分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的特异性引物及方法

摘要

本发明提供一种分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的特异性引物及方法，属于生物技术领域，特异识别草珊瑚的上游特异性引物SgF：5’-TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA-3’与下游引物trnL-Fb；同时特异性识别金粟兰、及己和宽叶金粟兰的特异上游引物ChF：5’-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC-3’与下游引物trnL-Ff。通过这2对引物构建荧光定量PCR，进行混合样品的中特定样品的分子定量分析。本发明提供一种可准确，快速，简单定量分析草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3种混淆品的技术，为相关草珊瑚饮片与这3种混淆品的混合品定量分析提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的特异性引物及方法，具体为一种鉴别草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai，金粟兰Chloranthusspicatus,及己Chloranthusserratus，与宽叶金粟兰Chloranthushenryi的分子定量分析的特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对草珊瑚与金粟兰，及己和宽叶金粟兰等3种混合品快速定量分析方法。

背景技术

草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai，俗称肿节风，通常用于治疗花斑癣、紫癜、风湿性关节痛、外伤。现代研究表明有治疗癌症、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和非特异性免疫增强上等药理作用。然而，野生植物种质资源近年来已经减少，由于金粟兰，宽叶金粟兰、及己外形与草珊瑚极其相似，很容易与草珊瑚相混淆。但是他们有不同的属性和药用价值，这些易混植物也都有相应的肝毒性作用，及己在严重肝毒性病例报告和动物的毒性研究中已经证实有显著肝毒性，这限制了它在临床上的应用。

虽然草珊瑚新鲜叶片可以通过静脉、附属物和叶的非腺毛维管束结构之间的显微鉴定差异从其混淆品中鉴别出来，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通过形态学和组织学技术是很难识别的。在过去的几年中，利用化学分析技术如TLC、HPLC、MS等识别草珊瑚及其相关制剂已经有所记载。虽然这些方法在某种程度上可以补充形态学或组织学鉴定的局限性，但化学指纹图谱只能检测部分化合物，只能提供有限的物种组成信息，不能给我们提供完全鉴别出草珊瑚的方法，而且很难进行定量分析，特别是在和它极为相似的物种相互混杂时。因此，建立草珊瑚与金粟兰、及己和宽叶金粟兰等产品混合时进行定量分析方法，比便对其相关产品对监测质量至关重要。

随着分子生物学的发展，DNA分子标记如RAPD、ISSR和SSR等分子标记，ITS（Internaltranscribedspacer）等DNA条形码技术提供了可靠的识别药材的方法。然而，这些基于基因组DNA的分子标记技术容易受到基因组DNA降解的影响，由于核基因组DNA比叶绿体DNA拷贝数少，在加工过的药材中更容易遭破坏而导致无法通过其分子标记技术进行鉴别。叶绿体DNAtrnL-F区域的包含trnL（UAA）内含子和间隔，即trnL（UAA）-trnF（GAA）区作为DNA条形码，它可以很容易利用通用引物进行扩增，这一序列已被证明可用于对多种植物在种水平的识别，被广泛用于植物产品的检测。

本课题组在前期研究中也发现，对于干燥或经加工过的药材，基于叶绿体DNAtrnL-F区域的鉴别技术比基于核基因组DNA的分子标记技术更为稳定有效。本研究对草珊瑚、金粟兰、宽叶金粟兰和及己的trnL-F区序列进行测序，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphismSNP)分子标记，设计分别识别草珊瑚，金粟兰、宽叶金粟兰和及己的特异识别引物，建立多重PCR技术，鉴定引物的特异性，在此基础上，利用这些特异引物对，构建实时荧光定量PCR,可快速简单定量分析草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3种混淆品的方法。本发明为草珊瑚与3个混淆种的分子定量分析提供了技术支持，对相关中药饮片进行定量分析具有非常重要的意义，检索未见草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己等3种混淆品的分子定量的发明专利申请。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种可准确，快速，简单定量分析草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3种混淆品的技术，为相关草珊瑚饮片与这3种混淆品的混合品定量分析提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的的特异性引物，特异识别草珊瑚的上游特异性引物SgF：5’-TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA-3’与下游引物trnL-Fb：5’-GGGACTTGAACCCTCACGATT-3’；同时特异性识别金粟兰、及己和宽叶金粟兰的特异上游引物ChF：5’-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC-3’与下游引物trnL-Ff：5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’。

分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的方法，构建荧光定量PCR进行40个循环，反应体系

如下：总量为20μL，从植物中提取10ng的DNA作为扩增模版，10μL2×SYBRGreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0.2μM上游特异引物，0.2μM下游通用引物，其余为无菌水；反应程序如下：在实时定量PCR仪器（ABI7900）种，50℃预变性2分钟，95℃预变性10分钟，在95℃变性15s，引物退火58℃15s和在72℃延伸30s，40个循环。

具体方法如下：

（1）设计特异识别引物，并验证其特异性

根据前期测序实验所得的草珊瑚、金粟兰，及己和宽叶金粟兰的trnL-F基因序列，分析其特异SNP位点，分别设计草珊瑚的上游特异性引物SgF（5’-TGATTCTGATAGATTTTTGAAGAATTGA-3’）、设计可同时特异性识别金粟兰，及己和宽叶金粟兰的特异上游引物ChF（5’-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC-3’）与下游通用引物trnL-Ff（5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’），构建多重PCR体系：总量为20μL，取10ng植物中提取的DNA作为模版,加入1μL1×TransStartTopTaqDNA聚合酶反应液，2μL10×TransStartTopTaqBuffer,dNTP2.5mM,0.2μM下游引物trnL-Ff和上游的两个特定的引物SgF、ChF各0.1μM，其余为无菌水。构建多重PCR体系，反应程序如下:在95℃预变性2分钟，在95℃变性30s，在50℃下引物退火30s和在72℃下延伸2分钟，进行35个循环，最后一个循环在72℃延伸7分钟，以确保完整的延伸产品。只有草珊瑚取得了575bp，金粟兰、及己和宽叶金粟兰生成特定的216bp，混合样品则同时产生575bp与216bp等2条条带。确认引物的特异性。

（2）定量分析方法：

草珊瑚的上游特异性引物SgF（5’-TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA-3’）与下游引物trnL-Fb（5’-GGGACTTGAACCCTCACGATT-3’）形成特异识别草珊瑚的引物对、同时特异性识别金粟兰、及己和宽叶金粟兰的特异上游引物ChF（5’-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC-3’）与下游引物trnL-Ff（5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’）形成特异识别金粟兰、及己和宽叶金粟兰等3种样品的引物对，分别构建实时定量PCR体系。构建荧光定量PCR进行40个循环，反应体系如下：总量为20μL，从植物中提取10ng的DNA作为扩增模版，10μL2×SYBRGreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0.2μM上游特异引物与0.2μM下游通用引物，其余为无菌水；反应程序如下：在实时定量PCR仪器（ABI7900）中，50℃预变性2分钟，95℃预变性10分钟；在95℃变性15s，引物退火58℃15s和在72℃延伸30s，40个循环。引物SgF和trnL-Fb用于混合产品中草珊瑚的定量分析；引物ChF和trnL-Ff用于混合产品中的金粟兰属(金粟兰、及己和宽叶金粟兰)的定量分析。所有引物的浓度均为0.2μM。实时定量PCR方法用于定量分析方法可由相对定量分析方法R=2^-△△Ct法推导出来，由于同一DNA样品中以其总DNA为模板进行扩增，混合样品总模版DNA相应的Ct（total）值是恒定的，即特定一个混合样品中的Ct（total）值是不变的。则掺杂物数量的比率在同一个样本中可以通过这个公式计算:

Ct（total）)为总混合样本的Ct值，Ct(Sg)为引物SgF、trnL-Fb的Ct值，即代表草珊瑚含量的Ct值，Ct(Ch)为引物trnL-Ff、ChF的Ct值，即代表三种混淆品含量的Ct值。

本发明的优点在于：

由于仅根据某些特征活性成分含量进行定量分析，易受植物成长环境等外在条件的影响，很难进行准确定量。本方法基于遗传物质DNA的含量进行分子定量，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学定量方法，更为准确，也更为简单方便。

由于叶绿体DNA比基因组DNA的拷贝数更多，在干燥及加工后的产品中更为稳定，本方法利用叶绿体DNA作为定量分析的检测对象，比利用基因组DNA作为检测对象，对加工的相关产品进行分子定量更为稳定可靠。

本方法可对草珊瑚与3种常见的混淆品同时进行分子定量分析，准确定量分析3种混淆品的存在比率，效率更高，更便捷。

附图说明

图1利用引物trnL-Ff，SgF，ChF多重PCR的产物凝胶电泳（M:2logDNAladder；1-8：草珊瑚；9-11：及己；12-13：宽叶金粟兰；14-15：草珊瑚、及己混合物；16：草珊瑚、宽叶金粟兰混合物）。

图2一对引物SgF、trnL-Fb的Ct/x曲线图（R²=0.9989)。

图3一对引物ChF、trnL-Ff的Ct/x曲线图（R²=0.9982)。

具体实施方式

仪器

PCR仪(Eppendorf，型号5332)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号DYY-12)，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R)，凝胶成像分析仪(BIO-RADChemiDocXRS)，微量移液器(Eppendorf)。

试剂

2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖(Promega公司)，溴化乙锭(Fluka公司)，TransStart?TopTaqDNAPolymerase(北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。

材料

本研究实验样品是由福建中医药大学魏艺聪讲师鉴定并收集的采自不同产地的样品：十三种草珊瑚、四种金粟兰、四种宽叶金粟兰和三种及己样本是从中国不同产地上收集。五种草珊瑚样品粉末和三种金粟兰样品粉末从当地市场收集得来。

提取：

⑴取5g新鲜草珊瑚和金粟兰属植物叶片剪碎，置于经过杀菌的研钵中，加入0.5gPVP粉末，再加入液氮迅速研磨，将粉末收集于袋子中，置于-20℃保存，长时间保存则置于-80℃中；

⑵取10mLCTAB溶液于65℃水中预热，再加0.2mL(200μL)巯基乙醇于预热的CTAB中（巯基乙醇：CTAB溶液=1:50）；

⑶取步骤（1）中的粉末0.2g于2mLEP管（离心管），迅速加入1ml预热的含有巯基乙醇的CTAB溶液（样品低温时加入），振荡2分钟将其放入65℃水浴锅，水浴约1小时；（每20分钟振荡一次，可适当多振荡几次）

⑷往管中加入600μL氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比=24:1，必须在通风橱操作），摇匀5分钟，再将其置于15-20℃以12000rpm离心10分钟；

⑸取600μL上清液，再加入1.2mL（2倍）预冷的无水乙醇或360μL（0.6倍）异丙醇，置于-20℃沉淀约3小时或过夜；

⑹取出EP管于4℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，倒置于吸水纸数分钟；

⑺再加入700μL70％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，后于4℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，再重复一遍，最后置于超净台中吹干；（注意：不可吹干过度）

⑻在EP管中加入30-50μL去离子水（ddH2O）或1×TE溶液，于4℃放置3小时或过夜，使其充分溶解，若手摇难以溶解，可用混匀机进行混匀，促其溶解；

⑼可用琼脂糖凝胶检测其是否含基因组DNA，后进行纯化。

引物特异性识别分析

根据前期测序实验所得的草珊瑚、金粟兰，及己和宽叶金粟兰的trnL-F基因序列，分析其特异SNP位点，分别设计草珊瑚、及己和宽叶金粟兰的上游特异性引物SgF（5’-TGATTCTGATAGATTTTTGAAGAATTGA-3’）、ChF（5’-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC-3’）分别与下游通用引物trnL-Ff（5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’）构建多重PCR体系：总量为20μL，取10ng植物中提取的DNA作为模板，加入1μL1×TransStartTopTaqDNA聚合酶反应液(TransGen生物技术)，2μL10×TransStartTopTaqBuffer,dNTP2.5mM,0.2μM下游引物trnL-Ff和0.1μM上游的两个特定的引物SgF、ChF，其余为无菌水。构建多重PCR体系，反应程序如下：在95℃预变性2分钟，在95℃30s变性，在50℃的引物退火30s和在72℃延伸2分钟，进行35个循环。最后一个循环在72℃延伸7分钟，以确保完整的延伸产品。只有草珊瑚取得了575bp，及己和宽叶金粟兰生成特定的216bp，混合样品则同时产生575bp与216bp等2条条带，见图1。

利用特异性引物进行分子定量分析

为确定该特定的引物是否适合于混合样品的分子定量分析，我们用梯度稀释的草珊瑚及其易混植物的混合物DNA样品进行了实时PCR检测。受试样本DNA进行连续十倍稀释（1/10/100/1000/10000倍稀释），在总量为20μL反应系统中加入为2μL样品DNA作为模版。相对于特定DNA的Ct值构建一个曲线，结果表明，2对特异引物的Ct值与起始模板的对数存在线性关系，且R²>0.99，说明设计这2对引物可对未知样品进行定量测定，因此，所设计的实时荧光定量PCR是有效对该混合样品进行分子定量的方法。如（图2）和（图3）所示，一对引物SgF、trnL-Fb扩增的Ct值与样品相对量的对数值形成回归曲线：

Y=-3.0885log(X)+39.015,R²=0.9989。

同样，一对引物ChF和trnL-Ff扩增的Ct值与样品相对量的对数值形成回归曲线：

Y=-3.5698log(X)+37.004,R²=0.9982。

在这项研究中，该混用样品的2对引物的Ct值与DNA模板的4个稀释浓度(1/10/100/1000倍稀释)的均存在线性关系，因此，在该稀释浓度范围内可被准确定量。草珊瑚与混淆品的叶绿体DNA在同一个样本易混植物中的含量比例可通过该方法计算，即3种混淆样品相对草珊瑚样品的相对含量可由以下公式计算:。

在本研究中，易混植物叶绿体DNA含量是高于草珊瑚的12.94倍。这些结果表明，实时PCR是一个足够敏感和准确的方法评估混合样品中草珊瑚与其3种混淆品的叶绿体DNA含量的比例，并根据这个含量进行评估草珊瑚及其易混植物混合样品的比例。因为在特定的混合样本中叶绿体DNA降解率是相对于草珊瑚及其易混植物是相同的，因此这种方法可有效对草珊瑚及其易混植物的混合样品进行分子定量分析。

表1Ct值绘制样品的相对数量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建中医药大学

<120>分子定量分析草珊瑚与3种混淆品的的特异性引物及方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgattctgatagatttttgaagaattga

28

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gggacttgaaccctcacgatt

21

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

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atctgatcacccttacacttacaagc

26

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atttgaactggtgacacgag

20