中华鳖(Pelodiscus sinensis)心脏源成纤维细胞系的建立、鉴定以及应用研究

摘要

中华鳖是我国重要的水产品之一，其肉质鲜美，营养价值高，深得消费者喜爱，市场前景较好，多年来其养殖业发展一直备受关注。近年来，由于人工养殖越来越普及，集约化程度越来越密集，养殖密度的增大，滋生病菌的机会大大增加，引起疾病发生；生产实践中，中华鳖由于病毒性疾病引起的继发感染，严重影响了其产品品质、口感变差，甚至出现大批死亡，严重制约了中华鳖养殖业的健康发展。然而迄今为止，有关中华鳖细胞系的建立以及应用鲜见报道，有关细胞系的建立方法，常见的有胰蛋白酶消化法和组织植块法，胰酶消化法消化时间不容易掌控，常常出现消化过度或者消化不充分，组织植块法易导致细胞迁出困难，本文对组织植块法进行改良，充分应用两种方法的优点以启动细胞培养的过程。建立的中华鳖细胞系，可以用来研究中华鳖病毒性疾病，同时可以用于免疫基因及免疫机理的相关研究，有利于弄清中华鳖免疫机制，这对从根本上预防和治疗中华鳖疾病有重要意义。此外，中华鳖细胞系可以用于外源基因的转染和表达，对于转基因工程研究、基因表达调控、基因突变分析以及蛋白纯化表达等领域具有重大的实际意义和应用价值，还可以为转基因、抗逆抗病新品种的培育和优选奠定基础。 本研究主要有以下几方面的内容： 1.中华鳖心脏源成纤维细胞系（Pelodiscus sinensisfibroblast,PSF）的建立方法研究：以中华鳖心脏组织作为材料，采用半消化法建立了一个新的中华鳖心脏组织成纤维细胞连续系，命名为PSF。探索该细胞系的最适生长温度，最适培养基，最适血清浓度：在5%CO2，血清浓度为15%，培养基为MEM条件下，设定25℃，30℃和35℃三个温度梯度，结果表明该细胞系的最适生长温度为30℃；在5%CO2，温度为30℃条件下，设定三种培养基MEM，DMEM，RMPI-1640，结果表明MEM是该细胞系的最适培养基；在5%CO2，温度为30℃条件，15%胎牛血清，培养基为MEM条件下，设定10%，15%和20%三个血清浓度梯度，结果表明，血清浓度为15%时生长最好，是该细胞系的最适血清浓度。在原代培养细胞以及前10代细胞生长的培养基中添加一定量的生长因子EGF，结果显示对细胞的分裂增殖有促进作用。对该细胞系进行生长动力学测定，冻存和复苏细胞成活率测定，结果显示该细胞系的生长曲线呈现典型的“S”型，生长特性分析显示该细胞系的群体倍增时间是51.1h，冻存前后细胞的存活率分别为98.54±4.53%和96.36±3.77%，两者差异不显著(p>0.05)。 2.中华鳖心脏源成纤维细胞系PSF的鉴定与结果。通过比较PSF细胞线粒体基因D-LOOP区基因序列和中华鳖相关的基因序列，细胞形态学观察，核型分析，同工酶检测，微生物污染检测主要是支原体检测，免疫组织化学鉴定等手段对细胞系进行鉴定。基因序列比对显示该细胞系和其他中华鳖物种基因序列同源性在96%以上，结合PCR结果确定了该细胞系来源为中华鳖；通过苏木精-伊红（HE）染色，显微镜观察PSF细胞呈漩涡状排列，与周围界限比较清楚，胞质多，粉红色，胞核蓝紫色，比较明显，细胞呈典型的梭形、棱形、不规则形或者多角形，呈现典型的成纤维细胞形态；染色体核型分析显示该细胞二倍体染色体组成为2N=66。支原体污染检测结果显示该细胞系无支原体感染。免疫组化显示，PSF细胞系呈现典型的成纤维细胞形态，细胞纯度较高。同工酶电泳分析包括乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶(MDH)显示该细胞系和其他细胞不存在交叉污染。 3.中华鳖心脏源成纤维细胞系 PSF的转基因技术初步研究。利用质粒pEGFP-C3和脂质体Lipofectamine?2000，将EGFP成功导入PSF细胞系，使其在细胞系中表达，观察发现转染48h之后转染效率最高，达到16%。 本研究成功建立了中华鳖心脏组织来源细胞成纤维细胞系，该细胞系从2013年7月开始建立，至今传代次数已经超过50代。利用该细胞系作为体外研究体系在转基因技术方面进行了研究，为中华鳖细胞系在病毒性疾病研究，中华鳖免疫机理研究以及转基因选育培育抗逆新品种等研究奠定了一定的基础。

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引言

第一章 文献综述

1.1 水生动物细胞培养与细胞系研究概况

1.2 水生动物细胞培养与细胞系建立方法研究进展

1.3水生动物细胞培养技术的应用

1. 4本研究的目的和意义

第二章 中华鳖心脏源成纤维细胞系的建立

2.1引言

2.2材料与方法

2.3实验结果与分析

2.4讨论

第三章 中华鳖心脏源成纤维细胞系的检测与鉴定

3.1引言

3.2材料和方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论

第四章 中华鳖心脏源成纤维细胞系转基因技术初步研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.3实验结果

4.4讨论

第五章 结论

论文创新性

参考文献

科研成果及资助单位（个人）

致谢