可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对GLUD1基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ？ID？NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对女性人群2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以GLUD1基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒。

背景技术

糖尿病(diabetesmellitus)是一种慢性代谢性疾病，是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其患病率随着生活条件的改善生活水平提高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9.7%。糖尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2型糖尿病发病人数约占糖尿病总发病人数的97%。截至目前尽管能从遗传的角度证实不同基因的表达能引起个体对2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)的易感性不同，相关候选基因的单核苷酸多态性与T2DM的发生也具有关联性，然而遗传因素和环境因素等病因对T2DM发病机制仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了T2D预防及治疗水平的提高。

GLUD1(glutamatedehydrogenase1)基因位于人类染色体10q23.3能够编码谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase,GDH)，该蛋白在线粒体中以六聚体形式存在。GDH在脑组织星形胶质细胞中高表达，用于清除和代谢神经组织释放的谷氨酸；GDH在肝脏和肾脏的氨代谢和解毒作用中也发挥了重要作用；GDH在胰岛β细胞中是引起胰岛素分泌的关键酶，其作用是催化谷氨酰胺生成信号分子谷氨酸，从而激发胰岛素的分泌。国内外的研究表明通过抑制胰岛β细胞GDH的活性或利用敲除了β细胞特异GDH的转基因小鼠βGlud1-/-作为动物模型进行研究，结果发现GDH被抑制或缺失都会导致胰岛素的分泌减少。目前，国内外还没有公开任何关于检测2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中GLUD1基因甲基化水平与女性人群2型糖尿病患病率呈负相关，检测效率高，针对性强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括GLUD1基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中

所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：

5’-GTTGAAAGGGATAATAAAAGT-3’，

所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：

5’-Biotin-CACCCTAACCTATCCTCTAA-3’，

所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：

5’-GTTAGTTAAGTATAATTTAAT-3’。

上述可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。

上述可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于女性人群2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含一对GLUD1基因启动子区的甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，外周血中GLUD1基因启动子区低甲基化水平导致GLUD1基因的高表达，影响了GDH活性，参与了胰岛素的分泌，从而影响2型糖尿病的发生和发展。因此，GLUD1基因启动子区甲基化水平与2型糖尿病的患病率呈负相关，通过检测GLUD1基因启动子区甲基化程度辅助诊断糖尿病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于的糖尿病的早期预防、早发现和及时治疗。

综上所述，以GLUD1基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，同时，以GLUD1基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

附图说明

图1为GLUD1基因被检测序列所在区域（具体位置为Chr10:88855256-88855448）及所检测的5个CpG点之间的相关性示意图（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.741，CpG2与CpG3的相关系数为0.692）；

图2为GLUD1基因甲基化水平检测结果示意图（图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG5的甲基化程度分别为6%，15%，3%，19%，5%）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

从深圳市某慢性病研究所收集2型糖尿病患者标本，2型糖尿病诊断标准依据2010年美国糖尿病协会（ADA）指南，排除高血压、冠心病等心脏疾病、肾功能不全、药物滥用、肥胖或其他严重的疾病等疾病后，最后确定T2D97例作为病例组（59.74±9.42岁），同时收集年龄、性别、BMI相匹配且无其他疾病的97名正常者作为对照组（59.74±9.42岁）。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素和肌酐等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。

2、基因组DNA的提取

应用Lab-Aid820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，ThermoFisherScientific）检测所得DNA的浓度，以供GLUD1基因和PTPN1基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

本研究采用焦磷酸测序技术对GLUD1基因启动子区的5个CpG位点（如图1所示）进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应（PCR）扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C）碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶（U），然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMarkAssayDesign软件进行引物设计，

用于实验的GLUD1基因启动子区甲基化扩增引物和测序引物如下：

(1)甲基化特异性扩增上游引物（Forwardprimer）

5’-GTTGAAAGGGATAATAAAAGT-3’（SEQIDNO.1），

(2)甲基化特异性扩增下游引物（Reverseprimer）

5’-Biotin-CACCCTAACCTATCCTCTAA-3’（SEQIDNO.2），

(3)甲基化特异性测序引物（Sequencingprimer）

5’-GTTAGTTAAGTATAATTTAAT-3’（SEQIDNO.3）。

PTPN1基因启动子区CR扩增引物和测序引物如下：

具体实验步骤：

A.采用EZDNA甲基化试剂盒-Gold（EZDNAMethylation-Gold^TMKit;ZYMORESEARCH）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

B．取步骤A中转化过的DNA样本30ng加入到ZymoTaq^TMPreMix酶(ZymoTaq^TMPreMix,ZYMORESEARCH)，并分别加入上述两对谷氨酸脱氢酶基因和蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃10min的变性；接着95℃30s，Tm45s，72℃60s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃10min。（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）；

C.焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMarkAnnealingBuffer;Qiagen）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMarkBindingBuffer;Qiagen），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMarkWashBuffer;Qiagen;）和120ml的变性缓冲液（PyroMarkDenaturationSolution;Qiagen）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMarkVacuumPrepFilterProbes;Qiagen）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；

D.焦磷酸测序：在PyroMarkQ24焦磷酸测序仪上，采用PyromarkGoldQ24试剂盒（PyromarkGoldQ24Reagents;Qiagen）对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析。甲基化水平检测结果示例见图2GLUD1基因被检测序列所在区域及所检测的5个CpG点的相关性示意图所示（灰色阴影中显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平-即灰色阴影对应的上方数字），如图2所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，图中所示CpG1到CpG5的甲基化程度分别为6%，15%，3%，19%，5%。

4、数据分析

本次研究采用SPSS18.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的GLUD1基因启动子5个CpG位点间存在显著关联（相关系数r>0.692，p<0.001，有统计学意义，见图1）（注：p<0.05时表示有统计学意义，下同），所以我们把CpG1-CpG5求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异及生化指标TG和CRE也存在显著差异（p<0.001，见表1）。因此，我们分性别比较了病例组和对照组间GLUD1基因启动子区甲基化水平的差异，结果（见表2）发现CpG（1、2、4、5、平均值）在女性中与T2DM存在关联（p<0.05），而CpG3在女性中与T2DM无相关性（p=0.051）,在男性中GLUD1基因启动子区甲基化水平与T2DM无相关性，并且由表2可知，病例组的甲基化率低于正常对照组，因此，GLUD1基因启动子区甲基化水平与2型糖尿病的患病率呈负相关。

表1GLUD1基因病例组与对照组间的比较(n=192)

表2GLUD1基因分层后病例组与对照组间的比较(n=192)

注：n表示样本个数；加a表示进行过对数转换；加粗的为p值小于0.05，具有统计学意义。

综上所述，本发明可用于检测与2型糖尿病相关的GLUD1基因启动子区甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对GLUD1基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛查药物治疗提供借鉴。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。