鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序方法和专用引物

摘要

本发明公开了一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法和专用引物，属于鸡线粒体基因组研究领域。鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序用引物，见序列表SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3。扩增及测序方法，包括以下步骤：（1）提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；（2）在鸡mtDNAD-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物（见序列表SEQIDNO.1、SEQIDNO.2），通过PCR反应扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖电泳检测；（3）设计测序引物（见序列表SEQIDNO.3）对PCR产物进行测序；（4）对测序序列进行拼接。本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，所获得的mtDNAD-loop区全序列可以应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化分析和种质资源鉴定与保护等多个领域。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鸡mtDNAD-loop全序列扩增及其测序 方法。

背景技术

动物遗传资源多样性能够为品种改良提供素材，并且能够很好适应环境的变化。我国有 丰富家禽地方品种资源，研究和评估我国家禽地方品种的遗传多样性，制定合理的利用和保 护措施对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。研究动物遗传多样性的方法主要有微卫星 和线粒体DNA等，两种方法各有优缺点，线粒体DNA更容易操作。畜(禽)品种大都受 到外来公畜(禽)杂交改良的影响，群体数量减少甚至消失，给研究品种起源和多样性带来 很大困难。线粒体DNA在遗传过程中，遗传物质通过卵细胞质传递，较少发生DNA重组， 其野生祖先的线粒体DNA类型一般能得以保持。这种遗传方式，一个个体就能代表一个母 性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。研究者可以从复杂的遗传背 景中分辨不连续的母系血统，即使经过几千年的杂交繁育，系统关系依然明晰。

鸡线粒体基因组一般在16785bp左右，为闭合环状双链结构，能够自主复制和转录。包 括37个基因的编码编码区(13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转运RNA 基因)和1个控制区(D-loop)。D-loop区为mtDNA上最重要的非编码区，进化速率较编 码区更快，是适合亲缘关系较近的群体进行遗传分化研究的理想分子标记。D-loop区部分或 者全部序列已经广泛地应用于动物类群的遗传多样和系统进化研究中。国内外虽然已经有人 用D-loop区高变区进行鸡遗传多样性和亲缘进化的研究，但是全序列包含的遗传信息更为丰 富，目前还没有运用D-loop区全序列对我国家禽地方品种进行系统的研究，因此建立mtDNA D-loop区全序列扩增和测序方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提出一种鸡mtDNAD-loop区全序列的扩增及测序方法和专用引物， 本发明速度快、成本低、易于掌握，能够有效检测出鸡的mtDNAD-loop区全序列。

本发明提供了一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序用引物，包括PCR引物和测序 引物，所述PCR引物的上游引物:5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物的下游引 物:5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；

所述测序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。

本发明还提供了一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：

(1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量。

(2)根据红色原鸡mtDNAD-loop区在mtDNA全基因组序列上的相对位置，在mtDNAD-loop 区上下游保守区域设计一对PCR引物，PCR引物引物序列为：

Forwardprime(SEQIDNO.1):5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'

Reverseprimer(SEQIDNO.2):5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'

(3)PCR产物测序与序列拼接

通过PCR反应，获得目的片段，纯化后送测序公司测序，由于mtDNAD-loop区下游结 构复杂，反向引物无法测出，根据正向引物已测出的mtDNAD-loop区序列设计一条测序引 物，进行引物步移(Primerwalking)测序，然后将正向引物和步移引物测得两条序列进行拼 接，获得mtDNAD-loop区全序列。

测序引物Walkingprimer(SEQIDNO.3)为5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。

步骤1中鸡羽毛中DNA的提取步骤为：羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛， 一般为2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离心管 中，每个样品加入裂解液1000μL及蛋白酶K40μL摇匀，放摇床内59℃水浴消化。消化充 分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2 mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放 入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液 放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用 70％的酒精洗一遍，以转速10000rpm离心10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干(1h)，加灭 菌水100uL溶解，放-20℃冰箱保存。

步骤3中PCR反应体系为：PCRMix25μL，10μmol/L引物各1.5μL，模板2μL，灭菌 水20μL。

步骤3中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，55℃30s，72℃60s)30循环，72℃ 4min。

步骤3中所述mtDNAD-loop区拼接方法为将测序得到的序列经DNAStar5.02软件的 SeqMan程序拼接。拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉 引物及多余的序列。

上述的方法，所述PCR扩增特异性条带为1635bp，包含mtDNAD-loop区全序列及上下 游部分序列，其核苷酸序列为：(大写字母表示上游和下游序列，黑色下划线表示上下游引物 位置，阴影部分表示步移引物位置)：

aattttattttttaacctaactccc240

ctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcataatcgtgcata300

catttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatgtactaaaccca360

ttatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtccattctatgcat420

gatccaggacatacccattcaccctccccatagacagctccaaaccactaccaagtcacc480

taactatgaatggttacaggacataaatctcactcttatgctcttcccccaacaagtcac540

ctaactatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacccatttggttat600

gctcgacgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatca

gtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacacccctcgcccta720

cttgccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgcataactcctgaa780

ctttctcacttttcacgaagtcatctgtggattatcttcccctctttagtccgtgatcgc840

ggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggcttcttcacaggtt900

gcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggactacacctgcgttg960

cgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgtgtatggggaatcat1020

cttgacactgatgcactttggatcgcatttggttatggttcttccacccccccggtaaat1080

ggtgctatttagtgaatgcttgtcggacatatttttatcaattttcacttcctctatttt1140

cttcacaaaactaggaaattcaccacaattttttctttgttattttttaatttttttttt1200

attttttaaaaacattttttaaaaaactaaattacatacaaactaccgcataaaatccct1260

caaactatacaaacgtttatcgtataatatatatacattattgtttattctatcattatt1320

agagaaactccactaccaaaaccatcattaaaacaaaaatttacatgccacttaactccc1380

ctcacaaacaatcgttatttatattgttaattagcaaacacaaaacccgccttctaccac1440

tataaa

1635

。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出鸡的mtDNA D-loop区全序列，从而为鸡分子遗传学及分子系统进化学研究提供有效的研究平台；

2、提供了一种节约成本、简便易行的扩增鸡mtDNAD-loop区全序列的方法。本发明提 供的鸡mtDNAD-loop区全序列可应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化分析 和种质资源鉴定与保护等多个领域；

3、本发明采用羽毛采集，替代传统的血液采样，减小了对实验动物的伤害，并且能获得 高质量的DNA模板。

具体实施方式

一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序用引物，包括PCR引物和测序引物。

PCR引物的上游引物:5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，

PCR引物的下游引物:5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'。

测序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。

一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：

(1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；

(2)在鸡mtDNAD-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物，通过PCR反应扩增包 含Cytb基因的片段，经琼脂糖电泳条带单一、亮度高；所述PCR引物的上游引物为:5'- AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物的下游引物:5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC -3'；

(3)设计测序引物对所述PCR产物进行测序，所述测序引物为：5'- GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'；

(4)对测序获得序列进行拼接，并剪掉上下游多余的序列，获得鸡mtDNAD-loop区全 序列，mtDNAD-loop区全序列全长为1231-1232bp。

用于扩增鸡mtDNAD-loop区全序列的PCR反应体系为：PCRMix25μL，10μmol/LPCR 引物的上、下游引物各1.5μL，模板2μL，灭菌水20μL。

用于扩增鸡mtDNAD-loop区全序列的PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃ 30s，72℃60s，30个循环；72℃4min。

羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的绒羽，剪碎后的 羽毛放入2mL离心管中，每个羽毛样品加入裂解液1000μL及蛋白酶K40μL摇匀，放摇床 内59℃水浴消化；

消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速10000rpm离心5min；

吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀5min后以转速10000rpm离 心5min；

吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速10000rpm离心5 min；

吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇， 再把DNA团块用70％的酒精洗一遍，以转速10000rpm离心10min；倒掉乙醇，留下DNA， 凉干1h，加灭菌水100uL溶解，于-20℃保存。

mtDNAD-loop拼接方法为：将测序得到的序列用DNAStar5.02软件的SeqMan程序拼 接，拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序 列。

实施例1藏鸡系统进化及遗传多样性的研究

1.1DNA样本制备

采集30只藏鸡颈部换羽后刚长出的羽毛，公母各半，随机取样。用剪刀剪掉羽根上部的 绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液1000μL及蛋 白酶K40μL摇匀，放摇床内59℃水浴消化。消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min 后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀 5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇 匀5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀 出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70％的酒精洗一遍，以转速10000rpm 离10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干(1h)，加灭菌水100uL溶解，放-20℃冰箱保存。

1.25个亚种红色原鸡D-loop区全序列下载

从GenBank数据库中下载红色原鸡5个亚种Gallusgallusbankiva、Gallusgallusgallus、 Gallusgallusmurghi、Gallusgallusjabouillei、Gallusgallusspadiceus等已经测出mtDNAD-loop 区全序列的序列，与藏鸡进行系统发育分析。

1.3PCR扩增

PCR扩增体系(50μL)：PCRMix(南京博尔迪公司)25μL，10μmol/L引物各1.5μL，模 板2μL，灭菌水20μL。反应程序为：95℃5min，(95℃30s，55℃30s，72℃60s)30循 环，72℃4min。1.5％低溶点琼脂糖(Promega公司)凝胶电泳检测PCR产物，用试剂盒(Promega 公司)回收纯化。纯化后连同正向引物和步移引物一起送测序公司测序。

1.4序列组装和分析

将测序得到的序列用DNAStar5.02软件的SeqMan程序拼接，拼接序列与GenBank中 红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序列。用DnaSPversion5.10软 件统计多态位点数和突变位点总数，单倍型数，单倍型多样度，核苷酸多样度等。用MEGA 4.0进行转换与颠换数目的统计和碱基组成分析，并用其采用邻接法构建系统发育树，发育 树选用Kimura2模型，1000次重复。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。