半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法

摘要

本发明公开了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，属于分子生物技术领域。本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方 法。

背景技术

蛋白质的数量和质量是影响小麦面粉品质的重要因素。小麦种子储藏蛋白主要由麦醇溶 蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)组成，麦谷蛋白又分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS) 和低分子量麦谷蛋白亚(LMW-GS)，亚基间通过二硫键结合形成谷蛋白大聚合体，赋予面团 独特的粘弹性和延展性[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1 chromosomesofthehigh-molecular-weightsubunitsofglutenin，amajorproteinofwheat endosperm.TheorApplGenet，1980，58：113-120；WrigleyCW.Giantproteinswithflour power.Nature，1996，381：738-739；GianibelliMC，LarroqueOR，MacRitchieF.Biochemical， genetic，molecularcharacterizationofwheatgluteninanditscomponentsubunits.CerealChem， 2001，78：635-646]，可以加工成面包、面条和糕点等多种食品。遗传和生化研究表明，高 分子量谷蛋白的组成和数量与小麦面包加工品质密切相关[PaynePI，LawCN，MuddE E.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh-molecular-weightsubunitsofglutenin， amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58：113-120；PaynePI，Genetics ofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlant Physiol，1987，38：141-153；RadovanovicN，CloutierS，BrownD，etal.Geneticvariancefor glutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem.2002，79： 843-849]。高分子麦谷蛋白基因位点Glu-1位于第1同源群染色体长臂，在A、B、D组染色 体上含有相应的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1同源基因复合位点，每个Glu-1位点又包含分别 编码x-和y-型高分子麦谷蛋白亚基的2个紧密连锁基因[PaynePI，LawrenceGJ.Catalogueof allelesforthecomplexloci，Glu-A1，Glu-B1andGlu-D1，hichcodeforhigh-molecular-weight subunitsofglutenininhexaploidwheat.CerealResComm，1983，11：29-35；ShewryPR，Halford NGandTathamAS.Thehigh-molecular-weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCereal Science，1992，15(2)：105-120]。Payne首先建立了小麦高分子量谷蛋白亚基(对)对面筋品 质贡献的评分系统，如Ax1/Ax2*和Dx5是目前公认的面包小麦优质亚基[PaynePI，Genetics ofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlant Physiol，1987，38：141-153]。研究表明，等位基因Glu-Blal编码的超表达Bx7亚基(Bx7OE) 能显著提高面筋强度[ButowBJ，MaW，GaleKR，etal.MoleculardiscriminationofBx7alleles demonstratesthatahighlyexpressedhigh-molecular-weightgluteninallelehasamajorimpact onwheatflourdoughstrength.TheorApplGenet，2003，107：31524-1532]，含有Bx7OE的 小麦育成品种或地方品种通常都具有更好的面筋强度[VawserMJ，CornishGB.Overexpression ofHMWgluteninsubunitGlu-B17xinhexaploidwheatvarieties(Triticumaestivum).AustralJ AgricRes，2004，55：577-588；LukowOM，ForsythSA，PaynePI.Over-productionofHMW gluteninsubunitscodedonchromosome1Bincommonwheat，Triticumaestivum.JGenetBreed， 1992，46：187-192；RadovanovicN，CloutierS，BrownD，HumphreysDG，LukowOM.Genetic varianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem， 2002，79：843-849]。发掘和利用Bx7OE已成为进一步改良小麦品质的重要途径，目前发达 国家优质小麦育种计划正加强利用这一基因。

普通小麦中的Bx7OE亚基来自南美的一个地方品种，中国小麦品种几乎不含有这一亚 基。通过杂交聚合育种引入Bx7OE、Dx5等优质亚基，是快速改良我国小麦品质的有效途径。 SDS-PAGE是分离和鉴定HMW-GS的传统方法，但不能有效鉴别分子量大小和迁移率十分接 近的亚基[ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh-molecular-weightsubunitsofwheat glutenin.JournalofCerealScience，1992，15(2)：105-120]，且费工费时。近年来，随着大量的 HMW-GS基因被克隆，主要等位基因的DNA分子标记也相应被建立[AhmadM.Molecular marker-assistedselectionofHMWgluteninallelesrelatedtowheatbreadqualitybyPCR-generated DNAmarkers.TheorApplGenet，2000，101：892-896；DeBustosA，RubioP，JouveN.Molecular characterisationoftheinactivealleleofthegeneGlu-A1andthedevelopmentofasetofAS-PCR markersforHMWgluteninsofwheat.TheorApplGenet，2000，100：1085-1094]，利用连锁分 子标记鉴定亚基组成更加方便、准确、可靠。然而在我国现有育种条件下，相对表型鉴定而 言，分子标记辅助选择技术因成本较高未能真正用于育种实践。与单个基因分子标记的PCR 鉴定方法相比，多重PCR(multiplexPCR)技术体系含有多个基因标记引物，通过一次反应能 够对多个性状基因进行鉴定，实验成本明显降低，工作效率显著提高[MoczulskiM， SalmanowiczBP(2003)MultiplexPCRidentificationofwheatHMWgluteninsubunitgenesby allele-specificmarkers.Theor.Appl.Genet.44(4)：459-471]。

目前，小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法有多种。其中，SDS-PAGE电泳是经常采用 的方法，该方法简单易学，并可以对每一样品所有亚基及其表达量进行鉴定。但该方法比较 耗时，而且容易对分子量不同而迁移率相近的亚基造成误判。用于小麦研究的多重PCR技术 主要涉及与品质相关的高(低)分子谷蛋白亚基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等，分子标 记法是根据不同高分子量谷蛋白亚基序列的差异设计特定的引物，对小麦基因组DNA进行 PCR扩增，该方法高效快捷，克服了SDS-PAGE电泳的一些缺点。然而，该方法有时不能区 分杂交后代的某一基因位点是否纯合，而且如果操作不当，还会出现假阳性或假阴性。另外， 由于分子标记一次只能鉴定1-2个高分子量谷蛋白亚基等位基因，虽然有的学者采用多重PCR 一次鉴定多个亚基，但不是所有高分子量谷蛋白亚基都可用多重PCR进行鉴定。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，解决现有的小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法的鉴定速 度慢，检测准确率低的问题，本发明提供了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法， 本方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行 SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的 小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，包含如下步骤：

步骤一：小麦籽粒DNA的提取

a.切取1/3～1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒 1次；冷却至室温，离心；

b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；

c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，离心；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加双蒸水溶解DNA；

步骤二：高分子量谷蛋白亚基的PCR反应

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系为25μL，含1μL提取的DNA，1×Buffer，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP 各为0.8mmol/L，每种引物各为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s～ 1min，35个循环，最后72℃再延伸5min；

步骤三：高分子量谷蛋白亚基的SDS‐PAGE电泳及检测

选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL 蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000 rpm离心10min，取上清液；

高分子量谷蛋白亚基的检测：采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3％，分离胶 浓度为8％，交联度为3.33％。

进一步的，所述步骤一具体为：

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0 mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液，65℃ 水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95％乙 醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70％乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

进一步的，所述DNA提取缓冲液为：100mmol/L，Tris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA， 500mmol/LNaCl。

进一步的，所述蛋白质提取液为：70mmol/LTris-HCl，2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS， 20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰。

进一步的，所述步骤二中退火后72℃条件下5亚基延伸45s，10亚基延伸1min。

进一步的，所述步骤二中：1×Buffer为10mmol/LTris-HCl，pH＝8.3，50mmol/LKCl。

本发明的有益效果在于：本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行 分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10 亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所 得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封 蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很 好的应用前景。

附图说明

图1是本发明的具体实施例的PCR检测结果；

图2是本发明具体实施例高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE电泳检测结果；

图3是本发明具体实施例分离群体5亚基PCR检测结果；

图4是本发明具体实施例分离群体10亚基PCR检测结果；

图5是本发明具体实施例初选种子SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特 征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效 果。

本方法所用的实验材料为中国春、宁春4号、扬麦19号以及宁春4号×扬麦19号F2 分离群体种子。宁春4号(1,17+18,5+10)为我国西北春麦区的主推品种，是优质面条专用粉 —雪花粉的主要原料；扬麦19号为我国长江中下游冬麦区的主推品种；中国春 (Null,7+8,2+12)用作分析扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成的参照品种。

1、小麦籽粒DNA的提取

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0 mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液(100 mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl)，65℃水浴约30min，其间每 隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95％乙 醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70％乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

2、高分子量谷蛋白亚基的PCR检测

考虑到5+10亚基对食品加工品质的影响较大，本方法对其进行PCR检查。

5亚基的引物序列为：

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系均为25μL，其中含1μL提取的DNA，1×Buffer(10mmol/LTris-HCl pH＝8.3，50mmol/LKCl)，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP各0.8mmol/L，每种引物各0.2μmol/L， Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s (5亚基)或1min(10亚基)，35个循环，最后72℃再延伸5min。

扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)进行电泳检测。

3、高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳

小麦籽粒提取DNA后，还剩下沉淀物。为全面了解小麦籽粒高分子量谷蛋白亚基组合， 选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL 蛋白质提取液(70mmol/LTris-HCl，2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油， 0.005％(W/V)溴酚兰)，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温， 10000rpm离心10min，取上清液上样。同时，以用蛋白质提取液直接从中国春、宁春4号 和扬麦19号的1/3～1/2粒种子提取的上清液作为对照(直接提取)。高分子量谷蛋白亚基的 检测采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3％，分离胶浓度为8％，二者交联度均为 3.33％，考马斯亮蓝染色。

4、宁春4号和扬麦19号5+10亚基的PCR检测结果

由图1所示，用5亚基特异性引物P1和P2进行PCR扩增，宁春4号扩增出450bp条带， 而扬麦19号未扩增出该条带，说明宁春4号含有5亚基；用10亚基特异性引物P3和P4进 行PCR扩增，宁春4号扩增出576bp特异性条带，而扬麦19号扩增出612bp特异性条带， 说明宁春4号含有10亚基，而扬麦19号含有12亚基。同时，也说明本方法提取的小麦籽粒 DNA可满足5+10亚基PCR检测的需要。

5、宁春4号和扬麦19号SDS-PAGE电泳检测结果

由图2所示，直接提取和提取DNA后再提取高分子量谷蛋白亚基，其SDS-PAGE电泳 结果一致，说明小麦籽粒DNA的提取对SDS-PAGE电泳结果影响不大。同时，根据Payne 等的命名标准，确定扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成为Null,7+9,2+12。

6、宁春4号和扬麦19号F2分离群体PCR检测结果

由图3所示，24粒种子中有15粒可扩增出明亮的450bp条带，说明约占总数3/4的种子 可能含有5亚基。由图4所示，泳道2、9、11、15、19、21、22、23、24可扩增出576bp特 异性条带，说明这9粒种子可能含有10亚基。考虑到约占总数3/4的种子含有5亚基，这9 粒种子10亚基基因位点很可能为纯合型，即为本研究的初选种子。

7、宁春4号和扬麦19号F2分离群体初选种子SDS-PAGE电泳检测结果

为进一步了解初选种子高分子量谷蛋白亚基的组合，对其进行SDS-PAGE电泳检测。结 果如图5所示，泳道3含Null,7+9,5+10亚基，泳道4、5、6含1,7+9,17+18,5+10亚基，泳道 7可能含1,7+9,17+18,2+10亚基，泳道8含1,7+9,17+18,5+10亚基，泳道9可能含 1,7+9,17+18,2+12,5+10亚基，泳道10含1,17+18,5+10亚基，泳道11含Null,17+18,5+10亚基。

本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进 行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基 的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽 粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完 整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离 本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本 文的实施例作为本权利范围的限定。