牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA全长序列及其应用

摘要

本发明公开了一种牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA全长序列及克隆和检测方法。该序列全长3614？bp，含3078？bp的开放阅读框，编码1024个氨基酸。本发明通过以近源物种TLR8的cds序列保守区设计兼并引物，通过反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆TLR8的全长cDNA序列。TLRs家族是动物识别入侵病原体的主要？“模式识别受体”，通过感知识别病原体的相关分子模式，激活天然免疫系统。本基因的获得为研究鱼类TLR8的基因表达调控机理及免疫学功能奠定基础，还可为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供分子水平材料。

说明书

本发明得到天津市自然科学基金重点项目（14JCZDJC34200）“迟钝爱德华氏菌诱导的牙鲆TLRs家族免疫应答机制研究”的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是牙鲆模式识别受体TLR8基因全长表达序列和所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。

背景技术

随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑，掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。

在人类免疫学研究的历史舞台上,细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下,固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识,明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代,Janeway等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出,标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在两种免疫应答类型：固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。

Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。一般认为TLR1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21～23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现，有研究报道TLR21即可识别细菌成分，也可识别病毒成分。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目，鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重,该病从苗种到成鱼均有发生,死亡率可达50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。

TLRs是宿主免疫的必需分子之一,通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR8作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。牙鲆模式识别受体TLR8基因结构的阐明，有助于人们更加深入地了解TLR8的功能及其与鱼类免疫应答的关系，加深人们对鱼类精细而复杂免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗相关鱼病的新策略以及抗病育种设计、抗病性转基因鱼设计、基因疫苗的设计和疫苗的安全使用等提供重要的理论基础，并在鱼类疾病防治，环境监测以及生态系统保护等方面发挥作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA序列及克隆方法。

本发明采用的技术方案是通过以近源物种TLR8基因的CDS序列保守区设计兼并引物，通过RT-PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得牙鲆TLR8基因的全长表达序列。

TLR8基因cDNA全长3614bp，含有3078bp的开放阅读框，编码1024个氨基酸，其中前21个氨基酸序列为信号肽序列。TLR8基因的起始密码子上游有一个终止密码子TAA，距poly(A)尾38个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为TLR8基因的全长cDNA序列。TLR8基因编码的蛋白质，分子量为117.8KDa，等电点为8.68。

本发明进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR8基因序列在用于实时荧光RT-PCR检测实现牙鲆疾病监测与防治方面的应用。实验结果显示：Poly(I:C)模拟病毒在腹腔注射牙鲆后3小时内，牙鲆脾脏TLR8基因的表达量增高，而后，TLR8表达量降低至0时的水平之下。牙鲆TLR8基因表达量的改变，提示我们TLR8参与了牙鲆对Poly(I:C)模拟病毒的免疫应答，有潜力成为牙鲆病毒感染的早期监测指标。

本发明更进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR8的基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步骤：

(1)健康牙鲆经免疫原免疫刺激后解剖分离脾脏组织：

由于TLR8基因为免疫相关基因，在病原感染后其表达量通常会有提高，因此在提取总RNA之前对健康牙鲆首先进行免疫刺激。选择人工合成的Poly(I:C)为免疫原物，腹腔注射牙鲆体内，免疫2h后处死解剖分离脾脏组织。

(2)总RNA的提取和纯化：

采用Trizol法从牙鲆脾脏中提取得到牙鲆脾脏总RNA。总RNA纯化采用DNA酶消化法。

(3)中间片段的克隆测序：

（3.1）cDNA第一链的合成

以纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以Oligo(dT)₁₆为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。

（3.2）PCR扩增

由于该基因较长，所以本发明选择将中间片段分为三段区域进行扩增。以前述所得的cDNA第一链作为模板，利用下述三对引物进行TLR8基因中间片段1-3的扩增：

正向引物1：TLR8-F1：5'-CCTTCCAGHCCRGACCDG-3'(H＝A/C/T，R＝A/G,D＝A/G/T)

反向引物1：TLR8-R1：5'-GTCTTGCGRCTGTATYGG-3'(R＝A/G,Y＝C/T)

正向引物2：TLR8-F2：5'-CACCTSGCRGAAAACAG-3'(S＝C/G,R＝A/G)

反向引物2：TLR8-R2：5'-GATTGCTCATTACCCACT-3'

正向引物3：TLR8-F3：5'-CACATGTTGGAYGCACCT-3'(Y＝C／T)

反向引物3：TLR8-R3：5'-GGTATGTCAGATTAGGTAGCG-3'

扩增得到牙鲆TLR8基因cDNA的三个中间片段，通过克隆测序，得到三个中间片段序列。

本步骤中，扩增体系可优选如下：

使用BIO-RADC1000TouchThermalCycler仪器进行梯度PCR扩增，程序参数可优选为：

94℃4min；

94℃50s；50~62℃40s；72℃1min(35个循环);

72℃7min；12℃保温。

(4)3’端的克隆测序：

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，设计并合成用于3'端巢式PCR的两个正向引物以及通用性反向引物，分别为:

通用反转录引物：

3-Ap：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈-3'

巢式PCR正向特异性引物：

TLR8.3-F1：5'-ATCCTCACTACCTCCTTCATTATTG-3'

TLR8.3-F2：5'-GTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATC-3'

巢式PCR反向接头引物

TLR8.3-R1：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3'

TLR8.3-R2：5'-GCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'

以前述步骤(3)纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以3-Ap为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢式PCR扩增的cDNA模板。以TLR8.3-F1和TLR8.3-R1为正反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，TLR8.3-F2和TLR8.3-R2为正反向引物进行第二轮PCR扩增。

(5)5’端的克隆测序：

(5.1)合成5’端的cDNA第一链

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，设计并合成特异性反转录引物：

TLR8.5-R：5'-TAATGACAGAGGCAATCC-3'

以前述步骤(2)纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以特异性反向引物TLR8.5-R为反转录引物，进行反转录，反转录产物使用RNaseH消化残余RNA，并用末端转移酶在3'端添加poly(C)尾巴，得到5’端的cDNA第一链。

(5.2)PCR扩增

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，使用Primer5软件设计两个特异性反向引物，用于5'端巢式PCR：

TLR8.5-R1：5'-GGAGTAGCAGTTTTTGGTGAGCCACAGTTTTGTC-3'

TLR8.5-R2：5'-TGAAGCTTGTTATTGTTCAGCTCAAGGATTTC-3'

正向引物为通用接头引物：

TLR8.5-F1：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGG-3'

TLR8.5-F2：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

首先以正向接头引物TLR8.5-F1和特异性反向引物TLR8.5-R1为引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以正向接头引物TLR8.5-F2和特异性反向引物TLR8.5-R2为引物进行第二轮PCR扩增。

(6)将上述步骤(3)所得三段中间片段序列、步骤(4)所得3’端序列、和步骤(5)所得5’端序列用软件进行拼接，获得牙鲆TLR8基因的全长cDNA序列，如SEQIDNO.1所述，并由基因序列推导出氨基酸序列，如SEQIDNO.2所述。

TLR8基因cDNA全长3614bp，含有3078bp的开放阅读框，编码1024个氨基酸，其中前21个氨基酸序列为信号肽序列。TLR8基因的起始密码子上游有一个终止密码子TAA，距poly(A)尾38个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为TLR8基因的全长cDNA序列。TLR8基因编码的蛋白质，分子量为117.8KDa，等电点为8.68；

MTATCWMPLLLWVCFHYEVQPAAKPLWMSPKFPCNVTANNESVVKFDCRGRHLHKVPYGITRNVTELNLSENVIANISSQAFSNLLNLTSLSLNWANKNRGLLISENIFKNLTKLNHLGLTGNALKKIPSNLPPSIEILELNNNKLQLDNMNLSGLTNVTKLWLTKNCYSWNPCRRNFTIMNNTFAVMTKLQSLGLSFNNLTHVPHGLPLSLMELELSSNKIQYISDNDFIGLHNLKSLKIQGNCPRCQNAPYPCVACQNLSLGIHPYAFHTLTEETLHLGGNSLQFLNPNWFKNLKQTENLFLSFNFLQKAITGNATFLSYLPNLEKIDLSFNFALMLYPTTIHLSKDFAYLKSLRTLHMEALVFQNIGPDTLSPLYELKNLSALNLGTNFIIHSDSNVFRRLSHVKLIYLADNRLYPIPDKSPPYLSDKYNQRSDFSISPNIKSHKDSDLEESHTFVKKECYESGRILILSSNNIFFISPKQFEGYENIACLNLSGNGFSAALNGTEFSSLPNLTYLDLSFNKIDLAYDNAFKELKKLQVLDLSYNPHYFQSYGITHNLNFIKNLPVLRVLNMSHNAISTSSTKQLYSQSLSELQFTNNFLGTLWKEKDVTYKQLFTQLTNLTYLDISENQIKKIPDDVYQYFPRNLTKLCISHNLLTGFKWDAMSYFHQLQVLDLSFNSLSDVTGINLSFTQTLTFFDLSHNKIFHLDDGFIKGPKSLSILSLSYNKLTTINQSTFQSRPENQIKILHLQNNPFQCTCDSIDFILWIEASKVKIPRLTTEVKCDTPANQKDHILIYFDIKPCVDDSKALRMYILTTSFIIAFMFVATTAHLFYWDASYVIHYMKAKLKGYSSLNSSDSFYDVFVTYDNRDPHVSEWVMSNLRVKLEEEGEKHLPLCLEERDWVPGVPVLDNLTHSIRYSRKTLFVLTEGYVKTGIFKLAMYLAHQRLLDENVDVIVLLMLEPVLQHSQFLRLRRRLCGKSVVEWPRTAAAEPWFWVNLRNVVRVDNQVMYNKTYSKYLTSR

本发明的有益效果是：

（1）本发明来源于牙鲆的模式识别受体TLR8的基因序列是一种新的TLR8基因序列，使人们对TLR8基因的研究对象从少数有限的鱼类进一步扩展到牙鲆等多种鱼类。

（2）本基因的获得不仅为研究鱼类TLR8基因表达的调控机理以及TLR8受体蛋白与鱼体抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯化蛋白，为进一步研究TLR8的蛋白质结构和免疫学功能奠定理论基础。本基因还可为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供分子水平材料，同时可以进行抗病相关性及抗病辅助育种的研究。

（3）TLRs家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，作为宿主免疫的必需分子之一,通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR8参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此TLR8基因的表达水平是鱼类免疫力的指示器，通过检测TLR8的mRNA丰度，可以对鱼体免疫系统的活化程度进行评价，作为鱼类疾病防治过程中免疫监测的指标，并在环境监测以及生态系统保护等方面发挥作用。

（4）疫苗接种可激发宿主产生保护性免疫应答反应，以达到预防疾病的目的。有效的疫苗不仅需要含有保护性的抗原成分，而且还需要含有能活化天然免疫系统以提高疫苗免疫原性的佐剂组分。大多数疫苗佐剂都是TLRs家族的配体，因此了解TLR8的结构及功能机制，对于研制更安全、更高效的疫苗至关重要。

附图说明：

图1为牙鲆TLR8基因中间片段1电泳检测结果，其中5号泳道为预期片段560bp；

图2为牙鲆TLR8基因中间片段2电泳检测结果，预期片段1263bp；

图3为牙鲆TLR8基因中间片段3电泳检测结果，预期片段1550bp；

图4为牙鲆TLR8基因3’端电泳检测结果，预期片段772bp；

图5为牙鲆TLR8基因5’端电泳检测结果，预期片段698bp；

图6为牙鲆TLR8基因实时荧光RT-PCR产物电泳结果，产物长度156bp；

图7为牙鲆内对照基因β-actin实时荧光RT-PCR产物电泳结果；产物长度150bp；

图8为人工模拟病毒分子免疫刺激牙鲆后脾脏组织中TLR8基因的相对表达量。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。

实施例1：

牙鲆脾脏组织分离：

市场上购买的健康牙鲆（0.5kg左右）于水族箱内25℃暂养三天，腹腔注射模拟RNA病毒分子Poly(I:C)400μg，2h后断颈处死牙鲆，于超净台上解剖并分离脾脏组织。以上步骤全为无菌操作。

实施例2：

总RNA的提取和纯化：

(1)取脾脏组织100mg用剪刀剪碎加入1mL的Trizol试剂（美国invitrogen公司)和10μL肝素于匀浆器里彻底研磨匀浆，然后转移至1.5mL无RNase的离心管中震荡混匀，室温放置5min，使其充分裂解。

(2)4℃、12000rpm离心5min，将上清液转入新的无RNase的离心管中。

(3)向每管加入0.1mL5mol/L的NaCl混合均匀，再向每管加入0.3mL氯仿，剧烈振荡15s后，室温放置3min,4℃、12000r/min离心15min，在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的1.5mL离心管中。

(4)向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混匀后，室温放置10min,4℃、12000r/min离心10min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。

(5)4℃、7500r/min离心5min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，再加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/min离心5min,，所得沉淀即为牙鲆脾脏总RNA，-70℃保存。

（6）提取的总RNA可用DNaseI酶（Invitrogen公司）进一步纯化，以去除RNA中残存的DNA，具体如下：往0.2mL离心管中加入1μg提取的总RNA、1μL10×DNaseI反应缓冲液、1μLDNaseI（1U/μL）、DEPC水补至总体积到10μL，室温或37℃放置15min，加入1μL25mMEDTA，65℃10min。既得纯化的总RNA。

实施例3：

中间片段的克隆测序：

(1)中间片段1的克隆测序：

（1.1）引物设计：

首先从GeneBank中下载所有鱼类TLR8基因的全长cDNA序列及氨基酸序列，根据鱼类分类学，得知牙鲆的分类地位同雀鲷（Stegastespartitus）鱼最近，引物设计使用Primer5引物设计软件，以雀鲷鱼TLR8序列（XM_008275651）为模板，结合其它鱼类的序列比对结果为校正，设计兼并引物用于TLR8中间片段1的序列扩增。

TLR8-F1：5'-CCTTCCAGHCCRGACCDG-3'

TLR8-R1：5'-GTCTTGCGRCTGTATYGG-3'

(1.2)cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，使用QIAGEN公司的QIAGENQuantitectReverseTranscription试剂盒，以Oligo(dT)₁₆为反转录引物，按照试剂盒推荐方法反转录合成cDNA第一链。扩增体系总体积为20μL，得到中间片段的cDNA第一链。

(1.3)PCR扩增：

用上述反转录产物做模板PCR扩增TLR8的中间序列。PCR体系见下表

使用BIO-RADC1000TouchThermalCycler仪器进行梯度PCR扩增，程序参数可优选为：

94℃4min；

94℃50s；50~62℃40s；72℃1min(35个循环);

72℃7min；12℃保温。

取所得扩增产物10μL经1%琼脂糖凝胶,EB染色后紫外线检测扩增片段，检测结果如图1所示，第5泳道条带为预期产物。

(1.4)克隆测序：

目的片段的回收与纯化：将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1.5mL离心管中，用上海生工的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，按照试剂盒推荐方法回收胶中的DNA片段。

重组连接：使用上海生工的T-载体PCR产物克隆试剂盒，将回收的DNA片段克隆于pUCm-T载体中。连接反应体系总体积10μL,16℃连接12h。

感受态细胞的制备：①从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mLLB液体培养基中，37℃、225r/min振荡培养12h左右，直至对数生长后期;将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600=0.35-0.5左右。②将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000r/min离心10min。③弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000r/min离心10min。④弃去上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。⑤将感受态细胞分装成200uL的小份，贮存于-80℃冰箱（海尔超低温保存箱）可保存半年。

质粒DNA的转化：①从-80℃冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5α，置于冰上融化。②在无菌条件下加入10μL连接反应液，轻轻涡旋混匀后，在冰上放置30min。③42℃水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3min。④加入700μL无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃,100r/min摇床振摇培养，温育45min。⑤取100μL已转化的菌液涂布在含Amp（100μg/mL），并含X-gal和IPTG的平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，然后倒转培养皿，37℃避光培养20h，随后筛选阳性菌落。⑥用灭菌的白枪头挑取白色单菌落，连枪头一起打入含Amp（100μg/mL）的3mLLB液体培养基中，37℃振荡培养12~16h。

重组质粒验证：①取10μL上述白色单菌落培养扩增出的菌液于1.5mL离心管中，加入90μLddH₂O,煮沸10min，离心，取上清液2μL作为模板，用原来的上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件均同前，用1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果产物为预期大小的目的条带时，此重组菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。②取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750μL，加入250μL的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存备用。③菌液测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行，所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

TLR8中间片段1序列如下：

CCTTCCAGTCCAGACCTGAAAATCAGATTAAGATTTTGCACTTGCAGAATAATCCGTTCCAATGTACCTGTGACTCTATCGATTTCATTCTGTGGATTGAAGCCAGTAAAGTAAAAATCCCAAGACTGACCACTGAAGTGAAATGTGACACGCCAGCAAACCAGAAGGATCACATACTGATATACTTTGATATAAAACCGTGTGTAGATGACAGTAAGGCATTACGGATGTACATCCTCACTACCTCCTTCATTATTGCTTTTATGTTTGTGGCAACTACTGCTCACTTATTTTACTGGGATGCCTCCTATGTGATACACTATATGAAAGCTAAGCTGAAGGGGTACAGTTCCTTGAATTCATCAGACAGCTTTTATGATGTCTTTGTGACTTATGACAACAGAGATCCACATGTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATCTGCGGGTGAAACTGGAAGAGGAAGGAGAGAAGCATCTCCCTCTGTGTCTGGAGGAGAGGGACTGGGTCCCAGGAGTCCCGGTGCTGGACAACCTCACCCACAGCATCCGATACAGTCGCAAGAC

（2）中间片段2的克隆测序：

由于该基因较长，且所得中间片段距离5’端较远，所以根据上述所得已知中间片段1序列及NCBI中雀鲷等鱼TLR8序列，再次设计一对引物用于TLR8中间片段2的序列扩增。

正向兼并引物TLR8-F2：5'-CACCTSGCRGAAAACAG-3'(S＝C／G,R＝A／G)

反向特异引物TLR8-R2：5'-GATTGCTCATTACCCACT-3'

中间片段2的序列扩增步骤及反应条件同中间片段1。

1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。

中间片段2的克隆测序同本实例步骤（1.4）。

TLR8中间片段2序列如下：

ACCTCGCAGATAACAGACTGTATCCCATTCCGGATAAAAGTCCCCCATATCTGAGTGACAAATACAATCAGAGGTCAGACTTTTCCATTTCACCGAACATAAAATCCCATAAAGACTCTGATTTAGAGGAATCACACACCTTTGTCAAGAAAGAGTGCTATGAATCAGGCCGAATTTTAATCCTCAGCTCAAATAATATCTTTTTCATTTCTCCAAAGCAATTTGAGGGCTATGAAAATATTGCATGTCTTAACCTCTCAGGAAATGGATTTTCTGCAGCACTTAATGGCACAGAGTTCTCCTCGCTACCTAATCTGACATACCTGGACCTATCATTTAACAAGATTGACCTGGCCTATGACAATGCCTTCAAAGAACTGAAGAAACTTCAAGTACTCGACCTCAGTTACAACCCACATTACTTTCAGTCATATGGGATAACGCACAATTTAAATTTCATAAAAAACCTGCCTGTTCTGAGAGTGCTGAATATGAGTCACAATGCCATTTCCACATCATCAACAAAACAACTGTACAGCCAATCTTTGTCAGAACTTCAGTTTACAAATAACTTTCTTGGAACTCTTTGGAAAGAAAAGGATGTCACATACAAGCAGCTTTTTACTCAACTCACTAATTTGACATATTTAGATATATCCGAAAACCAAATTAAAAAAATTCCAGATGATGTATATCAATATTTTCCCCGTAACCTCACCAAACTATGCATAAGCCATAACTTACTCACTGGTTTTAAATGGGACGCAATGTCATATTTCCATCAACTTCAAGTCTTAGACCTGAGCTTCAATTCTTTATCTGACGTGACGGGTATAAACTTGAGCTTCACTCAGACTTTGACTTTCTTTGACTTGAGCCATAACAAAATTTTCCACCTGGACGATGGATTCATAAAGGGTCCGAAGAGCCTTAGCATTCTCAGTCTTAGCTACAACAAACTCACCACCATCAATCAATCTACCTTCCAGTCCAGACCTGAAAATCAGATTAAGATTTTGCACTTGCAGAATAATCCGTTCCAATGTACCTGTGACTCTATCGATTTCATTCTGTGGATTGAAGCCAGTAAAGTAAAAATCCCAAGACTGACCACTGAAGTGAAATGTGACACGCCAGCAAACCAGAAGGATCACATACTGATATACTTTGATATAAAACCGTGTGTAGATGACAGTAAGGCATTACGGATGTACATCCTCACTACCTCCTTCATTATTGCTTTTATGTTTGTGGCAACTACTGCTCACTTATTTTACTGGGATGCCTCCTATGTGATACACTATATGAAAGCTAAGCTGAAGGGGTACAGTTCCTTGAATTCATCAGACAGCTTTTATGATGTCTTTGTGACTTATGACAACAGAGATCCACATGTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATC

（3）中间片段3的克隆测序：

根据上述所得已知中间片段2序列及NCBI中雀鲷等鱼TLR8序列，再次设计一对引物用于TLR8中间片段3的序列扩增。

正向兼并引物TLR8-F3：5'-CACATGTTGGAYGCACCT-3'(Y＝C／T)

反向特异引物TLR8-R3：5'-GGTATGTCAGATTAGGTAGCG-3'

中间片段3的序列扩增步骤及反应条件同中间片段1。

1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。

中间片段3的克隆测序同本实例步骤（1.4）。

TLR8中间片段3序列如下：

CACATGTTGGATGCCCCTGCTGCTCTGGGTGTGTTTCCATTATGAGGTCCAGCCTGCTGCTAAACCTTTGTGGATGTCGCCAAAGTTCCCGTGTAACGTCACAGCCAATAATGAGTCAGTGGTCAAGTTTGACTGCAGGGGGCGTCATCTGCATAAAGTGCCTTACGGAATAACTAGGAACGTCACTGAGCTCAACTTGTCCGAAAATGTCATTGCAAACATTTCAAGTCAAGCGTTTTCTAATCTGCTGAATCTGACCTCACTCAGTCTGAACTGGGCGAACAAGAACAGAGGTCTGCTCATCAGTGAAAATATCTTCAAAAATCTCACCAAACTGAACCATCTGGGGCTGACTGGAAACGCTCTGAAGAAAATTCCCAGCAATCTCCCTCCCAGTATAGAAATCCTTGAGCTGAACAATAACAAGCTTCAGTTGGACAACATGAATCTATCAGGCTTAACAAACGTGACAAAACTGTGGCTCACCAAAAACTGCTACTCCTGGAATCCTTGTCGAAGAAATTTTACCATTATGAACAACACCTTTGCAGTTATGACCAAGCTGCAGTCTCTGGGTTTGTCATTTAATAATTTAACCCACGTTCCCCATGGATTGCCTCTGTCATTAATGGAATTAGAGCTGAGTTCAAACAAAATACAATACATATCTGACAACGATTTCATTGGGCTGCATAATTTAAAATCTCTAAAAATTCAAGGGAACTGTCCAAGATGTCAAAATGCACCATATCCATGTGTCGCTTGCCAAAATCTTTCTCTTGGCATCCATCCTTACGCATTTCACACTCTGACAGAGYYTGAGACACTGCACCTGGGAGGAAACTCGCTGCAGTTCCTGAATCCCAACTGGTTTAAGAACCTGAAACAAACTGAAAATTTGTTCCTGTCATTTAACTTCTTGCAAAAAGCAATTACTGGGAATGCAACATTTCTAAGTTACCTTCCCAATTTAGAAAAAATCGATCTGTCCTTCAACTTTGCTCTCATGTTATACCCTACAACCATACATCTTTCAAAGGATTTTGCTTATCTCAAATCACTTAGAACTTTGCATATGGAGGCTTTAGTCTTTCAGAATATTGGACCAGACACGCTCAGTCCTCTGTACGAACTCAAAAATCTGTCTGCACTGAATTTAGGGACTAACTTCATTATTCACTCTGATTCTAATGTATTCCGCAGACTGTCGCACGTGAAATTAATATACCTCGCAGATAACAGACTGTATCCCATTCCGGATAAAAGTCCCCCATATCTGAGTGACAAATACAATCAGAGGTCAGACTTTTCCATTTCACCGAACATAAAATCCCATAAAGACTCTGATTTAGAGGAATCACACACCTTTGTCAAGAAAGAGTGCTATGAATCAGGCCGAATTTTAATCCTCAGCTCAAATAATATCTTTTTCATTTCTCCAAAGCAATTTGAGGGCTATGAAAATATTGCATGTCTTAACCTCTCAGGAAATGGATTTTCTGCAGCACTTAATGGCACAGAGTTCTCCTCGCTACCTAATCTGACATACC

实施例4：

3’端的克隆测序：

(1)引物设计：

根据得到的TLR8中间序列，使用Primer5引物设计软件，设计并合成两个特异性正向引物，以及反向接头引物用于3'端巢式PCR。

反转录接头引物：

3-Ap：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈-3'

巢式PCR正向特异性引物：

TLR8.3-F1：5'-ATCCTCACTACCTCCTTCATTATTG-3'

TLR8.3-F2：5'-GTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATC-3'

巢式PCR反向接头引物

TLR8.3-R1：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3'

TLR8.3-R2：5'-GCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'

(2)PCR扩增：

以实施例2所述纯化的牙鲆脾脏总RNA为模板，以3-Ap：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢式PCR扩增的cDNA模板。以TLR8.3-F1和TLR8.3-R1为上下游引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，TLR8.3-F2和TLR8.3-R2为上下游引物进行第二轮PCR扩增。

扩增体系如下表：

PCR循环条件如下表：

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

(3)克隆测序及重组质粒验证：

克隆测序及重组质粒验证参照实施例3所述中间片段的测序方法。

TLR8的3’端序列如下：

GTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATCTGCGGGTGAAACTGGAAGAGGAAGGAGAGAAGCATCTCCCTCTGTGTCTGGAGGAGAGGGACTGGGTCCCAGGAGTCCCGGTGCTGGACAACCTCACCCACAGCATCCGATACAGTCGCAAGACCCTGTTTGTCTTAACGGAGGGCTACGTTAAGACCGGGATTTTCAAGCTTGCGATGTATCTGGCCCACCAACGACTACTGGATGAAAATGTGGACGTGATTGTGCTGCTGATGCTTGAGCCTGTCCTGCAGCACTCACAGTTCCTGCGCCTCAGGAGGAGGCTGTGCGGGAAAAGTGTTGTGGAGTGGCCGAGAACAGCGGCCGCGGAGCCCTGGTTCTGGGTAAACCTGAGGAATGTCGTCAGGGTGGACAATCAAGTTATGTACAACAAGACTTATTCAAAGTACCTAACCAGCAGATGAAGCAGGATAAACCTCATGACTGTCTGGGAACATTTTATAAATTCAAGATGTGAACAAATACCTTCTTTAGAAACCACTGCTCTACAGCAATACTGATTTTGGTCGTCCACAACTTATATCACTATGCCTGGGACTTCAAACAAGATAACTAAATGCATGATCTATTGAGTTTTGTTTATACGTGTGCAATGGTACTGAATCTCTTGTAACTTGTGTGTAAATATGAATGCATGTGAATAAATTAAATCCACCAATCAATTAATACAATTTAAAAATGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

实施例5：

5’端的克隆测序：

(1)引物设计：

根据得到的TLR8中间片段序列，使用Primer5引物设计软件，设计三个特异性反向引物，其中一个作为特异性反转录引物用于反转录，其余两个用于5'端巢式PCR。

TLR8.5-R：5'-TAATGACAGAGGCAATCC-3'

TLR8.5-R1：5'-GGAGTAGCAGTTTTTGGTGAGCCACAGTTTTGTC-3'

TLR8.5-R2：5'-TGAAGCTTGTTATTGTTCAGCTCAAGGATTTC-3'

正向引物为通用接头引物：

TLR8.5-F1：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGG-3'

TLR8.5-F2：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

(2)cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以特异性反向引物TLR8.5-R为反转录引物，进行反转录合成cDNA第一链，反转录产物使用RNaseH消化残余RNA，并用末端转移酶在3'端添加poly(C)尾巴，得到5’端的cDNA第一链。

(3)PCR扩增：

首先以通用性正向引物TLR8.5-F1和特异性反向引物TLR8.5-R1为引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以通用性正向引物TLR8.5-F2和特异性反向引物TLR8.5-R2为引物进行第二轮PCR扩增。

扩增体系如下表：

PCR循环条件如下表：

95℃5分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃1分30秒；第一轮反应20个循环，第二轮反应35个循环；72℃10分钟。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。

(4)克隆测序及重组质粒验证：

克隆测序及重组质粒验证参照实施例3所述中间片段的测序方法。

TLR8的5’端序列如下：

GTTGCTTTTGTTTGACGTTAGCAACAGGTTTTTTTCTTTTTGTTGTATCTATTGTATATCAAAAATGAAGAAAACTGAGATTAAATGGGCTATTTTACTCTGCAGTGACTTTACGATGCACATGACAGGCATAGTTTTTTCAGTTGGTTCATTTTGAATTCTACCTGAAAGATTGCAAAGACTCCTGTTTCATGGTTGTTGTTTGAGGATCGTGAAGGATCAATACCATACATGCGCGATGACTGCCACATGTTGGATGCCCCTGCTGCTCTGGGTGTGTTTCCATTATGAGGTCCAGCCTGCTGCTAAACCTTTGTGGATGTCGCCAAAGTTCCCGTGTAACGTCACAGCCAATAATGAGTCAGTGGTCAAGTTTGACTGCAGGGGGCGTCATCTGCATAAAGTGCCTTACGGAATAACTAGGAACGTCACTGAGCTCAACTTGTCCGAAAATGTCATTGCAAACATTTCAAGTCAAGCGTTTTCTAATCTGCTGAATCTGACCTCACTCAGTCTGAACTGGGCGAACAAGAACAGAGGTCTGCTCATCAGTGAAAATATCTTCAAAAATCTCACCAAACTGAACCATCTGGGGCTGACTGGAAACGCTCTGAAGAAAATTCCCAGCAATCTCCCTCCCAGTATAGAAATCCTTGAGCTGAACAATAACAAGCTTCA

实施例6：

TLR8全长表达序列：

将上述实施例2、实施例3、实施例4中所得到的中间片段序列、3’端序列、5’端序列使用DNAStar软件包中的SeqMan软件组装获得TLR8基因全长cDNA序列数据，如SEQIDNO.1所述。

GTTGCTTTTGTTTGACGTTAGCAACAGGTTTTTTTCTTTTTGTTGTATCTATTGTATATCAAAAATGAAGAAAACTGAGATTAAATGGGCTATTTTACTCTGCAGTGACTTTACGATGCACATGACAGGCATAGTTTTTTCAGTTGGTTCATTTTGAATTCTACCTGAAAGATTGCAAAGACTCCTGTTTCATGGTTGTTGTTTGAGGATCGTGAAGGATCAATACCATACATGCGCGATGACTGCCACATGTTGGATGCCCCTGCTGCTCTGGGTGTGTTTCCATTATGAGGTCCAGCCTGCTGCTAAACCTTTGTGGATGTCGCCAAAGTTCCCGTGTAACGTCACAGCCAATAATGAGTCAGTGGTCAAGTTTGACTGCAGGGGGCGTCATCTGCATAAAGTGCCTTACGGAATAACTAGGAACGTCACTGAGCTCAACTTGTCCGAAAATGTCATTGCAAACATTTCAAGTCAAGCGTTTTCTAATCTGCTGAATCTGACCTCACTCAGTCTGAACTGGGCGAACAAGAACAGAGGTCTGCTCATCAGTGAAAATATCTTCAAAAATCTCACCAAACTGAACCATCTGGGGCTGACTGGAAACGCTCTGAAGAAAATTCCCAGCAATCTCCCTCCCAGTATAGAAATCCTTGAGCTGAACAATAACAAGCTTCAGTTGGACAACATGAATCTATCAGGCTTAACAAACGTGACAAAACTGTGGCTCACCAAAAACTGCTACTCCTGGAATCCTTGTCGAAGAAATTTTACCATTATGAACAACACCTTTGCAGTTATGACCAAGCTGCAGTCTCTGGGTTTGTCATTTAATAATTTAACCCACGTTCCCCATGGATTGCCTCTGTCATTAATGGAATTAGAGCTGAGTTCAAACAAAATACAATACATATCTGACAACGATTTCATTGGGCTGCATAATTTAAAATCTCTAAAAATTCAAGGGAACTGTCCAAGATGTCAAAATGCACCATATCCATGTGTCGCTTGCCAAAATCTTTCTCTTGGCATCCATCCTTACGCATTTCACACTCTGACAGAGYYTGAGACACTGCACCTGGGAGGAAACTCGCTGCAGTTCCTGAATCCCAACTGGTTTAAGAACCTGAAACAAACTGAAAATTTGTTCCTGTCATTTAACTTCTTGCAAAAAGCAATTACTGGGAATGCAACATTTCTAAGTTACCTTCCCAATTTAGAAAAAATCGATCTGTCCTTCAACTTTGCTCTCATGTTATACCCTACAACCATACATCTTTCAAAGGATTTTGCTTATCTCAAATCACTTAGAACTTTGCATATGGAGGCTTTAGTCTTTCAGAATATTGGACCAGACACGCTCAGTCCTCTGTACGAACTCAAAAATCTGTCTGCACTGAATTTAGGGACTAACTTCATTATTCACTCTGATTCTAATGTATTCCGCAGACTGTCGCACGTGAAATTAATATACCTCGCAGATAACAGACTGTATCCCATTCCGGATAAAAGTCCCCCATATCTGAGTGACAAATACAATCAGAGGTCAGACTTTTCCATTTCACCGAACATAAAATCCCATAAAGACTCTGATTTAGAGGAATCACACACCTTTGTCAAGAAAGAGTGCTATGAATCAGGCCGAATTTTAATCCTCAGCTCAAATAATATCTTTTTCATTTCTCCAAAGCAATTTGAGGGCTATGAAAATATTGCATGTCTTAACCTCTCAGGAAATGGATTTTCTGCAGCACTTAATGGCACAGAGTTCTCCTCGCTACCTAATCTGACATACCTGGACCTATCATTTAACAAGATTGACCTGGCCTATGACAATGCCTTCAAAGAACTGAAGAAACTTCAAGTACTCGACCTCAGTTACAACCCACATTACTTTCAGTCATATGGGATAACGCACAATTTAAATTTCATAAAAAACCTGCCTGTTCTGAGAGTGCTGAATATGAGTCACAATGCCATTTCCACATCATCAACAAAACAACTGTACAGCCAATCTTTGTCAGAACTTCAGTTTACAAATAACTTTCTTGGAACTCTTTGGAAAGAAAAGGATGTCACATACAAGCAGCTTTTTACTCAACTCACTAATTTGACATATTTAGATATATCCGAAAACCAAATTAAAAAAATTCCAGATGATGTATATCAATATTTTCCCCGTAACCTCACCAAACTATGCATAAGCCATAACTTACTCACTGGTTTTAAATGGGACGCAATGTCATATTTCCATCAACTTCAAGTCTTAGACCTGAGCTTCAATTCTTTATCTGACGTGACGGGTATAAACTTGAGCTTCACTCAGACTTTGACTTTCTTTGACTTGAGCCATAACAAAATTTTCCACCTGGACGATGGATTCATAAAGGGTCCGAAGAGCCTTAGCATTCTCAGTCTTAGCTACAACAAACTCACCACCATCAATCAATCTACCTTCCAGTCCAGACCTGAAAATCAGATTAAGATTTTGCACTTGCAGAATAATCCGTTCCAATGTACCTGTGACTCTATCGATTTCATTCTGTGGATTGAAGCCAGTAAAGTAAAAATCCCAAGACTGACCACTGAAGTGAAATGTGACACGCCAGCAAACCAGAAGGATCACATACTGATATACTTTGATATAAAACCGTGTGTAGATGACAGTAAGGCATTACGGATGTACATCCTCACTACCTCCTTCATTATTGCTTTTATGTTTGTGGCAACTACTGCTCACTTATTTTACTGGGATGCCTCCTATGTGATACACTATATGAAAGCTAAGCTGAAGGGGTACAGTTCCTTGAATTCATCAGACAGCTTTTATGATGTCTTTGTGACTTATGACAACAGAGATCCACATGTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATCTGCGGGTGAAACTGGAAGAGGAAGGAGAGAAGCATCTCCCTCTGTGTCTGGAGGAGAGGGACTGGGTCCCAGGAGTCCCGGTGCTGGACAACCTCACCCACAGCATCCGATACAGTCGCAAGACCCTGTTTGTCTTAACGGAGGGCTACGTTAAGACCGGGATTTTCAAGCTTGCGATGTATCTGGCCCACCAACGACTACTGGATGAAAATGTGGACGTGATTGTGCTGCTGATGCTTGAGCCTGTCCTGCAGCACTCACAGTTCCTGCGCCTCAGGAGGAGGCTGTGCGGGAAAAGTGTTGTGGAGTGGCCGAGAACAGCGGCCGCGGAGCCCTGGTTCTGGGTAAACCTGAGGAATGTCGTCAGGGTGGACAATCAAGTTATGTACAACAAGACTTATTCAAAGTACCTAACCAGCAGATGAAGCAGGATAAACCTCATGACTGTCTGGGAACATTTTATAAATTCAAGATGTGAACAAATACCTTCTTTAGAAACCACTGCTCTACAGCAATACTGATTTTGGTCGTCCACAACTTATATCACTATGCCTGGGACTTCAAACAAGATAACTAAATGCATGATCTATTGAGTTTTGTTTATACGTGTGCAATGGTACTGAATCTCTTGTAACTTGTGTGTAAATATGAATGCATGTGAATAAATTAAATCCACCAATCAATTAATACAATTTAAAAATGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

使用DNAStar软件包中的EditSeq软件编辑得到的TLR8基因全长cDNA寻找开放阅读框，翻译成氨基酸序列，如SEQIDNO.2所述。TLR8基因编码的蛋白质，分子量为117.8KDa，等电点为8.68。

TLR8基因cDNA全长3614bp，含有3078bp的开放阅读框，编码1024个氨基酸，SignalP4.1Server检测出前21个氨基酸序列为信号肽序列。TLR8基因的起始密码子上游有一个终止密码子TAA，距polyA尾38个碱基位置存在加尾信号AATAAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为TLR8基因的全长cDNA序列。

应用实例：

采用TLR8基因序列的实时荧光RT-PCR检测：

(1)引物设计：

根据SEQIDNO1所述TLR8的全长序列，使用Primer5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：

TLR8-q-F：5'-AGTTTCACCCGCAGATTG-3'

TLR8-q-R：5'-CTGGGATGCCTCCTATGT-3'

TLR8的PCR产物预计长度为156bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。

同时，根据NCBI里提供的牙鲆β-actin的cds序列(EU090804)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：

β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3'

β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'

β-actin的PCR产物预计长度为150bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。

(2)牙鲆免疫刺激实验：近期未施用过疫苗的健康牙鲆（体长8-10cm）50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射Poly(I:C)模拟RNA病毒200μg，继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离脾脏组织。

(3)总RNA提取与纯化：同实施例2。

(4)cDNA第一链合成：cDNA第一链的合成采用上海生工的Protocol-BS249&BS250MMLVFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的随机六合引物或Oligo(dT)18引物，以牙鲆脾脏总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL。

(5)实时荧光PCR：实时荧光PCR采用Promega?公司的GoTaq?qPCRMasterMix试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述（1）中TLR8-q-F和TLR8-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

实时荧光PCR扩增参数按照Promega?公司GoTaq?qPCRMasterMix说明书中针对ABI7500型荧光PCR仪推荐的方法设置如下：

95℃2min；

95℃3s；55℃30s；(40个循环)；

(6)免疫牙鲆的脾脏组织中TLR8基因的相对表达量计算：

实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算牙鲆病源感染各时间段下的△Ct、△△Ct，及2^-(ΔΔCt)值，计算方式如下：

△Ct=Ct—Ct内对照（β-actin）

△△Ct=△Ct—△Ct（未免疫的健康牙鲆）

以2^-(ΔΔCt)数值表示免疫刺激牙鲆脾脏中TLR8基因相对于未免疫牙鲆的表达倍数。

图8为Poly(I:C)腹腔注射牙鲆后脾脏组织TLR8基因的相对表达量，从图中看出Poly(I:C)模拟病毒在注射后3小时内，提高了牙鲆TLR8基因的表达量，在实验所检测的时间点中1h时表达量最大，约是0h表达量的5倍，之后，TLR8表达量降低，并低于0h的表达量。牙鲆脾脏TLR8基因表达量的改变，暗示我们TLR8参与了牙鲆对Poly(I:C)模拟病毒的免疫应答，这与哺乳动物中TLR8的功能一致。当TLR8基因相对表达量发生改变时，牙鲆可能处于病原感染状态，虽然此时还不能从肉眼观察到牙鲆体表上有任何感染病症。因此TLR8基因表达量在一定程度上反映了牙鲆的免疫系统活度，可以通过监测牙鲆脾脏组织TLR8基因表达量的变化，初步判断牙鲆是否感染病源，提早采取预防治疗措施，避免势态严重发展造成不可挽回的损失。

SEQUENCELISTING

<110>天津师范大学

<120>牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA全长序列及其应用

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>3614

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gttgcttttgtttgacgttagcaacaggtttttttctttttgttgtatctattgtatatc60

aaaaatgaagaaaactgagattaaatgggctattttactctgcagtgactttacgatgca120

catgacaggcatagttttttcagttggttcattttgaattctacctgaaagattgcaaag180

actcctgtttcatggttgttgtttgaggatcgtgaaggatcaataccatacatgcgcgat240

gactgccacatgttggatgcccctgctgctctgggtgtgtttccattatgaggtccagcc300

tgctgctaaacctttgtggatgtcgccaaagttcccgtgtaacgtcacagccaataatga360

gtcagtggtcaagtttgactgcagggggcgtcatctgcataaagtgccttacggaataac420

taggaacgtcactgagctcaacttgtccgaaaatgtcattgcaaacatttcaagtcaagc480

gttttctaatctgctgaatctgacctcactcagtctgaactgggcgaacaagaacagagg540

tctgctcatcagtgaaaatatcttcaaaaatctcaccaaactgaaccatctggggctgac600

tggaaacgctctgaagaaaattcccagcaatctccctcccagtatagaaatccttgagct660

gaacaataacaagcttcagttggacaacatgaatctatcaggcttaacaaacgtgacaaa720

actgtggctcaccaaaaactgctactcctggaatccttgtcgaagaaattttaccattat780

gaacaacacctttgcagttatgaccaagctgcagtctctgggtttgtcatttaataattt840

aacccacgttccccatggattgcctctgtcattaatggaattagagctgagttcaaacaa900

aatacaatacatatctgacaacgatttcattgggctgcataatttaaaatctctaaaaat960

tcaagggaactgtccaagatgtcaaaatgcaccatatccatgtgtcgcttgccaaaatct1020

ttctcttggcatccatccttacgcatttcacactctgacagagyytgagacactgcacct1080

gggaggaaactcgctgcagttcctgaatcccaactggtttaagaacctgaaacaaactga1140

aaatttgttcctgtcatttaacttcttgcaaaaagcaattactgggaatgcaacatttct1200

aagttaccttcccaatttagaaaaaatcgatctgtccttcaactttgctctcatgttata1260

ccctacaaccatacatctttcaaaggattttgcttatctcaaatcacttagaactttgca1320

tatggaggctttagtctttcagaatattggaccagacacgctcagtcctctgtacgaact1380

caaaaatctgtctgcactgaatttagggactaacttcattattcactctgattctaatgt1440

attccgcagactgtcgcacgtgaaattaatatacctcgcagataacagactgtatcccat1500

tccggataaaagtcccccatatctgagtgacaaatacaatcagaggtcagacttttccat1560

ttcaccgaacataaaatcccataaagactctgatttagaggaatcacacacctttgtcaa1620

gaaagagtgctatgaatcaggccgaattttaatcctcagctcaaataatatctttttcat1680

ttctccaaagcaatttgagggctatgaaaatattgcatgtcttaacctctcaggaaatgg1740

attttctgcagcacttaatggcacagagttctcctcgctacctaatctgacatacctgga1800

cctatcatttaacaagattgacctggcctatgacaatgccttcaaagaactgaagaaact1860

tcaagtactcgacctcagttacaacccacattactttcagtcatatgggataacgcacaa1920

tttaaatttcataaaaaacctgcctgttctgagagtgctgaatatgagtcacaatgccat1980

ttccacatcatcaacaaaacaactgtacagccaatctttgtcagaacttcagtttacaaa2040

taactttcttggaactctttggaaagaaaaggatgtcacatacaagcagctttttactca2100

actcactaatttgacatatttagatatatccgaaaaccaaattaaaaaaattccagatga2160

tgtatatcaatattttccccgtaacctcaccaaactatgcataagccataacttactcac2220

tggttttaaatgggacgcaatgtcatatttccatcaacttcaagtcttagacctgagctt2280

caattctttatctgacgtgacgggtataaacttgagcttcactcagactttgactttctt2340

tgacttgagccataacaaaattttccacctggacgatggattcataaagggtccgaagag2400

ccttagcattctcagtcttagctacaacaaactcaccaccatcaatcaatctaccttcca2460

gtccagacctgaaaatcagattaagattttgcacttgcagaataatccgttccaatgtac2520

ctgtgactctatcgatttcattctgtggattgaagccagtaaagtaaaaatcccaagact2580

gaccactgaagtgaaatgtgacacgccagcaaaccagaaggatcacatactgatatactt2640

tgatataaaaccgtgtgtagatgacagtaaggcattacggatgtacatcctcactacctc2700

cttcattattgcttttatgtttgtggcaactactgctcacttattttactgggatgcctc2760

ctatgtgatacactatatgaaagctaagctgaaggggtacagttccttgaattcatcaga2820

cagcttttatgatgtctttgtgacttatgacaacagagatccacatgtctctgagtgggt2880

aatgagcaatctgcgggtgaaactggaagaggaaggagagaagcatctccctctgtgtct2940

ggaggagagggactgggtcccaggagtcccggtgctggacaacctcacccacagcatccg3000

atacagtcgcaagaccctgtttgtcttaacggagggctacgttaagaccgggattttcaa3060

gcttgcgatgtatctggcccaccaacgactactggatgaaaatgtggacgtgattgtgct3120

gctgatgcttgagcctgtcctgcagcactcacagttcctgcgcctcaggaggaggctgtg3180

cgggaaaagtgttgtggagtggccgagaacagcggccgcggagccctggttctgggtaaa3240

cctgaggaatgtcgtcagggtggacaatcaagttatgtacaacaagacttattcaaagta3300

cctaaccagcagatgaagcaggataaacctcatgactgtctgggaacattttataaattc3360

aagatgtgaacaaataccttctttagaaaccactgctctacagcaatactgattttggtc3420

gtccacaacttatatcactatgcctgggacttcaaacaagataactaaatgcatgatcta3480

ttgagttttgtttatacgtgtgcaatggtactgaatctcttgtaacttgtgtgtaaatat3540

gaatgcatgtgaataaattaaatccaccaatcaattaatacaatttaaaaatgtgaaaaa3600

aaaaaaaaaaaaaa3614

<210>2

<211>1024

<212>PRT

<213>牙鲆模式识别受体TLR8的氨基酸序列

<400>2

MetThrAlaThrCysTrpMetProLeuLeuLeuTrpValCysPheHis

151015

TyrGluValGlnProAlaAlaLysProLeuTrpMetSerProLysPhe

202530

ProCysAsnValThrAlaAsnAsnGluSerValValLysPheAspCys

354045

ArgGlyArgHisLeuHisLysValProTyrGlyIleThrArgAsnVal

505560

ThrGluLeuAsnLeuSerGluAsnValIleAlaAsnIleSerSerGln

65707580

AlaPheSerAsnLeuLeuAsnLeuThrSerLeuSerLeuAsnTrpAla

859095

AsnLysAsnArgGlyLeuLeuIleSerGluAsnIlePheLysAsnLeu

100105110

ThrLysLeuAsnHisLeuGlyLeuThrGlyAsnAlaLeuLysLysIle

115120125

ProSerAsnLeuProProSerIleGluIleLeuGluLeuAsnAsnAsn

130135140

LysLeuGlnLeuAspAsnMetAsnLeuSerGlyLeuThrAsnValThr

145150155160

LysLeuTrpLeuThrLysAsnCysTyrSerTrpAsnProCysArgArg

165170175

AsnPheThrIleMetAsnAsnThrPheAlaValMetThrLysLeuGln

180185190

SerLeuGlyLeuSerPheAsnAsnLeuThrHisValProHisGlyLeu

195200205

ProLeuSerLeuMetGluLeuGluLeuSerSerAsnLysIleGlnTyr

210215220

IleSerAspAsnAspPheIleGlyLeuHisAsnLeuLysSerLeuLys

225230235240

IleGlnGlyAsnCysProArgCysGlnAsnAlaProTyrProCysVal

245250255

AlaCysGlnAsnLeuSerLeuGlyIleHisProTyrAlaPheHisThr

260265270

LeuThrGluGluThrLeuHisLeuGlyGlyAsnSerLeuGlnPheLeu

275280285

AsnProAsnTrpPheLysAsnLeuLysGlnThrGluAsnLeuPheLeu

290295300

SerPheAsnPheLeuGlnLysAlaIleThrGlyAsnAlaThrPheLeu

305310315320

SerTyrLeuProAsnLeuGluLysIleAspLeuSerPheAsnPheAla

325330335

LeuMetLeuTyrProThrThrIleHisLeuSerLysAspPheAlaTyr

340345350

LeuLysSerLeuArgThrLeuHisMetGluAlaLeuValPheGlnAsn

355360365

IleGlyProAspThrLeuSerProLeuTyrGluLeuLysAsnLeuSer

370375380

AlaLeuAsnLeuGlyThrAsnPheIleIleHisSerAspSerAsnVal

385390395400

PheArgArgLeuSerHisValLysLeuIleTyrLeuAlaAspAsnArg

405410415

LeuTyrProIleProAspLysSerProProTyrLeuSerAspLysTyr

420425430

AsnGlnArgSerAspPheSerIleSerProAsnIleLysSerHisLys

435440445

AspSerAspLeuGluGluSerHisThrPheValLysLysGluCysTyr

450455460

GluSerGlyArgIleLeuIleLeuSerSerAsnAsnIlePhePheIle

465470475480

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