一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法

摘要

本发明公开了一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法通过在乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei？Zhang的argG和argH基因，得到了一株乙醇胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)。在5％乙醇胁迫条件下，重组菌株L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)相对于对照菌株生物量分别提高了25.7％和21.2％；15％乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5.97和4.65倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲料、 精细化学品等工业领域中。在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可避免的 面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，严重限 制着乳酸菌生长性能和发酵力。

乙醇属有机溶剂，对菌体的毒害主要表现在对细胞膜的破坏上。乙醇渗入膜结构改变它 们的组织和功能，乙醇不仅抑制细菌的生长，乙醇浓度过高还会影响菌体的新陈代谢、生理 活性、影响基体的酶活性等，甚至导致菌体死亡。因此，提供一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性 的方法尤为重要。

本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ArgG和ArgH蛋白，调节天冬氨酸到精氨酸的代谢 通路，从而实现了乳酸乳球菌对于乙醇胁迫抗性能力的提高。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种提高乳酸菌抵御乙醇胁迫的方法，从而提高乳酸 乳球菌对于乙醇胁迫条件的适应能力。

本发明的第一个目的是提供一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，是在乳酸菌中过表达 精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

在本发明的一种实施方式中，所述ArgG的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述ArgG的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述ArgH的核苷酸序列是SEQIDNO.4所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将编码ArgG或者ArgH的基因序列连接到表达 载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主乳酸菌中并诱导重组菌表达ArgG或者 ArgH，再将重组菌置于乙醇胁迫环境中。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导重组菌表达是将在GM17培养基中，使用nisin(一 种乳酸链球菌素)进行诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148、pNZ8149或pNZ8150。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主乳酸菌为LactococcuslactisNZ9000。

本发明还提供一种乙醇胁迫抗性提高的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌过表 达了精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

在本发明的一种实施方式中，所述重组乳酸菌以LactococcuslactisNZ9000为宿主、 pNZ8148为载体过表达了氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的ArgG。

本发明的有益效果：

通过采用在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸合成酶(ArgG)或精氨酰琥珀酸裂解酶 (ArgH)的方法，显著提高了乳酸菌的乙醇胁迫抗性能力。采用本发明方法，在5％乙醇胁 迫条件下，使重组菌株L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)相对于对照 菌株的生物量分别提高了25.7％和21.2％；同时，过表达ArgG或ArgH的重组菌，在15％ 乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5.97和4.65倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148-argH的结构图；

图2：重组菌株蛋白电泳图；其中，M：蛋白Marker；G：L.lactisNZ9000(pNZ-argG)；H：L. lactisNZ9000(pNZ-argH)；VEC：L.lactisNZ9000(pNZ8148)；

图3：5％乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比；

图4：15％乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株存活率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1重组菌株的构建

从NCBI数据库的L.caseiZhang中得到ArgG和ArgH蛋白的基因序列(分别如SEQID NO.2、SEQIDNO.4所示)，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒 pNZ8148-argG和pNZ8148-argH，再将其电转入宿主菌L.lactisNZ9000中，得到重组菌株L. lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)。

具体如下：

根据argG和argH的基因序列分别设计引物ArgGF、ArgGR、ArgHF和ArgHR(表1)， 以L.caseiZhang的基因组为模板进行PCR扩增，获得argG和argH基因片段。将PCR产物 和载体pNZ8148分别用SpeI和SphI双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物电转 化L.lactisNZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证， 片段大小正确后，经测序验证正确后最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)。

电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放 置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL 含有20mMMgCl₂和2mMCaCl₂的GM17培养基(GM17培养基配方：M17培养基+0.5％ glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑 取转化子验证。

表1引物

实施例2ArgG和ArgH蛋白的诱导表达与检测

诱导重组菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)表达ArgG和ArgH 蛋白，并用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株中ArgG和ArgH蛋白的表达情况，发现与ArgG 和ArgH蛋白大小相似的条带的量显著增加。

具体过程如下：

将菌株L.lactisNZ9000(pNZ8148)(即含有pNZ8148空质粒的L.lactisNZ9000菌株)和 重组菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)接种于含有10μg/mL氯霉素 的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯 霉素的GM17培养基中，待生长至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin(一种乳酸链球菌素) 诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)离心洗涤两次后重悬于 相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE分 析。

经SDS-PAGE分析，重组菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)分 别成功的表达了ArgG和ArgH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量约为45kDa和52kDa处的蛋 白质条带显著变厚重，与目标蛋白ArgG和ArgH的分子量基本一致，说明成功地在L.lactis NZ9000中表达了ArgG和ArgH蛋白。

实施例3乙醇胁迫下生长性能试验

对于考察菌株在胁迫条件下的生长情况，将菌株L.lactisNZ9000(pNZ8148)和L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL) 培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17 培养基中，待生长至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin，诱导培养至OD2.0。将诱导后的培 养液以2％的接种量转接至新鲜的GM17(含10μg/mL氯霉素，10ng/mLnisin，5％乙醇，v/v) 培养基中。分别测定重组菌株和对照菌株在胁迫条件下的生长性能。

结果如图3所示。经生长性能试验分析，L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactis NZ9000(pNZ-argH)相对对照菌株生物量显著提高，分别提高25.7％和21.2％，说明在L.lactis NZ9000中表达了ArgG和ArgH蛋白后，菌株乙醇胁迫抗性显著提高。

实施例4乙醇胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对乙醇的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在15％乙醇胁 迫条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养至OD2.0，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗 涤两次后重悬于等体积的新鲜的含有15％乙醇的GM17中，胁迫不同的时间。胁迫后的菌悬 液洗涤两次后重悬于等体积生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17平板 上测定活菌数和存活率。

经耐受性实验分析(结果如图4所示)，在15％的GM17中胁迫5h后，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)的存活率分别是对照菌株的5.97和4.65倍， 说明重组菌株对乙醇胁迫的耐受性显著提高。

结合实施例3、4分析，可知在L.lactisNZ9000中表达了ArgG或ArgH蛋白后，菌株乙 醇耐受性显著提高。说明通过在L.lactisNZ9000中表达ArgG或ArgH蛋白的方法可以提高 乳酸乳球菌乙醇胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。