中华鳖心脏细胞连续细胞系及其构建方法和超低温冷冻保存方法

摘要

本发明涉及一种中华鳖心脏细胞连续细胞系，该细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.10597；还涉及该细胞系的构建方法和超低温冷冻保存方法，其中构建方法包括以下步骤：(1)原代培养：取中华鳖心脏经前处理后剪成组织小块，胰蛋白酶室温消化后接种于培养瓶中，当细胞铺满瓶底至90％以上时，开始传代培养；(2)传代培养：采用胰蛋白酶消化法，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，进行传代。本发明中构建的中华鳖心脏细胞连续细胞系可在分子细胞水平上进行中华鳖以及其他龟鳖动物的病毒性疾病研究并进行相关治疗药物的研究，例如染色体分析、虹彩病毒研究等，并且也可以满足对中华鳖种质资源保存和理论研究与应用的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种中华鳖心脏细胞连续细胞系及其 构建方法和超低温冷冻保存方法。

背景技术

中华鳖(Pelodiscussinensis)又名水鱼、甲鱼、团鱼，隶属爬行纲、龟鳖目、鳖科， 在中国、日本、越南北部、韩国以及俄罗斯东部均有野生中华鳖分布，是一种珍贵的、 经济价值很高的水生动物。近年来，中华鳖的养殖量有逐年增加趋势，然而，由于人工 控温、高密度集约化等养殖方式改变了中华鳖的自然生活习性，同时中华鳖商品和种苗 交易频繁，各种疾病频繁发生，鳖病已经严重威胁着我国养鳖业，年经济损失达数亿元， 制约了养鳖业的进一步发展。因此，疾病防治是中华鳖养殖业的重要研究方向。

中华鳖疾病的研究，起步较晚，基础研究薄弱，且该类动物的疾病具有潜伏期长、 病程长、易导致并发症等特点，严重阻碍了中华鳖疾病防治的开展。近年来相继报道的 中华鳖疾病有红脖子病、赤斑病、疖疮病、嗜水气单胞菌病、腐皮病、败血症、疱疹病、 水泡病、穿孔病、白点病、虹彩病毒病等，引起这些疾病的因素，既有病毒性的也有细 菌性的，其中病毒是一些疾病如粘液性鼻炎、坏死性肠炎和各种肺炎及肝炎的原发病因 之一，如引起白点病的病毒为疱疹样病毒(Herpesvirus)；红脖子病病毒为弹状病毒 (Rhabdovirus)；红底板病病毒与腺病毒(Adenovirius)类似；白底板病有两种病毒， 一种类似腺病毒，另一种类似呼肠孤病毒(Reovirus)，分别寄生于脾脏和肾脏中。

细胞系是指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体，其中能够连续传 代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，而不能连续培养的细胞系称为有限细胞系。目 前，龟鳖动物的病毒性传染病的研究一般选用草鱼卵巢细胞等细胞系作为研究载体，还 没有合适的中华鳖细胞系作为载体来研究中华鳖病毒性疾病。研究发现，感染了病毒的 中华鳖的肝、脾、肾、心、肠、肺等器官的组织和细胞均有不同程度地受损，可见心是 中华鳖病毒感染的重要靶组织之一。正常的心脏细胞的细胞核呈棒状，其周围有少量原 生质，感染病毒后的中华鳖心脏切片可见：心脏细胞细胞核消失、肌纤维排列紊乱、断 裂，呈变形和坏死变化。可见，中华鳖心脏细胞系是较理想的用于研究中华鳖病毒性疾 病的载体，然而，目前中华鳖心脏细胞培养研究鲜有报道，商品化的中华鳖心脏细胞系 至今没有介绍，中华鳖心脏细胞连续细胞系更是至今未见报道，因此中华鳖细胞的研究 成为制约中华鳖病毒性疾病深层次研究的瓶颈，研究中华鳖心脏细胞连续细胞系对打破 中华鳖病毒性疾病的研究瓶颈具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种中华鳖心脏细胞连 续细胞系，该细胞系可作为中华鳖病毒性疾病研究的载体。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种简单易行的上述中 华鳖心脏细胞连续细胞系的构建方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种有效保存上述中华 鳖心脏细胞连续细胞系的超低温冷冻保存方法。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种中华鳖心脏细胞连续细胞 系，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏时间为2015年5月18日，保藏编号为CGMCCNo.10597。

本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：上述中华鳖心脏细胞连续细胞系 的构建方法包括以下步骤：

(1)原代培养

清洗、消毒中华鳖体后将其置于超净工作台中，取其心脏并清洗除去血块组织以 及结缔组织，将心脏剪成1mm³及以下的组织小块，0.125％～0.25％的胰蛋白酶室温消化 20min～25min，然后将消化后的组织块接种于培养瓶中，加入原代培养液倒置放置于30 ℃培养箱中培养，24h之后翻转培养瓶并添加原代培养液至适量，每3d更换一次培养液， 约一周后细胞开始从组织块中迁移，约两周后迁出的细胞在组织块周围汇合成单层，此 时移除组织块，当细胞铺满瓶底至90％以上时，开始传代培养；

(2)传代培养

吸出培养瓶中的原代培养液，加入2～3ml胰蛋白酶浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白 酶-EDTA溶液，消化10～30s，待细胞与周围组织链接出现松动后，加入终止消化培养 液体以中和胰酶反应；吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，800rpm～1000rpm离心8～10min加 入原代培养液进行传代，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2或1:3进行传代， 于30℃培养箱中继续培养；每5d～7d传代一次，传至第10代时，将细胞培养液换成传 代培养液，细胞系建立成功。

作为优选，所述原代培养液的配置过程为：向MEM培养液中加入胎牛血清、细 胞生长因子EGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15％，EGF浓度为10ng/ml， 青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml，pH值 为7.0～7.2。

作为优选，所述传代培养液的配置过程为：向MEM培养液中加入胎牛血清和抗 生素，使胎牛血清体积占总体积的15％，霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml， 两性霉素B浓度为20μg/ml，pH值为7.0～7.2。

本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案为：上述中华鳖心脏细胞连续细胞系 的超低温冷冻保存方法包括以下步骤：

(1)配制细胞冻存保护液:将胎牛血清与DMSO按体积比9:1混合，混合均匀制得 细胞冻存保护液；

(2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶 液消化后，细胞悬液于800rpm～1000rpm离心8min～10min，弃掉上清液，向细胞沉淀 中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度达到1×10⁶个/ml，将细胞悬液转移至 冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明针对中华鳖心脏组织特点，采用胰蛋 白酶消化法，避免了常规组织植块法存在的细胞迁出困难等问题，获得的原代心脏细胞 能正常贴壁生长并快速增值，连续传代并成功建系，该心脏细胞系经连续传代后，仍能 保持中华鳖心脏细胞的生物学特性，因此该细胞系可在分子细胞水平上进行中华鳖以及 其他龟鳖动物的病毒性疾病的研究、预防以及相关治疗药物的研究，例如染色体分析、 虹彩病毒研究等，并且也可以满足对中华鳖种质资源保存和理论研究与应用的需要，本 发明中的构建方法除适用于中华鳖心脏细胞外，也适用于其他水产类、爬行类动物心脏 细胞系的构建。

附图说明

图1为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系原代培养7d后的细胞形态图(10×10)；

图2为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系原代细胞第一次传代前的细胞形态图 (10×10)；

图3为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系传代培养至第10代的细胞冻存复苏后 的细胞形态图(10×10)；

图4为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系传代培养至第33代的细胞形态图(10 ×10)；

图5为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系经苏木精—伊红染色法处理后的细胞 形态图(10×10)；

图6为本发明中中华鳖心脏细胞连续细胞系的生长曲线图。

保藏说明：分类命名：中华鳖心脏细胞连续细胞系，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2015 年5月18日，保藏编号为CGMCCNo.10597。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：中华鳖心脏细胞连续细胞系的构建

1.1PBS消毒液和细胞培养液的制备

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为 100μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。

原代培养液：向MEM培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子EGF和抗生素，使 胎牛血清体积占总体积的15％，EGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素 浓度为100μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml，调节培养液的pH值为7.0～7.2，放置 于4度冰箱中保存备用。

传代培养液：向MEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积 的15％，霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml； 终止消化培养液：向MEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10％， 调节培养液的pH值为7.0～7.2，放置于4度冰箱中保存备用。

1.2原代培养

用0.1％的高锰酸钾液浸泡消毒中华鳖体30min，清洗后用75％的酒精擦拭鳖体表 面，置于超净工作台中。用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清 洗除去血块组织以及结缔组织。接着，用无菌器械将心脏剪成1mm³大小组织小块，并 用0.25％胰蛋白酶室温消化20min，之后将消化后的组织块接种于25cm²细胞培养瓶中， 加入原代培养液2ml倒置放置于30℃培养箱中启动原代培养，24h之后翻转细胞培养瓶 并添加原代培养液至10ml。此后，每3d更换一次培养液，第7d细胞开始从组织块中 迁移，15d在组织块周围汇合成单层，此时移除组织块，20d长成细胞单层。

1.3传代培养

当原代中华鳖心脏细胞铺满细胞培养瓶瓶底90％时，开始传代。首先，吸出培养 瓶中的原代培养液，加入2ml0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液，消化10～20s，待细胞与 周围组织链接出现松动后，加入4ml终止消化培养液体(胎牛血清)以中和胰酶反应， 吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，800rpm离心10min加入10ml原代细胞培养液进行传代。 首次按体积比1:1传代，此后按体积比1:2进行传代，于30℃培养箱中继续培养；每 7d传代一次，传至第10代时，将细胞培养液换成传代培养液，此时，细胞系建立成功。

实施例2：中华鳖心脏细胞连续细胞系的构建

2.1原代培养

用0.1％的高锰酸钾液浸泡消毒中华鳖体30min，清洗后用75％的酒精擦拭鳖体表 面，置于超净工作台中。用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清 洗除去血块组织以及结缔组织。接着，用无菌器械将心脏剪成0.8mm³大小组织小块， 并用0.125％胰蛋白酶室温消化25min，之后将消化后的组织块接种于25cm²细胞培养 瓶中，加入原代培养液2ml倒置放置于30℃培养箱中启动原代培养，24h之后翻转细胞 培养瓶并添加原代培养液至10ml。此后，每3d更换一次培养液，第7d细胞开始从组 织块中迁移，15d在组织块周围汇合成单层，此时移除组织块，20d长成细胞单层。

2.2传代培养

当原代中华鳖心脏细胞铺满细胞培养瓶瓶底90％时，开始传代。首先，吸出培养 瓶中的原代培养液，加入3ml胰蛋白酶浓度为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液，消化 20～30s，待细胞与周围组织链接出现松动后，加入4ml终止消化培养液体(胎牛血清) 以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，1000rpm离心8min加入10ml原代细胞 培养液进行传代。首次按体积比1:1传代，此后按体积比1:3进行传代，于30℃培养 箱中继续培养；每5d传代一次，传至第10代时，将细胞培养液换成传代培养液，此时， 细胞系建立成功。

实施例3：细胞冻存和复苏

3.1细胞冻存

将胎牛血清和DMSO按9:1的体积比混合，混合均匀后得细胞冻存保护液。取对 数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，细胞悬液1000rpm离心 8min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为1× 10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中并将冻存管置于程序降温盒中，-80 ℃过夜，然后放入液氮中长期保存。

3.2细胞复苏

将上述冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌 操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量原代细胞培养液，1000rpm 离心8min，除上清液，用传代培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，30℃培养箱 中培养，1d后更换全部培养液，7d细胞即长成单层。

上述实施例2中PBS消毒液和细胞培养液的配制方法与实施例1相同，实施例1、 2中制备的中华鳖心脏细胞已在体外连续传代14个月，目前已传至53代，保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏时间为2015年5月18日，保藏编号为CGMCCNo.10597，图5为中华鳖心脏细胞 经苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)处理后的细胞形态图，可见中华鳖心 脏细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，细胞核呈蓝色而细胞质呈红色(图 中未显示颜色仅通过文字描述)。如图1所示，中华鳖心脏细胞原代培养7d后，细胞从 组织块周围迁出，并逐渐在组织块周围汇合而形成单层；如图2所示，原代细胞第一次 传代前，细胞汇合成单层，细胞胞体大，呈纺锤形或星形，细胞核呈规则的卵圆形，细 胞轮廓不清，具有突起，具有典型成纤维细胞形态，图6为中华鳖心脏细胞的生长曲线 图，从图6可以看出，该细胞在传代后第1d为滞留期，第2d开始进入指数期，第5d 开始进入平台期，第8d进入衰亡期，选择5d～7d传代是综合考虑细胞数量和增殖情况 的结果；如图3所示，中华鳖心脏细胞连续细胞系传代培养至第10代的细胞冻存复苏 后细胞均一，复苏后细胞状态良好；如图4所示，中华鳖心脏细胞连续细胞系传代培养 至第33代的细胞形态和以前并无差异，可见该连续细胞系增殖稳定性较好。