 在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行菌液 PCR 扩增， 得到 6个阳性克隆， 将 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的 77 NHJW基因片段， 设计如下三条特异性引物， 作为 5 ' RACE 的 3 ' 端特异性引物。

ThNHXl GSP3： SEQ ID No: 6：

AGTGATTCTT GAACTTTCTG TC

ThNHXl GSP4: SEQ ID No: 7：

AACATATATG AAAGGTATGC CA

ThNHXl GSP5 : SEQ ID No: 8：

GATCGCGAGT TCACGTGTAG TTG

实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。

用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6) 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ 1以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 55 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8与 引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72°C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产 物中片段约为 800 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中 （具体方法同上）， 并 在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上）， 得到 7个阳性克隆， 选取其中 4个克隆送至 英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。 所得的 5'RACE产物克隆测序后， 将其与 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3 序列进行拼接。 获得 7¾ Ώ 全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9：

1 GTGTCTACTT TGTTTGCGAT TTGTGTTGTA TTAAGGATCT AGAATCGACG AAAGTGAAAA

61 ACATTTTTCG AAAGTCTTTT TTTGTTGGTC GTGAAAATGG GTGTTGGATT TACAGAGTTT

121 TTTTCGATAC ACCTAGCCAC GGAGCATCCT CAGGTGATAC CAATCTCGGT GTTCATCGTC

181 ATTCTCTGCC TCTGTTTAGT TATCGGCCAC TTGCTTGAAG AGAACCGATG GGTCAATGAA

241 TCCATTACCG CCATTTTAGT CGGAGCAGTA TCAGGAACGG TTATATTGCT TATTAGTAGA

301 GGAAAGAGTT CTCACATTTT GGTGTTTGAT GAAGAACTCT TCTTCATATA CCTTCTTCCT

361 CCAATCATTT TCAATGCTGG ATTCCAAGTC AAGAAAAAGA AGTTTTTTCA CAACTTTTTA

421 ACCATCATGT CGTTTGGTGT GATTGGTGTT TTCATCTCCA CTGTCATTAT TTCGTTTGGC

481 ACTTGGTGGC TTTTTCCCAA GTTGGGATTT AAGGGATTGA GTGCTCGAGA CTATCTTGCC

541 ATCGGAACGA TTTTCTCGTC AACTGATACC GTTTGCACTC TACAGATTCT TCATCAAGAT

601 GAAACTCCAT TGCTATACAG CTTAGTCTTT GGAGAAGGAG TAGTGAATGA TGCAACCTCA

661 GTTGTGCTGT TCAACGCCGT GCAGAAGATT CACTTCGAAA GCCTCAACGG TTGGACGGCT

721 CTGCGAGTCT TTGGAAACTT TTTGTACCTC TTCTTCACTA GCACAATCCT CGGAATTGCT

781 GTGGGGTTAG TAACGTCTTA TGTCCTGAAA ACCTTGTATT TTGGAAGACA CTCAACTACA

841 CGTGAACTCG CGATCATGGT TCTTATGGCA TACCTTTCAT ATATGTTAGC TGAGCTCTTC

901 TCATTAAGTG GGATTCTCAC CGTTTTCTTC TGTGGCGTTT TAATGTCGCA TTATGCATCT

961 TATAATGTGA CAGAAAGTTC AAGAATCACT TCAAGGCATG TGTTTGCAAT GTTGTCCTTT

1021 ATAGCGGAGA CGTTCATATT TTTATATGTT GGAACAGATG CTCTTGATCT TACAAAGTGG

1081 AAGACAAGCA GCTTAAGCGT TGGGGGTACT TTGGGTGTCT CCGGTGTCAT AACCACATTA

1141 GTATTGCTTG GACGAGCAGC GTTTGTGTTT CCACTCTCGG TTTTTACAAA TTTCATGAAT

1201 AGAAACACTG AAAGAAGCGA GACTATCACA TTTAAGCACC AGGTGATTAT TTGGTGGGCT

1261 GGGCTTATGC GAGGTGCTGT CTCAATTGCT CTGGCTTTCA AACAGTTCAC ATACTCTGGT

1321 GTTACATTGG ATCCTGTGAA TGCTGCCATG GTCACAAACA CCACTATCGT TGTCCTCTTT

1381 ACTACACTGG TCTTTGGTTT CCTCACAAAG CCACTTGTGA ACTATCTGCT TCCTCATGAT

1441 GCAAATCAAA ACACTGGAGG AAATGGAGGT AAACACACTG CGCCAGGTTC CCCGAGGGAA

1501 GATGCGACGC TTCCTCTCCT CTCCTTTGAC GAGTCTGCTT CCACCAACTT CAACAGAGCT

1561 AAAGATAGTA TCTCCCTTCT GATGGAACAG CCTGTTTACA CTATCCACCG CTACTGGAGG 1621 AAGTTCGACG ATACATACAT GAGACCTATC TTTGGTGGAC CTCGTCGAGA TAATCAACCA

1681 GAATGCTAGT TTATGATTTA GGTTCTCCTC AGGGAATGCA TGATGAGTTA GTTTTTTTGG

1741 ATAGTGGATG TAGTGAAAAA CCAGTATATG TTATAGTTTT CTTTAATGTA TAGAACAAGG

1801 TTCTTCTATA TACACAAGGT GATCGAAGAT CATTTCAAAA AAAAAAAAAA AAA

根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下:

SEQ ID No: 10：

ATGGGTGTTGGATT TACAGAGTT SEQ ID No: 11：

CTAGCATTCT GGTTGATTAT CTC 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 ThNHXl全长编码基因。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以盐处理组小盐芥的 cDNA为模板 进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 10 y l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 10禾口 SEQ ID NO:

11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 ( 94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟， 离心， 去上清， 晾干， 然后用 21 μ ΐ 双蒸水溶解。 然后向其中加入 2.5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer 0.5 μ 1 5 mM的 dATP、 1.0 μ 1 Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分 钟。 将得到的约 1600 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体上（得到 ThNHXl-pGEM质粒）， 然后转化大肠杆菌 JM109感受态细胞中 (方法同上）， 并在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10 个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后 加甘油至终浓度 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 5个阳性克隆， 选取其中 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序， 所得序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

NHX1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MGVGFTEFFS IHLATEHPQV

21 IPISVFIVIL CLCLVIGHLL

41 EENRWVNESI TAILVGAVSG

61 TVILLISRG SSHILVFDEE

81 LFFIYLLPPI IFNAGFQV

101 FFHNFLTI MSFGVIGVFI

121 STVIISFGTW WLFP LGF G 141 LSARDYLAIG TIFSSTDTVC

161 TLQILHQDET PLLYSLVFGE

181 GVVNDATSVV LFNAVQKIHF

201 ESLNGWTALR VFGNFLYLFF

221 TSTILGIAVG LVTSYVL TL

241 YFGRHSTTRE LAIMVLMAYL

261 SYMLAELFSL SGILTVFFCG

281 VLMSHYASYN VTESSRITSR

301 HVFAMLSFIA ETFIFLYVGT

321 DALDLT W T SSLSVGGTLG

341 VSGVITTLVL LGRAAFVFPL

361 SVFTNFMNRN TERSETITF

381 HQVI IWWAGL MRGAVSIALA

401 F QFTYSGVT LDPVNAAMVT

421 NTTIVVLFTT LVFGFLT PL

441 VNYLLPHDAN QNTGGNGG腿

461 TAPGSPREDA TLPLLSFDES

481 ASTNFNRAKD SISLLMEQPV

501 YTIHRYWR F DDTY置 PIFG

521 GPRRDNQPEC *

ThNHXl基因的核苷酸序列 SEQ ID NO : ： 2

1 ATGGGTGTTG GATTTACAGA GTTTTTTTCG ATACACCTAG CCACGGAGCA TCCTCAGGTG

61 ATACCAATCT CGGTGTTCAT CGTCATTCTC TGCCTCTGTT TAGTTATCGG CCACTTGCTT

121 GAAGAGAACC GATGGGTCAA TGAATCCATT ACCGCCATTT TAGTCGGAGC AGTATCAGGA

181 ACGGTTATAT TGCTTATTAG TAGAGGAAAG AGTTCTCACA TTTTGGTGTT TGATGAAGAA

241 CTCTTCTTCA TATACCTTCT TCCTCCAATC ATTTTCAATG CTGGATTCCA AGTCAAGAAA

301 AAGAAGTTTT TTCACAACTT TTTAACCATC ATGTCGTTTG GTGTGATTGG TGTTTTCATC

361 TCCACTGTCA TTATTTCGTT TGGCACTTGG TGGCTTTTTC CCAAGTTGGG ATTTAAGGGA

421 TTGAGTGCTC GAGACTATCT TGCCATCGGA ACGATTTTCT CGTCAACTGA TACCGTTTGC

481 ACTCTACAGA TTCTTCATCA AGATGAAACT CCATTGCTAT ACAGCTTAGT CTTTGGAGAA

541 GGAGTAGTGA ATGATGCAAC CTCAGTTGTG CTGTTCAACG CCGTGCAGAA GATTCACTTC

601 GAAAGCCTCA ACGGTTGGAC GGCTCTGCGA GTCTTTGGAA ACTTTTTGTA CCTCTTCTTC

661 ACTAGCACAA TCCTCGGAAT TGCTGTGGGG TTAGTAACGT CTTATGTCCT GAAAACCTTG

721 TATTTTGGAA GACACTCAAC TACACGTGAA CTCGCGATCA TGGTTCTTAT GGCATACCTT

781 TCATATATGT TAGCTGAGCT CTTCTCATTA AGTGGGATTC TCACCGTTTT CTTCTGTGGC

841 GTTTTAATGT CGCATTATGC ATCTTATAAT GTGACAGAAA GTTCAAGAAT CACTTCAAGG

901 CATGTGTTTG CAATGTTGTC CTTTATAGCG GAGACGTTCA TATTTTTATA TGTTGGAACA

961 GATGCTCTTG ATCTTACAAA GTGGAAGACA AGCAGCTTAA GCGTTGGGGG TACTTTGGGT

1021 GTCTCCGGTG TCATAACCAC ATTAGTATTG CTTGGACGAG CAGCGTTTGT GTTTCCACTC

1081 TCGGTTTTTA CAAATTTCAT GAATAGAAAC ACTGAAAGAA GCGAGACTAT CACATTTAAG

1141 CACCAGGTGA TTATTTGGTG GGCTGGGCTT ATGCGAGGTG CTGTCTCAAT TGCTCTGGCT

1201 TTCAAACAGT TCACATACTC TGGTGTTACA TTGGATCCTG TGAATGCTGC CATGGTCACA

1261 AACACCACTA TCGTTGTCCT CTTTACTACA CTGGTCTTTG GTTTCCTCAC AAAGCCACTT

1321 GTGAACTATC TGCTTCCTCA TGATGCAAAT CAAAACACTG GAGGAAATGG AGGTAAACAC

1381 ACTGCGCCAG GTTCCCCGAG GGAAGATGCG ACGCTTCCTC TCCTCTCCTT TGACGAGTCT

1441 GCTTCCACCA ACTTCAACAG AGCTAAAGAT AGTATCTCCC TTCTGATGGA ACAGCCTGTT 1501 TACACTATCC ACCGCTACTG GAGGAAGTTC GACGATACAT ACATGAGACC TATCTTTGGT 1561 GGACCTCGTC GAGATAATCA ACCAGAATGC TAG 实施例 3 ThNHXl基因的植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 ThNHXl 基因的启动子和终止子， 构建流程图如图 1所示。

用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13以植物表达载体 pBI121 (购自北京华 夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合 酶。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121、 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13各 2.0 μ 1以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C 变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C 延伸 10分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明 （Promega, T4 连接酶试剂盒） 连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO: 13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15 以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 pBI121 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预 变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C 延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接 （Promega T4 连接酶 试剂盒） 到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTAACGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA 用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300为模板扩增 35S启 动子。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 l 2.5 mM dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延 伸 30秒） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Sail酶切将所得的 PCR产物连接 （连 接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 7¾ tt 编码基因的全长序列（模 板是实施例 2所获得阳性 ThNHXl-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ThNHXl-pGEM 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 18禾 P SEQ ID NO: 19各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循 环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 Sal l、 Kpn l酶切将所得的 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3， 获得 植物表达载体 35S-ThNHXl-2300 (图 2 ) 。

SEQ ID NO: 18

ACTGTCGACATGGGTGTTGGATT TACAGAGTTT

SEQ ID NO: 19

ACTGGTACCCTAGCATTCT GGTTGATTAT CTCG

实施例 4 35S-ThNHXl-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc)感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 单斑接种， 28 °C培养 1 至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜 （约 12-16小时） 至 OD_6QQ>6QQ=0.8。>

转化农杆菌： 在冰上融化所述的 LBA4404感受态细胞， 向 40 μ 1的感受态细胞 中加入 1 μ 1实施例 3获得的质粒 35S-ThNHXl-2300， 混匀后冰浴约 10分钟。 将冰浴 后的感受态细胞和 35S-ThNHXl-2300 质粒的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯 (购自 Bio-Rad) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部， 注意不要有气泡。 将所述电击 杯放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0.1 cm规 格的电击杯的时候， MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 " Agr" ， 电击一次。 立即取出电击杯， 加入 28 °C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。 快速而轻柔的用移液枪将感受 态细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 在 28 °C下 225 rpm摇动培养 1小时。 取 100-200 μ ΐ 的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB 固体培养基， 含 50 y g/ml利福平、 50 y g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素） ， 28 °C培养。 筛选阳性转化 克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用。 实施例 5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 直径 9 cm的花盆， 每盆播种 20-30颗。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一 个湿润的环境。 恒温 22 °C， 光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗、 12 小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 30天后， 保留 4_5棵植株， 光照周期调 整为 8小时黑暗、 16小时光照培养，待大部分植株都抽薹之后， 在花序基部剪掉整个 主苔， 去其顶端优势， 约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔， 待侧苔花序形成花 蕾并部分开花或形成 1-2个角果时， 便可用于转化 （图 3 ) 。 实施例 6 拟南芥花浸转化：

将实施例 4获得的已转化表达载体的农杆菌菌液接种至含有 10-50 μ g/ml卡那霉 素（kan) 的 LB培养基中培养过夜， 第二天早上按 1： 50接种至含抗生素的新的 LB培 养基中（1L)，培养约 8个小时，农杆菌液 0D₆。。应当在>6。。在>

种子消毒： 先用 70%乙醇浸泡 10分钟， 在上述处理时要不时地使种子悬浮； 然 后用无菌水洗四次， 在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。 处理后的种子均匀涂布 在含 50 g/ml kan的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天 （一块 150 mm直径的平 皿最多播种 1500棵） ， 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000 k， 光照周期为 12小时黑暗 、 12小时光照培养， 培养 7-10天。 根据生长状况判断是否为转基因种子。 成功转入 重组质粒的种子能够在抗性培养基上正常生长出 4片以上真叶。非转基因种子不能正 常生长， 仅能长出 2片子叶， 根的生长也受到严重抑制， 一般萌发 10天以后死亡。 转基因种子在 MS+kan平板上萌发 2周以后， 将阳性植株转入土壤继续培养， 转基因 拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测， 去除阴性植株， 收集阳性 植株种子， 标号： T0al-T0a25。 实施例 8 过表达 ThNHXl的转基因拟南芥 T1代植株的种植

选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 TO_al-TOa20每个转化子播种>

转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆不作处理， 正常浇灌 1/2MS, 转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆浇灌含有 150 Mm NaCl的 1/2MS, 恒温 22V， 光照强度 3500-4000 lx ， 12 小时光培养 /12 小时暗培养循环。 10 天后观察实验结果： T1 代转基因植株 ( T0代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， T1代转基因植株 Tla4、 Tlal7、 Tlal9三个株系表现出明显的耐盐性 （见图 4， 以 Tla4例， Tla7、 Tlal9的 结果与其类似， 在此未示出） 实施例 10 在转录水平上验证 7¾ tt 基因的表达 实施例 9中耐盐好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵 （分别属于上述三个耐盐 株系）， 实施例 9中对照植株随机选取 4棵， 各剪取盐处理 14天的叶片 0.05 g， 用植 物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。 紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm 和 280 nm 的吸光度值， 计算各个 RNA 浓度。 依照 Invitrogen 反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 （1 μ g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 11 ) 。 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO : 20： ATTCCGAGGA TTGTGCTAGT GA) 扩增 ThNHXl , 检测其转录情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反 应。 50 y l PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ l PrimeSTAR、10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 20各 2.0 μ 1以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 32个循环（94°C 变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。 产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司） ， 1-4为不耐 盐对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照 （35S-ThNHXl-2300质粒） ， 5-12为耐 盐 T1 代转引物拟南芥植株。 图中所示条带大小与阳性对照的大小一致 （约为 700 bp ) 。 结果表明， 耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 ThNHXl的转录较强， 不耐盐对照 拟南芥植株中没有 ThNHXl的转录。