一种具有MAN和WGA修饰的双重靶向脂质体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有MAN和WGA修饰的双重靶向脂质体及其制备方法和应用。本发明提供的双重靶向脂质体，由脂质体和其表面的修饰物组成，所述脂质体表面的修饰物为4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷和麦胚凝集素。本发明还保护一种载药脂质体，是用所述的靶向脂质体包载药物得到的。所述药物具体可为盐酸表阿霉素和/或白藜芦醇。本发明提供的双重靶向脂质体采用双配体修饰、包载两种药物，发挥了双靶向作用，使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，进而在肿瘤部位富集，同时包载的两种药物可以在病灶部位产生协同或相加的疗效，提高化疗效果。本发明为制备治疗脑胶质瘤药物提供了一个新的思路，具有重要的理论意义与临床意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有MAN和WGA修饰的双重靶向脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

目前临床上脑胶质瘤的治疗仍面临着巨大挑战，非侵入性诊断与治疗成为脑胶质 瘤治疗的一个新方向，为提高治疗效果和延长患者的生存时间带来了希望。但是大部 分的治疗药物并没有很好的治疗效果，原因如下：(1)由于血脑屏障的存在，98％的 小分子药物和几乎全部的大分子药物都不能进入大脑内部的肿瘤部位发挥治疗作用； (2)能透过血脑屏障的治疗药物不能很好的在肿瘤部位富集，大部分扩散到正常的 脑组织，引起严重的不良反应，甚至导致患者死亡。因此想要有效的治疗脑胶质瘤需 要克服两个障碍：血脑屏障和脑-胶质瘤屏障。为满足脑胶质瘤的治疗需求，研究一 种新的给药系统既能使药物透过血脑屏障又能靶向脑胶质瘤在肿瘤部位尽可能的富 集，这样既能减少治疗药物对正常脑组织的毒副作用，又能提高治疗效果。

表阿霉素(Epirubicin，EPI)为阿霉素的一种新的蒽环霉素衍生物，是一种广谱 的抗肿瘤药物，对多种肿瘤具有抑制作用，其作用机制主要为：表阿霉素分子插入DNA 链从而抑制DNA和RNA的合成；表阿霉素通过拓扑异构酶II触发DNA裂解，导致细 胞死亡。目前临床上已将表阿霉素用于乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、软组织肉 瘤、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌和急性白血病。与阿霉素相比，在相似的剂量下，表 阿霉素表现出更小的血液和心脏毒性。在一些体外的研究实验中，表阿霉素对脑胶质 瘤细胞具有很强的抑制作用，然而体内光学成像观测结果表明，受血脑屏障保护的大 脑区域未检测到表阿霉素。原因是由于血脑屏障的存在，表阿霉素无法到达脑组织对 脑胶质瘤发挥治疗作用。白黎芦醇(resveratrol，RES)是一种主要存在于葡萄中的 天然分子，具有多种生物学效应，如抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗炎症以及降低血糖 等，它对肿瘤的发生、促进和发展3个阶段都有明显的抑制作用。白藜芦醇抗肿瘤的 作用机制是通过抑制癌细胞合成、阻滞细胞周期、诱导癌细胞凋亡、抑制酶类并干扰 相关信号传导通路而发挥抗肿瘤作用，并且体内研究表明无明显的毒副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有MAN和WGA修饰的双重靶向脂质体及其制备方法和 应用。

本发明提供的双重靶向脂质体，由脂质体和其表面的修饰物组成，其特征在于： 所述脂质体表面的修饰物为4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷和麦胚凝集素。

所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷可连接于所述脂质体的氨基上；所述麦胚凝集 素可连接于所述脂质体的羧基上。所述脂质体的氨基可由DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂提供；所述 脂质体的羧基可由DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH提供。

具体来说：所述脂质体制备时，可在原料中加入DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂和 DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH，DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂和DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH结合到脂质体表面，提供用 于连接4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷和麦胚凝集素的氨基和羧基。

所述脂质体具体可用蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂作为原料制备得到。蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、 DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比可为(50-55)：(40-45)：4：(0.25-0.75)： (0.25-0.75)。蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比具体可为52:43:4:0.5:0.5。

所述靶向脂质体中，所述麦胚凝集素的质量与制备所述脂质体时蛋黄卵磷脂和胆 固醇的质量之和的配比可为(4-6)：30，具体可为5：30，所述4-氨基苯-α-D-吡喃 甘露糖苷的质量与制备所述脂质体时蛋黄卵磷脂和胆固醇的质量之和的配比可为 (1-2):30，具体可为1.5:30。

本发明还提供了一种靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

1)以蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂为原料制备表面具有氨基和羧基的脂质体；

2)将4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与步骤1)制备的脂质体的氨基连接，将麦 胚凝集素与步骤1)制备的脂质体的羧基连接；

得到靶向脂质体。

所述步骤1)中，制备脂质体的方法具体如下：

将蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂溶解 在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，35℃、40rpm旋转蒸发成膜，然后加入250mM硫酸铵 水溶液，然后进行超声处理(超声参数：每工作10s停30s，全程时间为10min,保护 温度为35℃)，然后使用脂质体挤压器分别过400nm聚碳脂膜3次和200nm聚碳脂膜 3次(顺序如下：400nm聚碳脂膜→400nm聚碳脂膜→400nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂 膜→200nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜)，然后装在透析袋中并置于pH7.4的PBS缓冲 液中透析，得到脂质体。

所述步骤2)中，可用戊二醛作连接剂，将4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与脂质 体的氨基(由DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂提供)连接。

所述步骤2)中，可用EDCI作连接剂，将麦胚凝集素与脂质体的羧基(由 DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH提供)连接。

所述步骤1)中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比可为(50-55)：(40-45)：4：(0.25-0.75)：(0.25-0.75)。 所述步骤1)中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比具体可为52:43:4:0.5:0.5。

所述的靶向脂质体可应用于制备药物载体。所述药物具体可为盐酸表阿霉素和/ 或白藜芦醇。

本发明还保护一种药物载体，它的活性成分为所述的靶向脂质体。所述药物具体 可为盐酸表阿霉素和/或白藜芦醇。

本发明还保护一种载药脂质体，是用所述的靶向脂质体包载药物得到的。所述药 物具体可为盐酸表阿霉素和/或白藜芦醇。

所述载药脂质体的制备方法具体如下：

(1)将白藜芦醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，35℃、40rpm旋转蒸发成膜，然 后加入250mM硫酸铵水溶液，然后进行超声处理(超声参数：每工作10s停30s，全 程时间为10min,保护温度为35℃)，然后使用脂质体挤压器分别过400nm聚碳脂膜3 次和200nm聚碳脂膜3次(顺序如下：400nm聚碳脂膜→400nm聚碳脂膜→400nm聚碳 脂膜→200nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜)，然后装在透析袋中并置 于pH7.4的PBS缓冲液中透析，得到脂质体A0；

(2)用戊二醛作连接剂，将4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与脂质体A0的氨基(由 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂提供)连接，得到脂质体B0；

(3)用EDCI作连接剂，将麦胚凝集素与脂质体B0的羧基(由DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH 提供)连接，得到脂质体D0；

(4)将盐酸表阿霉素与脂质体D0混合，反应(具体可60℃、左右振荡、120次 /min振荡20min)后得到脂质体D1(包载酸表阿霉素和白藜芦醇的载药脂质体)。

步骤(1)中，白藜芦醇的加入质量为蛋黄卵磷脂和胆固醇的质量之和的配比为1：30。

步骤(4)中，盐酸表阿霉素的加入质量与步骤(1)中蛋黄卵磷脂和胆固醇的质 量之和的配比为＝1：12。

所述步骤(1)中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比可为(50-55)：(40-45)：4：(0.25-0.75)：(0.25-0.75)。 所述步骤(1)中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的摩尔比具体可为52:43:4:0.5:0.5。

本发明还保护一种治疗脑肿瘤的药物，它的活性成分是包载盐酸表阿霉素和/或 白藜芦醇的载药脂质体。所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6大鼠脑胶质瘤细胞 引起的脑胶质瘤。

所述包载盐酸表阿霉素和/或白藜芦醇的载药脂质体可应用于制备治疗脑肿瘤的 药物。所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6大鼠脑胶质瘤细胞引起的脑胶质瘤。

MAN在协助药物载体透过血脑屏障方面，具有很好的效果。由于GLUT1在血脑屏 障和脑肿瘤细胞上高表达，且MAN对GLUT1具有特定的亲和力，所以本发明将MAN作 为靶向配体连接到脂质体表面，将在协助载药脂质体透过血脑屏障方面发挥重要作用， 同时MAN还能够增强载药脂质体靶向脑肿瘤细胞的能力。麦胚凝集素WGA可作为有效 靶向血脑屏障的药物载体配体，主要原因是WGA相对于其他凝集素具有较高的亲和力 及较低的大脑毛细血管内皮细胞毒性。麦胚凝集素对恶性肿瘤细胞表现出的高度倾向 性，促进了凝集素作为协助肿瘤治疗方面的发展。

脂质体的粒径可以显著性的影响脂质体的体内药物动力学性质、毒性及其抗肿瘤 活性。就粒径本身而言,平均粒径在100nm左右的脂质体拥有最长的血浆半衰期。本 发明得到的包载表阿霉素和白藜芦醇的脂质体的平均粒径在100nm附近,多分散系数 在0.15-0.23左右,是一个粒径大小合适、分布均匀的分散体系,在血液中的循环时间 长,使脂质体囊泡有更多的机会通过肿瘤部位新生毛细血管内皮组织上的“孔隙”而 向肿瘤组织富集,从而实现更好的抗肿瘤活性。电位是衡量脂质体或脂质纳米粒等分 散体系的物理稳定性的参数之一。本发明得到的包载表阿霉素和白藜芦醇的脂质体的 电位略显负性,说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力,脂质体贮存稳定性更好, 不易发生聚沉。

本发明提供的双重靶向脂质体采用双配体修饰(经MAN修饰后，能够被血脑屏障 上的葡萄糖转运体识别，使脂质体跨膜转运通过血脑屏障；脂质体经WGA修饰后，对 肿瘤细胞具体高度的倾向性，从而提高肿瘤部位的药物浓度，发挥双靶向作用)、包 载两种药物(盐酸表阿霉素和白藜芦醇)，发挥了双靶向作用，使药物在跨过血脑屏 障后靶向到脑胶质瘤部位，进而在肿瘤部位富集，同时包载的两种药物可以在病灶部 位产生协同或相加的疗效，提高化疗效果。本发明为制备治疗脑胶质瘤药物提供了一 个新的思路，具有重要的理论意义与临床意义。

附图说明

图1为HPLC色谱图；1：RES出峰位置；2：EPI出峰位置；λ＝306,254nm。

图2为采用透射电镜对脂质体D1进行形态学观察的照片。

图3为细胞的存活率结果；a，P<0.05，对盐酸表阿霉素；b，P<0.05，对脂质体 A1；c，P<0.05，对脂质体A2；d，P<0.05，对脂质体B1；e，P<0.05，对脂质体C1。

图4为流式细胞仪检测结果。

图5为激光共聚焦显微镜检测结果。

图6为载药脂质体体外对C6大鼠脑胶质瘤细胞凋亡作用结果。

图7为C6大鼠脑胶质瘤细胞球实验结果；a，P<0.01，对空白对照；b，P<0.05， 对盐酸表阿霉素；c，P<0.05，对脂质体A1；d，P<0.05，对脂质体A2；e，P<0.05， 对脂质体B1；f，P<0.05，对脂质体C1。

图8为HRP含量测定标准曲线。

图9为不同时间的HRP通透率测定结果。

图10为盐酸表阿霉素跨体外血脑屏障转运率结果；a，P<0.05，对盐酸表阿霉素；b， P<0.05，对脂质体A1；c，P<0.05，对脂质体A2；d，P<0.05，对脂质体B1；e，P<0.05， 对脂质体C1。

图11为盐酸表阿霉素跨体外血脑屏障转运率结果。

图12为不同脂质体对C6大鼠脑胶质瘤细胞的抑制率；a，P<0.05，对盐酸表阿 霉素；b，P<0.05，对脂质体A1；c，P<0.05，对脂质体A2；d，P<0.05，对脂质体B1； e，P<0.05，对脂质体C1。

图13为肿瘤组织的脑标本的HE染色结果。

图14为给药一周后肿瘤体积抑制率；a，P<0.05，对盐酸表阿霉素；b，P<0.05， 对脂质体A1；c，P<0.05，对脂质体A2；d，P<0.05，对脂质体B1；e，P<0.05，对脂 质体C1。

图15为不同载药脂质体处理的C6胶质瘤大鼠的卡普兰一迈耶存活曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

蛋黄卵磷脂(EPC)：GermanyLipoidcompany,ShangHailocalagent,China。 胆固醇(cholesterol)：北京双旋微生物培养基制品厂。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺(DSPE-PEG₂₀₀₀)：日本油脂株式会社(日本NOF公司)。DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH、 DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂、p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(4-氨基苯-α-D-吡喃甘露 糖苷，MAN)、麦胚凝集素(WGA)、葡聚糖凝胶(shephedexG-50)、三硝基苯磺酸(TNBS)： Sigma公司。碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)：上海源叶生物 科技有限公司。盐酸表阿霉素(epirubicin，EPI)、白藜芦醇(resveratrol，RES)： 南京天尊泽众化学试剂公司。硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，分析纯：天津市福晨化学试剂厂。 DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)高糖培养基、0.25％胰酶：Gibico公司。 胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司。青霉素-链霉素双抗试剂(100×)：北京 索莱宝生物科技有限公司。磺酰罗丹明B蛋白(SRB)：美国Sigma公司。辣根过氧化 物酶(Horseradishperoxidase，HRP分子量为40000，酶活性＞250U·mg^-1)：美国 Sigma公司。C6大鼠脑胶质瘤细胞：中国科学院上海细胞所。小鼠脑内皮细胞(bEnd.3 细胞)：北京北纳创联生物技术有限公司。

聚碳酯过滤器(孔径为400、200nm)：Millipore(Bedford,MA,USA)。岛津LC-15C 高效液相色谱仪：日本岛津公司，紫外检测器。UV-2401PC型紫外-可见分光光度计： 日本岛津公司。马尔文粒度测定仪：英国马尔文仪器公司。SartoriusBP211D电子天平： 德国赛多利斯集团。超声波清洗器：天鹏电子新技术北京有限公司。EYELA-1000S型旋 转蒸发仪：日本EYELA东京理化器械株式会社。JY92细胞超声破碎仪：宁波新芝生物 科技股份有限公司。恒温振荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂。透析袋：截留分子量 8000-12000。脂质体挤压器：德国赛多利斯集团。细胞插入器：美国Corning公司 (Coring,NY,USA；O.4μm孔径，12mm直径，1.12cm²表面积)。脑立体定位仪：深圳瑞 沃德有限公司。CO₂恒温培养箱：Thermo科技有限公司，美国。酶标免疫测定仪：上海 基因科技有限公司。电阻测定仪：EVOMk，WordPrecisionInstruments，USA。

WGA修饰率的测定方法如下(WGA为蛋白质，因此可采用考马斯亮蓝法检测游离 的WGA)：采用shephedexG-50柱分离游离的WGA(柱子内径为1.5cm，柱高为18cm； 上样量为1ml；洗脱过程：先用pH7.4的PBS缓冲液平衡柱子→上样→用pH7.4的PBS 缓冲液洗脱，流速为1.0mL/min→游离的WGA存在于保留体积为20ml-32ml的洗脱液)， 然后采用考马斯亮蓝法检测游离的麦胚凝集素的量(以总蛋白计)；CE_WGA＝(1– C_uncoupled/C_total)×100％，CE_WGA为WGA的连接效率，C_uncoupled为游离的麦胚凝集素的量， C_total为WGA的初始加入量。

MAN修饰率的测定方法如下：采用TNBS法检测脂质体上DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的氨基， CE_MAN＝(1-连接MAN后脂质体上可与三硝基苯磺酸反应的氨基数量/连接MAN前脂质体 上可与三硝基苯磺酸反应的氨基数量)。

采用HPLC法检测盐酸表阿霉素和白藜芦醇的含量，相关参数如下：

色谱条件：色谱柱为美国菲罗门LunaC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为“甲 醇-乙腈-0.4％磷酸水溶液”(体积比为16:21:63)；流速为1.0ml/min；紫外检测波长 为254nm(盐酸表阿霉素)和306nm(白藜芦醇)；柱温为室温；进样量为20μL；

色谱行为：在上述色谱条件下，分别取空白脂质体的破乳溶液(A)、白藜芦醇对 照品溶液(B)、盐酸表阿霉素对照品溶液(C)、载有白藜芦醇和表阿霉素的脂质体的 破乳溶液(D)进样分析，结果见色谱图1，由图可知空白脂质体对药物测定无干扰。 白藜芦醇色谱峰保留时间约为11.7min、盐酸表阿霉素色谱峰保留时间约为14.6min。

实施例1、脂质体的制备

一、空白脂质体的制备

1、空白脂质体的制备

将蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH和DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂按摩 尔比52:43:4:0.5:0.5溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，在茄形瓶中35℃、40rpm 旋转蒸发成膜，然后加入250mM硫酸铵水溶液，然后进行超声处理(超声参数：每工 作10s停30s，全程时间为10min,保护温度为35℃)，然后使用脂质体挤压器分别过 400nm聚碳脂膜3次和200nm聚碳脂膜3次(顺序如下：400nm聚碳脂膜→400nm聚碳 脂膜→400nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜→200nm聚碳脂膜)，然后 装在透析袋中并置于pH7.4的PBS缓冲液中透析，得到脂质体A。

2、空白MAN修饰的脂质体的制备

借助戊二醛作连接剂将MAN化学连接到脂质体A上DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂的氨基上，具 体步骤为：将2ml15mg/ml的脂质体A(脂质体A的质量是以制备脂质体A时蛋黄卵磷 脂和胆固醇的质量之和计的)与1.5mgMAN混合，然后缓慢加入戊二醛(使戊二醛浓 度达到15mM),室温孵育5min，然后装在透析袋中并置于pH7.4的PBS缓冲液中透 析。得到脂质体B。

3、空白WGA修饰的脂质体的制备

借助EDCI作连接剂将WGA的氨基与脂质体A上DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH的羧基连接， 具体步骤为：取2ml15mg/ml的脂质体A(脂质体A的质量是以制备脂质体A时蛋黄卵 磷脂和胆固醇的质量之和计的)，加入1.0mgEDCI和1.44mgNHS并混匀，然后置于 恒温振荡器(37℃、左右振荡、120次/min)中振荡12h，然后加入5mgWGA并置于恒 温振荡器(37℃、左右振荡、120次/min)中振荡1h。得到脂质体C。

4、空白MAN和WGA修饰的脂质体的制备

借助EDCI作连接剂将WGA的氨基与脂质体B上DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH的羧基连接(用 脂质体B代替脂质体A，其它同步骤3)。得到脂质体D。

上述制备的脂质体A、脂质体B、脂质体C和脂质体D均悬浮于液相中。

二、载药脂质体的制备

药脂比＝药物的质量：脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和(卵磷脂和胆固醇的 质量均以制备脂质体时加入的卵磷脂和胆固醇的质量计)。

本步骤中的药物为盐酸表阿霉素或白藜芦醇。

与步骤一的1的差别仅在于：在起始反应时加入白藜芦醇(药脂比＝1：30)。得 到载有RES的脂质体A0。

将盐酸表阿霉素与脂质体A混合(药脂比＝1：12)，置于恒温振荡器(60℃、左右 振荡、120次/min)中振荡20min。得到载有EPI的脂质体A1。

将盐酸表阿霉素与脂质体A0混合(药脂比＝1：12)，置于恒温振荡器(60℃、左 右振荡、120次/min)中振荡20min。得到载有EPI和RES的脂质体A2。

用脂质体A0代替脂质体A，其它同步骤一的2。得到经MAN修饰的载有RES的脂 质体B0。

将盐酸表阿霉素与脂质体B0混合(药脂比＝1：12)，置于恒温振荡器(60℃、左 右振荡、120次/min)中振荡20min。得到经MAN修饰的载有EPI和RES的脂质体B1。

用脂质体A0代替脂质体A，其它同步骤一的3。得到经WGA修饰的载有RES的脂 质体C0。

将盐酸表阿霉素与脂质体C0混合(药脂比＝1：12)，置于恒温振荡器(60℃、左 右振荡、120次/min)中振荡20min。得到经WGA修饰的载有EPI和RES的脂质体C1。

用脂质体B0代替脂质体A,其它同步骤一的3。得到经MAN和WGA共同修饰的载 有RES的脂质体D0。

将盐酸表阿霉素与脂质体D0混合(药脂比＝1：12)，置于恒温振荡器(60℃、左 右振荡、120次/min)中振荡20min。得到经MAN和WGA共同修饰的载有EPI和RES 的脂质体D1。

上述制备的各个脂质体均悬浮于液相中。

脂质体C1的CE_WGA为22.57±0.12％。脂质体D1的CE_WGA为19.25±0.087％。

脂质体B1的CE_MAN为37.83±1.04％。脂质体D1的CE_MAN为36.98±1.70％。

实施例2、脂质体的性能测定

一、包封率的测定

将实施例1得到的脂质体A1、脂质体A2、脂质体B1、脂质体C1、脂质体D1分 别进行如下(1)或(2)的操作。

(1)分别将脂质体A1、脂质体A2、脂质体B1、脂质体C1、脂质体D1进行如下 操作：将脂质体置于10mL容量瓶中，用10倍体积的甲醇破坏(得到破乳溶液)，检 测白藜芦醇和表阿霉素的浓度。

(2)分别将脂质体A1、脂质体A2、脂质体B1、脂质体C1、脂质体D1进行如下操 作：将脂质体过shephedexG-50柱，用pH7.4的PBS缓冲液洗脱，以除去游离的白藜芦 醇，然后装在透析袋中并置于pH7.4的PBS缓冲液中透析以除去游离的表阿霉素，然后 置于10mL容量瓶中，用10倍体积的甲醇破坏(得到破乳溶液)，检测白藜芦醇和表阿 霉素的浓度。

包封率(％)＝步骤(2)中白藜芦醇或表阿霉素的浓度/步骤(1)中白藜芦醇或 表阿霉素的浓度×100％。结果见表1。

表1不同载药脂质体的包封率(n＝3)

表阿霉素包封率％ 白藜芦醇包封率％ 脂质体A1 92.04±1.5 —— 脂质体A2 90.07±0.76 65.01±3.52 脂质体B1 90.05±1.11 66.56±0.16 脂质体C1 91.46±0.07 65.88±0.45 脂质体D1 92.49±1.29 66.29±0.55

二、粒径和电位测定

分别将1ml实施例1中新制得的脂质体A、脂质体A1、脂质体A2、脂质体B1、 脂质体C1、脂质体D1用pH7.4的PBS缓冲液稀释，使用NanoSeriesZen4003Zeta Sizer(Malverninstruments,Ltd,UK)测定脂质体的粒径、多分散系数和Zeta电 位。不同脂质体的粒径、多分散系数(PDI)和zeta电位的测定结果见表2。脂质体 粒径分布均匀,粒径在100nm左右。各载药脂质体都略带负电,说明脂质体囊泡之间具 有适量的静电排斥力,贮存稳定性更好,不易发生聚沉。

表2不同脂质体粒径、多分散系数及Zeta电位(n＝3)

粒径(nm) 多分散系数 Zeta电位(mv) 脂质体A 85.24±0.33 0.210±0.002 -3.91±0.08 脂质体A1 89.10±0.46 0.204±0.013 -7.80±0.18 脂质体A2 94.30±0.51 0.178±0.008 -8.30±0.45 脂质体B1 99.18±0.61 0.159±0.007 -13.43±0.31 脂质体C1 100.21±0.26 0.160±0.009 -12.07±0.59 脂质体D1 103.77±0.65 0.225±0.009 -14.40±0.70

三、透射电镜(TEM)

采用透射电镜对实施例1制备的脂质体D1进行形态学观察。结果见图2，可见脂 质体形态较为圆整，大小均一。

实施例3、载药脂质体体外对C6脑胶质瘤细胞抑制作用研究

药物的加入形式为脂质体时，盐酸表阿霉素的加入量为脂质体的加入量乘以包封 率。

1、取对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞，以3000个/孔(190μL/孔)接种于 96孔板中，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，每孔加入10μL用pH7.4的PBS缓冲液配制 的系列浓度的药物溶液(药物的加入形式分别为：盐酸表阿霉素、脂质体A1、脂质体 A2、脂质体B1、脂质体C1或脂质体D1，使各试验组盐酸表阿霉素的浓度分别为0.05、 0.1、0.5、1、2.5、5或10μM；设置用等体积PBS缓冲液代替药物溶液的空白对照)， 置于37℃、5％CO₂条件下培养48小时，然后吸弃培养上清，采用SRB法测定每孔在 540nm处吸收度OD值。

细胞存活率＝试验组OD值/空白对照组OD值×100％。

进行三个重复试验，结果取平均值。

细胞的存活率结果见图3。结果显示，脂质体D1在各个浓度下均表现出最强的 抗胶质瘤细胞增殖的作用。

IC50值(细胞存活率＝50％时的表阿霉素浓度)结果见表3。脂质体D1的IC50值 明显低于其他组，对C6胶质瘤细胞的抗增殖作用大大提高，明显高于游离表阿霉素 和其他脂质体。

表3不同脂质体的IC50值

IC50(μM) 盐酸表阿霉素 1.07 脂质体A1 3.12 脂质体A2 2.15 脂质体B1 1.93 脂质体C1 1.37 脂质体D1 0.85

实施例4、C6大鼠脑胶质瘤细胞对载药脂质体的摄取作用

药物的加入形式为脂质体时，盐酸表阿霉素的加入量为脂质体的加入量乘以包封率。

一、流式细胞仪检测

1、取对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞，以1×10⁵个/孔(1500μL/孔)接种 于12孔板中，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

2、完成步骤1后，取所述12孔板，每孔加入80μL用pH7.4的PBS缓冲液配制 的系列浓度的药物溶液(药物的加入形式分别为：盐酸表阿霉素、脂质体A2、脂质体 B1、脂质体C1或脂质体D1，使各试验组盐酸表阿霉素的浓度为68μg/ml；设置用等 体积PBS缓冲液代替药物溶液的空白对照)，置于37℃、5％CO₂条件下培养4小时。

3、完成步骤2后，取所述12孔板，吸弃培养上清，用冷的pH7.4的PBS缓冲液 漂洗两遍，然后用0.25％胰酶消化，再用pH7.4的PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后采 用流式细胞仪进行检测。

结果见图4(A为空白对照，B为脂质体A2，C为脂质体B1，E为脂质体C1，F 为脂质体D1，G为盐酸表阿霉素)。与游离表阿霉素、脂质体C1、B1、A2相比，脂质 体D1显示出最强的C6大鼠脑胶质瘤细胞内摄取能力。

二、激光共聚焦显微镜检测

1、取对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞，以2×10⁵个/孔(2000μL/孔)接种 于6孔板中，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

2、完成步骤1后，取所述6孔板，每孔加入100μL用pH7.4的PBS缓冲液配制 的系列浓度的药物溶液(药物的加入形式分别为：盐酸表阿霉素、脂质体A2、脂质体 B1、脂质体C1或脂质体D1，使各试验组盐酸表阿霉素的浓度为5μg/ml；设置用等体 积PBS缓冲液代替药物溶液的空白对照)，置于37℃、5％CO₂条件下培养2小时。

3、完成步骤2后，取所述6孔板，吸弃培养上清，用冷的pH7.4的PBS缓冲液 漂洗三次，然后用4％多聚甲醛固定10min，然后采用Hoechst33258进行细胞核染色， 然后用激光共聚焦显微镜(LSM510,Zeiss,Germany)以480nm波长的激光束激发 表阿霉素(激发波长480nm，发射波长560nm)，以346nm波长的激光束激发 Hoechst33258(激发波长346nm，发射波长460nm)，然后用AimImageExaminer软 件进行图像分析。

结果见图5(A为盐酸表阿霉素，B为脂质体A2，C为脂质体B1，D为脂质体C1， E为脂质体D1；A1显示盐酸表阿霉素，A2显示细胞核，A3显示叠加图，其余图以此 类推)。脂质体经C6大鼠脑胶质瘤细胞内吞后主要分布在细胞核中。与游离表阿霉素、 脂质体C1、B1、A2相比，脂质体D1在C6大鼠脑胶质瘤细胞内分布量最多，与流式 法检测C6大鼠脑胶质瘤细胞的摄取作用一致。

实施例5、载药脂质体体外对C6大鼠脑胶质瘤细胞凋亡作用研究

药物的加入形式为脂质体时，盐酸表阿霉素的加入量为脂质体的加入量乘以包封率。

1、取对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞，以2×10⁵个/孔(2000μL/孔)接种 于6孔板中，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

2、完成步骤1后，取所述6孔板，每孔加入100μL用pH7.4的PBS缓冲液配制 的系列浓度的药物溶液(药物的加入形式分别为：盐酸表阿霉素、脂质体A2、脂质体 B1、脂质体C1或脂质体D1，使各试验组盐酸表阿霉素的浓度为5μg/ml；设置用等体 积PBS缓冲液代替药物溶液的空白对照)，置于37℃、5％CO₂条件下培养48小时。

3、完成步骤2后，取所述6孔板，吸弃培养上清，用冷的pH7.4的PBS缓冲液 漂洗，然后用不含EDTA的胰酶消化，再用pH7.4的PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后 用300μLpH7.4的PBS缓冲液将细胞吹匀，之后依次加入500μL的BindingBuffer、 5μLAnnexinV-APC、5μL7-AAD，混匀后于室温避光的条件下反应10min，经流式 细胞仪检测。

进行三个重复试验，结果取平均值。

结果见图6(a为脂质体A2，b为脂质体B1，c为脂质体C1，d为脂质体D1，e 为盐酸表阿霉素，f为空白对照)。在药物浓度和药物孵育时间相同的条件下，诱导 C6大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的百分比由高到低的顺序依次如下：脂质体D1>脂质体C1> 脂质体B1>脂质体A2>游离表阿霉素>空白对照。Q4-4所占百分比依次为49.9±0.19％、 47.4±0.23％、38.2±0.41％、29.5±0.26％、10.7±0.29％和0.5±0.06％。结果表明， MAN和WGA共同修饰的双重靶向复方脂质体D1与其他制剂组相比，具有更强的诱导 C6脑胶质瘤细胞凋亡的作用。

实施例6、C6大鼠脑胶质瘤细胞球实验

1、取96孔板，每孔加入40μl含2g/100ml琼脂糖的无血清DMEM培养液。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，每孔接种150μlC6大鼠脑胶质瘤细胞(2000 个细胞/孔)，置于37℃、5％CO₂条件下培养24小时。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔加入20μL用无血清DMEM培养液配制 的药物溶液(药物的加入形式分别为：盐酸表阿霉素、脂质体A1、脂质体A2、脂质 体B1、脂质体C1或脂质体D1，使各试验组盐酸表阿霉素的浓度为4μM；设置用等体 积无血清DMEM培养液代替药物溶液的空白对照)，置于37℃、5％CO₂条件下培养，分 别于给药前，给药后第1天、第2天、第3天和第5天在倒置显微镜下观察肿瘤球的 形态、球核是否有坏死，用目镜测微尺测量肿瘤球的长径和短径，计算肿瘤球体积。

V＝(π×dmax×dmin)/6；

V是肿瘤球体积，dmax是肿瘤球长径，dmin是肿瘤球短径。

R＝(Vdayi/Vday0)×100％；

R是肿瘤球体积率，Vdayi是给药后第i天的C6大鼠脑胶质瘤细胞肿瘤球体积， Vday0是给药前C6大鼠脑胶质瘤细胞肿瘤球的体积。

进行三个重复试验，结果取平均值。

结果见图7(1为空白对照，2为盐酸表阿霉素，3为脂质体A1，4为脂质体A2， 5为脂质体B1，6为脂质体C1，7为脂质体D1)。脂质体D1处理组C6大鼠脑胶质瘤 细胞球在大小和体积上较其他组相比，产生显著性的减小。第5天时的C6大鼠脑胶 质瘤细胞球体积变化率：空白对照组为2.56±0.47，游离表阿霉素为0.61±0.09， 脂质体A1为0.64±0.12，脂质体A2为0.62±0.08，脂质体B1为0.61±0.07，脂质 体C1为0.57±0.31，脂质体D1为0.46±0.33。结果说明双配体修饰的脂质体更能 有效的抑制细胞球的生长。

实施例7、脂质体体外双重靶向作用评价

一、体外血脑屏障模型评价

1、血脑屏障体外模型跨膜电阻的测定

将bEnd.3细胞接种在插入式细胞培养皿的上池(5×10⁴个细胞/孔)，上池加入 500μlDMEM培养液，下池加入1350μlDMEM培养液，培养4天(每两天更换一次培 养液)。通过测定单层血脑屏障(BBB)的电阻来判断BBB形成的紧密程度，电阻值高 于150Ωcm²(扣除本底后)可用于实验，血脑屏障体外模型的跨膜电阻(TEER)为 163-181Ωcm²。

2、HRP含量测定标准曲线的建立

用无血清的DMEM作为溶剂，配制浓度为12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、 1.56ng/ml、0.78ng/ml和0.39ng/ml的辣根过氧化物酶系列标准溶液。取96孔板，每 孔加入50μl标准溶液，再加入90μlTMB显色液，孵育15min后加入50μl终止液 (1mol/LH₂SO₄)，置于酶标仪中于450nm波长下测定吸光度，建立HRP含量标准曲线 (见图8)。

3、BBB通透性测定

(1)将bEnd.3细胞接种在插入式细胞培养皿的上池(5×10⁴个细胞/孔)，上池加 入500μlDMEM培养液，下池加入1350μlDMEM培养液，培养。

(2)当步骤(1)进行到TEER值大于150Ω时，吸弃上池和下池的培养液，向上 池加入500μl含500ngHRP的DMEM完全培养基，向下池加入1350μl完全DMEM培养基， 分别于0.5、1、2、4、8、12、24小时后时从下池中取出50μl液体检测HRP浓度，同 时向下池补加50μlDMEM完全培养基。

通透率_HRP＝C_t下池/C_0上池×100％；

C_t下池：t时刻下池中HRP的浓度，C_0上池：实验开始时上池中HRP的浓度(1000ng/ml)。

不同时间的HRP通透率测定结果见图9。体外BBB模型建成后，24小时内的通透率_HRP小于7％，说明模型的致密性良好，符合后续实验要求。

二、不同脂质体制剂透过血脑屏障能力的测定

1、将bEnd.3细胞接种在插入式细胞培养皿的上池(5×10⁴个细胞/孔)，上池加入 500μlDMEM培养液，下池加入1350μlDMEM培养液，培养。

2、当步骤1进行到TEER值大于150Ω时，吸弃上池和下池的培养液。

3、完成步骤2后，第一组向上池加入500μl无血清DMEM培养基(作为空白对 照)，第二组向上池加入500μl含5μg盐酸表阿霉素的无血清DMEM培养基，第三组 向上池加入500μl含脂质体A1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养基，第 四组向上池加入500μl含脂质体A2(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养基， 第五组向上池加入500μl含脂质体B1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养 基，第六组向上池加入500μl含脂质体C1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM 培养基，第七组向上池加入500μl含脂质体D1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清 DMEM培养基，各组均向下池加入1000μl无血清DMEM培养基。

4、完成步骤3后，继续培养，分别于培养2小时、4小时、8小时和24小时后 从下池取出0.5ml液体检测盐酸表阿霉素浓度，同时向下池补加0.5mlDMEM完全培 养基。

盐酸表阿霉素跨体外血脑屏障转运率＝C_t下池/C_0上池×100％；

C_t下池：t时刻下池中盐酸表阿霉素的浓度，C_0上池：实验开始时上池中盐酸表阿霉素 的浓度(10μg/ml)。

进行三个重复试验，结果取平均值。

盐酸表阿霉素跨体外血脑屏障转运率结果见图10。脂质体D1在体外血脑屏障模型 上的转运率高于其它脂质体，并且随着转运时间的延长，优势愈加明显。

三、MAN竞争实验

1、将bEnd.3细胞接种在插入式细胞培养皿的上池(5×10⁴个细胞/孔)，上池加入 500μlDMEM培养液，下池加入1350μlDMEM培养液，培养。

2、当步骤1进行到TEER值大于150Ω时，向上池加入200μgMAN，30min后吸弃 上池和下池的培养液。

3、完成步骤2后，第一组向上池加入500μl含脂质体B1(含5μg盐酸表阿霉 素)的无血清DMEM培养基，第二组向上池加入500μl含脂质体D1(含5μg盐酸表 阿霉素)的无血清DMEM培养基，各组均向下池加入1000μl无血清DMEM培养基。

4、当步骤1进行到TEER值大于150Ω时，吸弃上池和下池的培养液。

5、完成步骤4后，第三组向上池加入500μl含脂质体B1(含5μg盐酸表阿霉 素)的无血清DMEM培养基，第四组向上池加入500μl含脂质体D1(含5μg盐酸表 阿霉素)的无血清DMEM培养基，各组均向下池加入1000μl无血清DMEM培养基。

6、分别完成步骤3和步骤5后，继续培养，分别于培养2小时、4小时、8小时 和24小时后从下池取出0.5ml液体检测盐酸表阿霉素浓度，同时向下池补加0.5ml DMEM完全培养基。

进行三个重复试验，结果取平均值。

盐酸表阿霉素跨体外血脑屏障转运率结果见图11。加入MAN后，由于游离的MAN 与GLUT1竞争性结合，使得脂质体B1、脂质体D1的跨血脑屏障能力大大降低。该结 果证明，MAN与GLUT1特异性识别结合后，可介导经MAN修饰的表阿霉素脂质体跨过 血脑屏障，并能显著提高转运能力。

四、体外双重靶向性研究

1、将bEnd.3细胞接种在插入式细胞培养皿的上池(5×10⁴个细胞/孔)，上池加入 500μlDMEM培养液，下池加入1350μlDMEM培养液，培养2天。

2、完成步骤1后，取所述插入式细胞培养皿，在下池中接种C6大鼠脑胶质瘤细 胞(1×10⁵个细胞/孔)，培养1天。

3、完成步骤2后，吸弃上池和下池的培养液。

4、完成步骤3后，第一组向上池加入500μl无血清DMEM培养基(作为空白对 照)，第二组向上池加入500μl含5μg盐酸表阿霉素的无血清DMEM培养基，第三组 向上池加入500μl含脂质体A1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养基，第 四组向上池加入500μl含脂质体A2(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养基， 第五组向上池加入500μl含脂质体B1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM培养 基，第六组向上池加入500μl含脂质体C1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清DMEM 培养基，第七组向上池加入500μl含脂质体D1(含5μg盐酸表阿霉素)的无血清 DMEM培养基，各组均向下池加入1000μl无血清DMEM培养基，培养48小时。

5、完成步骤4后，吸弃培养上清，采用SRB法测定每孔在540nm处吸收度OD值。

细胞抑制率＝(1-试验组OD值/空白对照组OD值)×100％。

进行三个重复试验，结果取平均值。

结果见图12。不同脂质体对C6大鼠脑胶质瘤细胞的抑制率分别为：脂质体D1 (64.48±0.59)>脂质体B1(58.88±0.84)>脂质体C1(39.95±0.83)>脂质体A2 (29.11±0.56)>脂质体A1(27.02±0.23)>游离表阿霉素(17.23±0.39)。结果表 明，MAN和WGA共同修饰的载药脂质体显示出“二级靶向作用”，能够介导载药脂质体 跨过血脑屏障，进而靶向C6大鼠脑胶质瘤细胞。

实施例8、双重靶向脂质体体内靶向性评价

实验动物为200-250g的雄性SD大鼠。

一、脑胶质瘤大鼠模型的建立

取实验动物，腹腔注射20％乌拉坦进行麻醉,去头顶毛发约1.0cm×1.5cm，固定 于定向仪上，碘酒、酒精消毒。沿内眦连线中点向后纵向切开大鼠头皮1cm,暴露颅 骨，根据大鼠脑立体定向图谱在前囟后0.4mm、矢状缝旁侧3.5mm的颅骨上以牙科钻 钻孔，牙科钻外带塑料套管,仅允许钻头钻透颅骨深1.0～1.5mm(以防止刺破硬脑 膜)，微量注射器吸入10μLC6大鼠脑胶质瘤细胞悬液(含1×10⁶个细胞)，垂直进针 深5mm,以1μL/min速率注入尾状核内，缓慢拔针,骨孔立即用无菌骨蜡封闭,术野用 生理盐水冲洗,切口逢合，术后肌肉注射五天青霉素，40000U/只。

接种C6大鼠脑胶质瘤细胞7天后，取大鼠并解剖，可以观察到已形成脑肿瘤。

含有肿瘤组织的脑标本经石蜡包埋后，取8μm切片，HE常规染色，见图13。图 13中，A为正常脑组织HE染色结果(×40)；B为脑肿瘤HE染色结果(×40)。可见 肿瘤细胞生长活跃，密集成群并向脑组织呈侵润性生长。脑组织与肿瘤交界处虽能看 到肿瘤细胞侵润，仍能见到一个较明显的界限。

三、生存曲线

将接种C6大鼠脑胶质瘤细胞7天后的模型大鼠随机分成7组,每组9只(3只用 于测量肿瘤体积，6只用于绘制生存曲线)，分组处理如下：

第1组：尾静脉给予脂质体A1，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计算)；

第2组：尾静脉给予脂质体A2，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计算)；

第3组：尾静脉给予脂质体B1，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计算)；

第4组：尾静脉给予脂质体C1，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计算)；

第5组：尾静脉给予脂质体D1，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计算)；

第6组：尾静脉给予盐酸表阿霉素，给药剂量为5mg/kg(以盐酸表阿霉素的量计 算)；

第7组：尾静脉给予生理盐水。

采用4％PBS多聚甲醛液固定解剖出的脑肿瘤，游标卡尺测量病理解剖肿瘤最大 层面直径，以最大长宽高直径计算肿瘤体积(mm³)(V＝π×d_max×d_min/6),肿瘤体积抑 制率＝试验组的肿瘤体积/生理盐水对照组的肿瘤体积×100％。

给药一周后肿瘤体积抑制率见图14。盐酸表阿霉素为10.71±1.27％，载药脂质 体A1为14.64±1.57％，载药脂质体A2为17.02±1.41％，载药脂质体B1为35.7±1.28％， 载药脂质体C1为25.92±1.33％，载药脂质体D1为46.06±2.46％。从结果中可以看 出，生理盐水对肿瘤体积没有抑制效果，与其他组相比，双配体修饰的载药脂质体D1 的肿瘤体积显著性减小。

记录动物的死亡时间，每组作生存曲线。使用SPSS软件Kaplan-Meier法测定生 存率，绘制生存曲线。结果见图15，1为生理盐水组，2为脂质体A1,3为脂质体A2,4 为脂质体B1，5为脂质体C1,6为脂质体D1，7为游离表阿霉素组。从结果中可以看 出经MAN、WGA修饰的脂质体D1脂质体对荷C6胶质瘤大鼠的抗肿瘤作用大大提高， 术后最长生存时间可达25天，明显高于游离药组及其他脂质体组，说明脂质体D1具 有较明显的抗肿瘤效果。脂质体D1组的荷瘤鼠平均存活时间与游离药和其他脂质体 组的平均存活时间相比，具有显著性差异，其结果见表4。

表4各组生存时间比较

脂质体A1 脂质体A2 脂质体B1 脂质体C1 脂质体D1 游离表阿霉素 生理盐水 中位生存天数 11.9^*13.5^*16.3^*16^*19.5 14.3^*10.5^*最大生存天数 16 18 23 22 25 18 14

*.P<0.05,载药脂质体D1与其他组相比较。