一种基于Ms30基因建立的玉米雄性不育系保持和繁殖的方法

摘要

本发明公开了一种基于Ms30基因构建的用于恢复、保持和繁殖玉米隐性核雄性不育系的多控不育载体及其应用方法，属于生物技术中的基因工程领域。所述的多控不育载体包括四个功能基因元件：1）玉米雄性不育的育性恢复功能基因；2）抑制玉米的雄配子体形成的功能基因；3）玉米种皮颜色筛选标记功能基因；4）除草剂抗性功能基因元件。将所述构建体导入玉米受体（如细胞、愈伤组织或器官）中，可用于恢复、保持、繁殖ms30对应的玉米雄性不育系。本发明有望应用于玉米新型不育化杂交育种和杂交制种，在玉米生产中具有巨大的应用价值。

说明书

技术领域

一般地，本发明属于分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因Ms30的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。

背景技术

作物杂种优势利用和杂交育种技术是一种提高作物产量和品质、保障国家粮食安全的有效手段。玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，还可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略也存在一些问题：一方面，这些技术大大增加了制种的成本，另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，最终导致很大的经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。

玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上几乎没有被有效地利用起来。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和利用尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。随着现代生物技术的迅速发展，部分玉米核雄性不育材料的不育机理逐渐明确，为分子设计创制稳定的玉米不育系奠定了理论基础。

本发明旨在将隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达元件、抑制雄配子体形成的基因表达元件、荧光蛋白筛选标记基因表达元件和除草剂抗性基因表达元件串联起来，构建高效的玉米多控不育遗传转化载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米雄性不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Ms30基因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体（构建体）及其应用的方法。

本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件（4种不同类型表达盒的元件），这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地（通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性）用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。

本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。

（1）具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。

进一步，上述育性相关基因即玉米Ms30基因。

上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Ms30基因的启动子或组成型表达的Ubiquitin启动子。

5126启动子是玉米花药特异性启动子。

Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maizepolyubigene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。

（2）抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体形成或功能的基因以及终止子。

具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zm13启动子；抑制植物雄配子体形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为In2-1终止子或PinⅡ终止子。

Pg47和Zm13都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的5’调节区(Allen和Lonsdale，PlantJ(1993)3:261-271)。

玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃，从而遏制花粉发育。

Dam甲基化酶基因(Brooksetal.,NucleicAcidsRes(1983)11:837-851)的表达产物能催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化，经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。

终止子为In2-1终止子（玉米In2-1基因的终止子）或PinⅡ终止子（马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子，Anetal.,PlantCell(1989)1:115-122）。

（3）除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。

35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区（Francketal.,Cell(1980)21:285-294）。

（4）颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色荧光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pinⅡ终止子依次串联构成的表达盒。

Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达（Kallaetal.,PlantJ(1994)6:849-860）。

上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）为骨架进行依次构建的。

利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中还包括鉴定玉米保持系种子和植株的方法。

本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将恢复雄性不育玉米育性的多控不育构建体导入目的植物—玉米隐性核不育系中获得的。

上述导入目的植物的方法是通过花粉管或农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。

本发明所述的用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含：(a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因Ms30的纯合隐性等位基因（Ms30Ms30），且所述第一植株是雄性不育的；(b)向上述第一植株中引入权利要求1所述的构建体以获得第二植株，所述第二植株只在同源染色体的其中一条染色体上含有所述构建体，即所述构建体为半合子状态；半合子（hemizygote）指的是具有二组相同的染色体组，但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子。所述第二植株包含与所述第一植株相同的雄性不育基因Ms30的纯合隐性等位基因，当其构建体中的玉米雄性育性控制基因Ms30表达时将恢复第二植株雄性生育力；当抑制植物雄配子体形成或功能的基因（如淀粉酶基因或细胞毒素基因）表达时，所述第二植株抑制产生携带构建体的可育雄性配子的形成或功能，从而使得在所述第二植株中只能产生不包含所述构建体的可育雄性配子，其基因型为Ms30；(c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代种子。

本发明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含：通过权利要求21所述的第二植株自花受精，产生50%的含有所述构建体的种子（即保持系种子）；产生50%的正常不育系种子。

鉴定保持系种子和植株的方法，具体为：将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体（父本），与其它正常育性植株（作为母本）杂交，所获得F1种子全部是正常颜色种子（非荧光种子）。

将所述第二植株自交后产生的种子在荧光显微镜下观察，具有红色荧光的种子即为保持系种子。

种植所述第二植株自交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株与非保持系植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。

附图说明

图1所示为玉米多控不育载体pMCS3001构建流程图。

图2所示为玉米多控不育载体pMCS3001的T-DNA区域图谱；T-DNA的大小为12,660bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。

图3所示为玉米多控不育载体pMCS3001的质粒图谱。

图4所示为玉米多控不育载体pMCS3001的酶切鉴定图；M为1kbplusDNAmarker；1，2，3分别为pMCS3001质粒用HindIII、BamHI和BglII进行酶切。

图5所示为玉米多控不育载体pMCS3002、pMCS3003构建流程图。

图6所示为玉米多控不育载体pMCS3002的T-DNA区域图谱；T-DNA的大小为11,906bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。

图7所示为玉米多控不育载体pMCS3002的质粒图谱。

图8所示为玉米多控不育载体pMCS3002的酶切鉴定图；M为1kbplusDNAmarker；1，2，3分别为pMCS3002质粒用HindIII、EcoRI和XbaI进行酶切。

图9所示为玉米多控不育载体pMCS3003的T-DNA区域图谱；T-DNA的大小为13,474bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），雄性育性恢复基因Ms30的表达盒，以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。

图10所示为玉米多控不育载体pMCS3003的质粒图谱。

图11所示为玉米多控不育载体pMCS3003的酶切鉴定图；M为1kbplusDNAmarker；1，2，3分别为pMCS3003质粒用HindIII、EcoRI和XbaI进行酶切。

图12所示为多控不育载体（pMCS3001,3002,3003）的玉米转化流程和植株的再生。

图13所示为多控不育转基因玉米植株的PCR阳性鉴定；M为DL2000DNAmarker，1至22为不同的转基因植株，P为质粒阳性对照。H₂O为水对照。

图14所示为多控不育转基因玉米植株的RT-PCR检测结果；M为DL2000DNAmarker，1至8样品为随机取样的转基因植株。图A为植株DNA的PCR检测，图B、C为1至8样品的RT-PCR检测，检测基因分别为Bar和玉米actin基因。

图15所示为收获的转基因玉米植株穗子表型；A为转基因株系在正常白光下的穗子表型，B为A在蓝色激发光下的穗子表型。其中，在蓝色激发光下发红色荧光的种子，在正常白光下表皮呈红色；而在蓝色激发光下不发荧光的种子，在正常白光下表皮为黄色（正常的玉米种子颜色）。

图16所示为除草剂涂抹检测玉米多控不育保持系和不育系的表型；Ms30-1（+）为转入了多控不育载体pMCS3001的T-DNA的转基因玉米植株（保持系植株）。Ms30-1（-）为ms30纯合隐性的不含转基因成分的植株（不育系植株）。除草剂涂抹后第5天，Ms30-1（+）植株基本上没有叶子损伤，Ms30-1（-）植株则有明显损伤。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

如无特殊说明，实施例中所用的内切酶等酶试剂购自宝生物（大连）有限公司，引物及基因的合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：多控不育载体pMCS3001、pMCS3002和pMCS3003的构建

1.构建含有4个表达盒的多控不育载体pMCS3001

1)构建含有荧光蛋白标记基因mCherry表达盒（Ltp2:mCherry,SEQIDNO.1）和除草剂抗性基因Bar的表达盒（CaMV35SPRO:Bar,SEQIDNO.2）的中间载体pCLC。

以pMD18-Ltp2为模板扩增Ltp2片段，所用引物为：

oligo01：5’-caaagcttctctagaactagtggatctcgatgtgtag(AAGCTT为HindIII酶切位点)；

oligo02：5’-ctggtcaccagatcttactcggctacactcacac(GGTCACC为BstEII酶切位点，AGATCT为BglII酶切位点)。

pCambia3301是pCambia系列载体之一，含有除草剂抗性基因Bar的表达盒。将以上扩增产物Ltp2片段和pCAMBIA3301质粒用HindIII和BstEII酶切、胶回收后连接得到pCLtp。

质粒pMD18-mCherry含有mCherry基因（由上海英骏生物技术有限公司合成），以此质粒为模板扩增mCherry片段，所用引物为：

oligo03：5’-cggagatctatggtgagcaagggcgaggag(AGATCT为BglII酶切位点)

oligo04：5’-cggagatcttacttgtacagctcgtccatg(AGATCT为BglII酶切位点)

将扩增产物mCherry片段用BglII酶切，质粒pCLtp经BglII酶切后去磷酸化处理，以上产物胶回收后进行连接，得到pCLC载体。

2)中间载体pCLCAA的构建(含有α淀粉酶基因表达盒)

质粒pMA-Pg47-ZmAA含有α淀粉酶基因ZmAA的表达盒（Pg47pro:ZmAA-In2-1，SEQIDNO.3），委托上海英骏生物技术有限公司合成。将质粒pMA-Pg47-ZmAA和pCLC用HindIII和EcoRI酶切，将4.6kb的ZmAA表达盒和pCLC载体片段胶回收后连接，得到pCLCAA。

3)pT5126MsOcs载体的构建(含有育性恢复基因Ms30表达盒5126:Ms30,SEQIDNO.4）

玉米自交系B73是目前广泛应用于玉米遗传研究及育种实践的开放性玉米种质，能够从种子公司直接购买获得。从B73雄穗中提取RNA，反转录PCR扩增Ms30基因，得到1.2Kb的Ms30基因片段。所用引物如下：

Oligo05：5’-CAAAGTTGCTTTGCGATGGCGCTCCTCCTCCTCCTC

Oligo06：5’-TGGCATGCCGGATCCCTAAATAAGAGTGGTCTCCGG

以pCAMBIA2300-Ubi-Ocs为模板扩增Ocs片段，所用引物如下：

Oligo07：5’-TTATTTAGGGATCCGGCATGCCAGGGCTCTCAATGGAG

Oligo08：5’-GAATTCCTAGGTGATCATCAATCAGTAAATTGAACGGA

(GGATCC为EcoRI酶切位点)

将以上得到的Ms30和Ocs的PCR产物各取1ul混合做模板，以引物oligo05和oligo08进行overlapPCR扩增，得到Ms30和Ocs融合的片段Ms30-Ocs。

以B73为材料，用PlantGenDNAKit植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板扩增5126启动子片段，所用引物如下：

Oligo09：5’-gaattcCTAGGATCTTTCTGATTTCAACCATTAC

(GGATCC为EcoRI酶切位点)

oligo10：5’-GGAGGAGCGCCATCGCAAAGCAACTTTGATTTGTG

扩增得到1.5kb的5126片段。

将以上得到的Ms30-Ocs片段和5126片段的PCR产物各取1ul混合做模板，以引物oligo13和oligo16进行overlapPCR扩增，得到融合的片段5126-Ms30-Ocs。将该片段进行进行胶回收后连接到pEASY-T5载体，得到pT5126Ms30Ocs。

4)构建pMCS3001载体

用EcoRI酶切步骤2得到的质粒pCLCAA，酶切产物再经去磷酸化处理；将步骤4得到的pT5126Ms30Ocs用EcoRI酶切。以上两种产物分别胶回收，连接获得重组载体pMCS3001，经酶切和测序验证正确。pMCS3001载体的专利保藏号为CGMCCNo.10448，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）；保藏日期：2015年1月27日。

pMCS3001包含4个表达盒，如图2所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒，抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒），以及颜色标记基因mCherry的表达盒。pMCS3001载体图谱见图3。

2.构建含有4个表达盒的多控不育载体pMCS3002

1)构建含有花粉致死基因ZmAA表达盒的重组载体pCZmAA

以质粒pMA-Pg47-ZmAA为模板扩增ZmAA的表达盒，得到片段Pg47PRO:ZmAA-In2-1。PCR引物为：

Oligo11：5’-cccaagctttgcaccggacactgtctggtg(AAGCTT为HindIII酶切位点)；

Oligo12：5’-ccgaattccgtggagatataggggaaagagaacg(gaattc为EcoRI酶切位点)。

将上述花粉致死基因ZmAA表达盒与pCambia3301载体的骨架相连：用HindIII和EcoRI双酶切Pg47-BT1-ZmAA-In2-1片段和pCAMBIA3301载体后，将ZmAA表达盒连入pCAMBIA3301大片段中，获得载体命名为pCZmAA。

2)构建含有育性恢复基因Ms30表达盒（Ubiquitin:Ms30-Ocs,SEQIDNO.5）的重组载体pTUMs30

从玉米B73雄穗cDNA中PCR扩增Ms30基因，得到1.2Kb的Ms30的ORF片段。所用引物如下：

Oligo13：5’-cgcggtaccATGGCGCTCCTCCTCCTCCTCG(GGTACC为KpnI酶切位点)

Oligo14：5’-gccggatccCTAAATAAGAGTGGTCTCCGG(GGATCC为BamHI酶切位点)

pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体含有Ubiquitin启动子和Ocs终止子，在Ubiquitin启动子后含多克隆位点，载体的骨架是pCAMBIA系列的pCAMBIA2300（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）。pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体由发明人所在公司实验室保存。用KpnI和BamHI双酶切Ms30片段和pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体。将Ms30片段连入pCAMBIA2300-Ubi-Ocs酶切片段中，获得pCUMs30。

以pCUMs30为模板扩增Ubi-Ms30-Ocs片段，所用引物为:

Oligo15：5’-aagcttaattagcttgcatgcctgcagtg(AAGCTT为HindIII酶切位点)

Oligo16:5’-gGtcaccctgcagtgatcatcaatcagtaaattGAAcg

gagAATATTA(GGTCACC为BstEII酶切位点，TGATCA为BclI酶切位点)

将以上扩增片段Ubi-Ms30-Ocs连入T载体pEASYT3中，获得载体命名为pTUMs30。

3)构建荧光标记基因表达盒（Ltp2:DsRed2-Nos,SEQIDNO.6）载体pT-LD

pMD18-Ltp2含有Ltp2启动子，Ltp2的5’端和3’端分别含有BclI和XhoI酶切位点。DsRed2-FL-19T含有DsRed2基因。pMD18-Ltp2和DsRed2-FL-19T均委托上海英骏生物技术有限公司合成。以DsRed2-FL-19T载体为模板扩增DsRed2片段，所用引物为：

oligo17：5’-gtgatcacatctcgagatggcctcctccgagaacgtc(TGATCA为BclI酶切位点、CTCGAG为XhoI酶切位点)；

oligo18：5’-gggtcaccctacaggaacaggtggtggc(GGTCACC为BstEII酶切位点)。

将以上扩增片段DsRed2连入T载体pEASYT3中，获得pTDsRed2。

用BclI和XhoI双酶切pMD18-Ltp2和pTDsRed2载体，胶回收后将Ltp2片段连入pTDsRed2片段中，获得含有荧光标记基因表达盒的载体pT-LD。

4)构建pMCS3002载体

用BclI和BstEII双酶切上述获得的中间载体pTUMs30和pT-LD，胶回收Ltp2-DsRed2片段和pTUMs30片段，将Ltp2-DsRed2片段连入pTUMs30，获得pTUMs30-LD。

用HindIII和BstEII双酶切pCZmAA和pTUMs30-LD，将Ubi-Ms30-Ocs-Ltp2-DsRed2片段连入pCZmAA大片段中，获得的载体命名为pMCS3002，经酶切和测序验证正确。pMCS3002载体的专利保藏号为CGMCCNo.10449，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）；保藏日期：2015年1月27日。

pMCS3002载体包含4个表达盒，如图6所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。pMCS3002载体图谱如图7所示。

3.构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS3003

用HindIII酶切上述的pMCS3002载体，并进行去磷酸化处理。载体pMD18-Dam含有Dam表达盒(Dam基因表达盒Zm13:Dam,SEQIDNO.7），将该载体用HindIII酶切后得到Dam表达盒片段。将以上pMCS3002载体酶切片段和Dam表达盒片段分别胶回收后进行连接，获得的载体命名为pMCS3003，经酶切和测序验证正确。pMCS3003载体的专利保藏号为CGMCCNo.10450，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）；保藏日期：2015年1月27日。

pMCS3003载体包含5个表达盒，如图9所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒和Dam表达盒，雄性育性恢复基因Ms30的表达盒以及颜色标记基因DsRed2的表达盒。pMCS3003载体图谱如图10所示。

实施例2：玉米多控不育载体pMCS03001、pMCS3002和pMCS3003的应用

1.玉米多控不育载体转化农杆菌

参照AN（MethodsinEnzymology(1987)153:292-305）方法，将本发明所构建的多控不育载体pMCS3001、pMCS3002和pMCS3003转化到农杆菌EHA105（Hoodetal.,TransgenicRes(1993)2:208-218）中。

取1~2μg质粒，加到100μL于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷冻1分钟，移入37℃水浴中5min；迅速冰浴2min后将加入1000μLYEB液体培养基，于28℃，转速为200rpm条件下培养2~4hr，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的固体YEB平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。用限制性内切酶酶切质粒验证，如图4、7和图11所示，酶切结果表明玉米多控不育载体pMCS3001、pMCS3002和pMCS3003都正常转化进入农杆菌中。

2.多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生

将ms30突变体（ms30ms30）纯合的雄性不育植株与来自玉米HiⅡ植株的花粉杂交、回交数代之后，该ms30等位基因渐渐渗入易于转化的HiⅡ玉米种质。

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的上述具有玉米Ms30ms30杂合等位基因的玉米HiⅡ的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，以将实施例1构建的多控不育载体pMCS3001中的T-DNA（包含4个表达盒）、pMCS3002中的T-DNA（包含4个表达盒）或pMCS3003中的T-DNA（包含5个表达盒）转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。

农杆菌侵染玉米幼胚转化流程如下：

取授粉后9~11天的玉米幼穗，剥去苞叶，表面消毒后剥取幼胚，从玉米中分离幼胚（见图12-1），用农杆菌悬浮液侵染幼胚（见图12-2），其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚细胞（步骤1：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.4~0.6，侵染培养基（N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L，pH5.2））中以启动接种。幼胚在侵染步骤后在固体培养基（N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上与农杆菌共培养（见图12-3）3天（步骤2：共培养步骤）。在此共培养阶段后，有一个选择性的“恢复”步骤（步骤3：恢复步骤）。在该步骤中，恢复培养基（N6盐2g/L、N6维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）中含有抑制农杆菌生长的抗生素（羧苄青霉素500mg/L），以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂（2.5mg/L双丙氨膦）的筛选固体培养基（N6盐4g/L、N6维生素、L-脯氨酸1.38g、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长（步骤4：选择步骤）（见图12-4）。然后，抗性愈伤组织转到再生培养基I（N6盐4g/L、N6维生素、L-脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、琼脂7g/L，双丙氨膦1.5mg/L，pH5.8），25℃暗培养2-3周。在此阶段出现胚芽鞘（见图12-5）。在固体培养基（MS分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物（步骤5：再生步骤）（见图12-6）。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4.3g/L、MS维生素、麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、天冬酰胺0.15g/L、肌醇100mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维生素、蔗糖20g/L、萘乙酸0.5mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实（见图12-7和12-8）。在温室中，每天于28℃下光照培养16小时，再于20℃下黑暗培养8小时。

3.转基因玉米植株的PCR阳性鉴定

取温室培养的转化阳性候选玉米植株的叶片，用PlantGenDNAKit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用质粒载体特异引物Bar基因引物进行PCR鉴定，同时以非转基因玉米DNA作为阴性对照，以多控不育载体质粒作为阳性对照。

Bar基因引物序列如下：

Oligo19(Bar-F)：5’-ctcgagtctaccatgagcccagaac

Oligo20(Bar-R)：5’-ctcgagtcaaatctcggtgacgggca

图13为部分转基因植株的PCR鉴定。从图13可以看出，在检测的转多控不育载体的22株转基因候选株中，有11株是转化阳性植株。

4.转基因植株在RNA水平的鉴定

随机挑取8株温室培养的转化多控不育载体的阳性候选植株分别提取DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。用上述Bar基因引物对DNA和cDNA分别进行PCR扩增。玉米actin基因作为内标参照基因，引物序列如下：

Oligo21(Actin-F)：5’-AAATGACGCAGATTATGTTTGA

Oligo22(Actin-R)：5’-GCTCGTAGTGAGGGAGTACC

检测结果表明随机检测的8株植株，其基因组DNA和RNA水平上的阳性结果一致（图14-A、B），表明在DNA水平检测阳性的植株都有除草剂抗性基因的表达。

5.RealtimePCR验证转基因玉米植株

取上述DNA水平和RNA水平检测为阳性的转基因玉米植株Ms30（T₀）的叶片约100mg作为样品，用PlantGenDNAKit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Bar基因和IVR基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测BAR基因和IVR基因拷贝数的具体方法如下：

取转基因玉米植株Ms30（T0）和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

使用PlantGenDNAKit植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

用QuawellQ5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA浓度；

调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测BAR基因序列：

Oligo23：5’-TCACTCGGGATGACGATGG；

Oligo24：5’-TGCCACCAGACAGTGTCCG；

Probe1：5’-ccgagccgcaggaaccgcaggag（荧光基团5’6-FAM;淬灭基团3’TAMRA）；

以下引物和探针用来检测IVR基因序列：

Oligo25：5’-TGGCGGACGACGACTTGT；

Oligo26：5’-AAAGTTTGGAGGCTGCCGT；

Probe2：5’-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC（荧光基团5’CY5;淬灭基团3’BHQ-2）；

PCR反应体系为：25μl2×GoldStarTaqManMixture（WithROX）；1μlForwardPrimer，10μM（终浓度0.2μM）；1μlReversePrimer，10μM（终浓度0.2μM）；1μlProbe，10μM；2μlTemplateDNA，最终利用不含任何RNase的水稀释到50μl。

PCR反应条件为：步骤1：预变性，温度95℃，时间10min；步骤2：变性，温度95℃，时间15s；步骤3：退火/延伸，温度60℃，时间1min；重复上述40个循环。

利用SDS2.3软件（AppliedBiosystems）分析数据。

实验结果表明，所述介导植物生育力的构建体（包含完整的T-DNA区）己经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且获得了具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株Ms30-1（转化pMCS3001）、Ms30-2（转化pMCS3002）和转基因玉米植株Ms30-3（转化pMCS3003）。

6.玉米雄性不育保持系和不育系的鉴定和繁殖

使所述转基因玉米植株Ms30-1（T₀）自交，收获自交T₁种子Ms30-1（T₁）。如图12-8所示，50%的所述自交T₁种子Ms30-1（T₁）表皮为红色，在荧光下观察呈现红色荧光（见图15），所述红色荧光种子标记为Ms30-1（+）；另50%的所述自交T₁种子Ms30-1（T₁）表皮为黄色或乳白色，荧光下观察无红色荧光，所述无红色荧光种子标记为Ms30-1（-）。

种植上述Ms30-1（+）和Ms30-1（-）种子直至长到3叶期，用0.1mg/L的除草剂Basta涂抹所述Ms30-1（+）和Ms30-1（-）植株叶片，根据除草剂处理后第5天观察到的叶子损伤情况来确定植株是否损伤。实验表明，所述Ms30-1（+）植株基本上没有显示出叶子损伤，所述Ms30-1（-）植株则有明显的叶子损伤（见图16）。

上述荧光观察结果和除草剂抗性结果表明所述介导植物生育力构建体以预计频率传递给了后代，即Ms30-1（+）为包含所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株（保持系植株）。Ms30-1（-）为Ms30纯合隐性的不含所述构建体的植株（不育系植株）。

7.转基因植株花粉育性的分析

为确定转基因植株中抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒的表达效果，我们对具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株植株（图15）加以评估，以该转基因植株做父本，非转基因玉米对照植株HiⅡ-A做母本进行测交分析。11.6万粒杂交的种子在荧光显微镜下观察，没有发现具有红色荧光的种子。表明所授的花粉是不含转基因成分的，这也说明所述表达盒已起到抑制雄配子细胞正常发育的作用。

相关参考文献

1.Allen,R.L.andLonsdale,D.M.(1993).Molecularcharacterizationofoneofthemaizepolygalacturonasegenefamilymemberswhichareexpressedduringlatepollendevelopment.PlantJ.3,261-271.

2.Brooks,J.E.,R.M.Blumenthal,andT.R.Gingeras.(1983).TheisolationandcharacterizationoftheEscherichiacoliDNAadeninemethylase(dam)gene.NucleicAcidsRes.11,837-851.

3.An,G.,Mitra,A.,Choi,H.K.,Costa,M.A.,An,K.,Ryan,C.A.,(1989),Functionalanalysisofthe3′controlregionofthepotatowound-inducibleproteinaseinhibitorIIgene.PlantCell1,115-122.

4.FranckA,GuilleyH,JonardG,RichardsK,HirthL.(1980).NucleotidesequenceofcauliflowermosaicvirusDNA.Cell21,285-294.

5.Kalla,R.,Shimamoto,K.,Potter,R.,Nielsen,P.S.,Linnestad,C.,andOlsen,O.A.(1994).Thepromoterofthebarleyaleurone-specificgeneencodingaputative7kDalipidtransferproteinconfersaleuronecell-specificexpressionintransgenicrice.PlantJ.6,849-860.

6.An,G.(1987).BinaryTivectorsforplanttransformationandpromoteranalysis.MethEnzymol.153,29-305.

7.Hood,E.E.,Gelvin,S.B.,Melchers,S.,Hoekema,A.(1993).NewAgrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.TransgenicResearch2:208-218.

SEQUENCELISTING

<110>北京首佳利华科技有限公司

<120>一种基于Ms30基因建立的玉米雄性不育系保持和繁殖的方法

<130>2015

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<210>4

<211>2976

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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