一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法

摘要

本发明公开了一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法，其是新鲜的马尾藻为原料，经清洗、干燥、粉碎后过筛制得马尾藻粉，对马尾藻粉采用酸提法提取粗多糖蛋白混合物，粗多糖蛋白混合物经过CaCl2沉淀法纯化，对所得的纯化多糖蛋白混合物采用三氯乙酸-Sevage结合法除去蛋白后，再采用阴离子交换层析纯化技术，使得多糖存在于穿过峰中，能够很好的保持多糖的活性，获得的多糖纯度高。本发明方法工艺合理，处理量大，操作简单，有利于大规模生产，最终得到褐藻糖胶中的总糖和硫酸基含量比较高。

说明书

技术领域

本发明涉及多糖类的制备，尤其是一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法。

背景技术

褐藻多糖成分主要由充填在细胞壁间的褐藻胶、褐藻糖胶以及存在于细胞质中的褐藻淀粉三部分组成。褐藻种类不同，三者的比例也不尽相同。目前，褐藻胶的提取方法比较成熟，得率也较高，由于产量大，应用时间长，结构比较清晰；褐藻淀粉在褐藻中的含量很低，同时在生物学上的作用有限，在工业生产上应用不太广泛；褐藻糖胶随褐藻种类的不同而呈现很大的差异，一般生长于潮间带长时间与空气接触的褐藻种类中含量可高达20%，生长在较深处的褐藻中只有1～2%。而褐藻糖胶是一种杂多糖，组成除了含有岩藻糖和硫酸根外，还含有半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等单糖，由于具有独特的结构和优异的生理活性，如调节血脂、降血糖、降血压、抗凝血、抗肿瘤、抗突变和防辐射、抗病毒、增强免疫功能等，褐藻糖胶已成为本世纪海洋药物研究的热点之一。

马尾藻属于褐藻门的主要藻类，在我国有广阔的资源分布，常见的种类有海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝马尾藻等。马尾藻结构较复杂，单糖组成分析显示为岩藻糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖，此外还含有羧基和重要的活性要素-硫酸基。糖链有多种连接方式，硫酸基连接位置有2位或者4位。AndradeL-R等研究了褐藻细胞壁中酸性多糖的超微结构，揭示了褐藻糖胶以小粒状形成多边的晶形结构，这种结构与重金属的吸附有重要关系；X-衍射显示硫酸基中的S原子为这种结构的构成要素。

目前，尚未见道利用马尾藻制取褐藻糖胶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺合理、操作可靠、总糖和硫酸基含量高的利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：

(1)原材料的选取与处理采集新鲜的马尾藻为原料，经除杂、洗净、干燥、粉碎、过筛，得海藻粉；

(2)脱脂将步骤(1)所得到的海藻粉加入其质量5～15倍的70%～95%乙醇浸泡12～24h，回流提取2～4h，重复2～3次，过滤，滤渣干燥，得脱脂藻粉；

(3)酸提将步骤(2)所得到的脱脂藻粉经0.05～0.2mol/L稀盐酸于60～80℃提取1～4h，重复2～3次，离心，得酸提取液；将酸提取液减压浓缩后，加入乙醇至乙醇终浓度为70%～80%，低温静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得粗多糖蛋白混合物；

(4)CaCl₂沉淀纯化将步骤(3)所得到的粗多糖蛋白混合物配制成浓度为5%～10%水溶液；向该水溶液中加入CaCl₂至其终浓度为1.5～3mol/L，静置0.5～2h，离心，取上清液；将上清液加入乙醇至乙醇终浓度为70%～80%，低温静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得纯化多糖蛋白混合物；

(5)三氯乙酸-Sevage脱蛋白将步骤(4)所得的纯化多糖蛋白混合物配制成5%～15%水溶液，加入三氯乙酸至其终浓度为3%～10%，静置3～12小时，离心，取上清液；将上清减压浓缩后，向其中加入乙醇至乙醇终浓度达70%～90%，低温静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得脱蛋白粗多糖；将脱蛋白粗多糖经蒸馏水透析24～36h后，配制成5%～15%水溶液，选取有机相为氯仿-正丁醇4︰1，按照水相︰有机相为3︰1，混合物剧烈震荡20～30min，离心取水相；向其中加入乙醇至乙醇终浓度达70%～90%，低温静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得粗多糖；

(6)层析将步骤(5)所得到的粗多糖过阴离子交换柱层析，采用0.1～0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速控制为3～10mL/min，收集洗脱液，将洗脱液透析脱盐，浓缩冻干，得褐藻糖胶。

本发明新鲜的马尾藻为原料，经清洗、干燥、粉碎后过筛制得马尾藻粉，对马尾藻粉采用酸提法提取粗多糖蛋白混合物，能够明显提高多糖的提取率，粗多糖蛋白混合物经过CaCl₂沉淀法纯化，对所得的纯化多糖蛋白混合物采用三氯乙酸-Sevage结合法除去蛋白后，再采用阴离子交换层析纯化技术，使得多糖存在于穿过峰中，能够很好的保持多糖的活性，获得的多糖纯度高。本发明方法工艺合理，处理量大，操作简单可靠，有利于大规模生产，最终得到褐藻糖胶中的总糖和硫酸基含量比较高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法，其经过下列工艺步骤：

(1)原材料的选取与处理采集新鲜的马尾藻为原料，经除杂，洗净，于60℃恒温烘干，粉碎，过10目筛，得到海藻粉；

(2)脱脂将步骤(1)所得到的海藻粉加入其质量10倍的90%乙醇浸泡20h，回流提取3h，重复3次，过滤，滤渣干燥，得脱脂藻粉；

(3)酸提将步骤(2)所得到的脱脂藻粉经0.01mol/L稀盐酸于75℃提取3h，重复3次，离心，得酸提取液；将酸提取液减压浓缩后，加入乙醇至乙醇终浓度为75%，4℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得粗多糖蛋白混合物；

(4)CaCl₂沉淀纯化将步骤(3)所得到的粗多糖蛋白混合物配制成浓度为8%水溶液；向该水溶液中加入CaCl₂至其终浓度为2.5mol/L，静置1.5h，离心，取上清液；将上清液加入乙醇至乙醇终浓度为75%，4℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得纯化多糖蛋白混合物；

(5)三氯乙酸-Sevage脱蛋白将步骤(4)所得的纯化多糖蛋白混合物配制成10%水溶液，加入三氯乙酸至其终浓度为5％，静置5小时，离心，取上清液；将上清减压浓缩后，向其中加入乙醇至乙醇终浓度达80%，4℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得脱蛋白粗多糖；将脱蛋白粗多糖经蒸馏水透析30h后，配制成10%水溶液，选取有机相为氯仿-正丁醇4︰1，按照水相︰有机相为3︰1，混合物剧烈震荡25min，离心取水相；向其中加入乙醇至乙醇终浓度达80%，4℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得粗多糖；

(6)层析将步骤(5)所得到的粗多糖过阴离子交换柱层析，采用0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速控制为5mL/min，收集洗脱液，将洗脱液透析脱盐，浓缩冻干，得褐藻糖胶。

经测定，该实施例所得到褐藻糖胶中，总糖含量达到40.1%，硫酸基含量达到12.3%。

实施例2

一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法，其经过下列工艺步骤：

(1)原材料的选取与处理采集新鲜的马尾藻为原料，除杂、洗净后烘干，粉碎、过50目筛，得海藻粉；

(2)脱脂将步骤(1)所得到的海藻粉加入其质量15倍的70%乙醇浸泡24h，回流提取4h，重复2次，过滤，滤渣干燥，得脱脂藻粉；

(3)酸提将步骤(2)所得到的脱脂藻粉经0.2mol/L稀盐酸于80℃提取1h，重复3次，离心，得酸提取液；将酸提取液减压浓缩后，加入乙醇至乙醇终浓度为80%，6℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得粗多糖蛋白混合物；

(4)CaCl₂沉淀纯化将步骤(3)所得到的粗多糖蛋白混合物配制成浓度为5%水溶液；向该水溶液中加入CaCl₂至其终浓度为3mol/L，静置0.5h，离心，取上清液；将上清液加入乙醇至乙醇终浓度为80%，6℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得纯化多糖蛋白混合物；

(5)三氯乙酸-Sevage脱蛋白将步骤(4)所得的纯化多糖蛋白混合物配制成15%水溶液，加入三氯乙酸至其终浓度为10％，静置3小时，离心，取上清液；将上清减压浓缩后，向其中加入乙醇至乙醇终浓度达70%，6℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得脱蛋白粗多糖；将脱蛋白粗多糖经蒸馏水透析36h后，配制成15%水溶液，选取有机相为氯仿-正丁醇4︰1，按照水相︰有机相为3︰1，混合物剧烈震荡30min，离心取水相；向其中加入乙醇至乙醇终浓度达70%，6℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得粗多糖；

(6)层析将步骤(5)所得到的粗多糖过阴离子交换柱层析，采用0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速控制为10mL/min，收集洗脱液，将洗脱液透析脱盐，浓缩冻干，得褐藻糖胶。

经测定，该实施例所得到褐藻糖胶中，总糖含量达到38.7%，硫酸基含量达到12.33%。

实施例3

一种利用马尾藻制取褐藻糖胶的方法，其经过下列工艺步骤：

(1)原材料的选取与处理采集新鲜的马尾藻为原料，经除杂、洗净、干燥、粉碎、过20目筛，得海藻粉；

(2)脱脂将步骤(1)所得到的海藻粉加入其质量5倍的95%乙醇浸泡12h，回流提取2h，重复3次，过滤，滤渣干燥，得脱脂藻粉；

(3)酸提将步骤(2)所得到的脱脂藻粉经0.05mol/L稀盐酸于60℃提取4h，重复2次，离心，得酸提取液；将酸提取液减压浓缩后，加入乙醇至乙醇终浓度为70%，4℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得粗多糖蛋白混合物；

(4)CaCl₂沉淀纯化将步骤(3)所得到的粗多糖蛋白混合物配制成浓度为10%水溶液；向该水溶液中加入CaCl₂至其终浓度为1.5mol/L，静置2h，离心，取上清液；将上清液加入乙醇至乙醇终浓度为70%，4℃静置过夜，离心，得沉淀；将沉淀依次用无水乙醇和丙酮冲洗脱水，得纯化多糖蛋白混合物；

(5)三氯乙酸-Sevage脱蛋白将步骤(4)所得的纯化多糖蛋白混合物配制成5%水溶液，加入三氯乙酸至其终浓度为3％，静置12小时，离心，取上清液；将上清减压浓缩后，向其中加入乙醇至乙醇终浓度达90%，4℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得脱蛋白粗多糖；将脱蛋白粗多糖经蒸馏水透析24h后，配制成5%水溶液，选取有机相为氯仿-正丁醇4︰1，按照水相︰有机相为3︰1，混合物剧烈震荡20min，离心取水相；向其中加入乙醇至乙醇终浓度达90%，4℃静置过夜，离心，取沉淀物；将该沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得粗多糖；

(6)层析将步骤(5)所得到的粗多糖过阴离子交换柱层析，采用0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速控制为3mL/min，收集洗脱液，将洗脱液透析脱盐，浓缩冻干，得褐藻糖胶。

经测定，该实施例所得到褐藻糖胶中，总糖含量达到36.97%，硫酸基含量达到18.49%。