一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法

摘要

本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明的检测方法以待测肉品的DNA作为模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中LAMP反应40min，反应结束后向反应液中加入1？uL荧光染料SYBR？GREEN？Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在貂肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在貂肉。本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40？min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨，一些不法商贩在利益的驱动下，掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来，国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛羊肉的事件。而在一些以皮毛为主的特种经济动物养殖地区，貂肉和狐狸肉的去向成了一个谜，不少人推测其被掺入了牛羊肉中进入了人们的餐桌。这种现象不仅扰乱了经济秩序，而且严重危害人们身体健康。

目前，用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等，但上述诊断方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在实际生产中普及应用。

发明内容

    为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入貂肉所存在的上述技术问题，本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COXⅠ）基因对貂肉进行鉴定，整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。

本发明的技术方案是：

 一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法，以待测肉品的DNA作为模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在貂肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在貂肉；

所用引物如下：

DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，

DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT，如SEQ ID NO.2所示，

DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如SEQ ID NO.3所示，

DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如SEQ ID NO.4所示；

所述LAMP检测体系，总体积为25uL；其组成如下

10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL，10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO₄ 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer 2.5uL，模板2uL，余量为超纯水。

本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。 本发明无需借助于大型的昂贵仪器设备，更适合于基层的现地检测，具有广阔的市场前景和较大的社会经济效益。

本发明选用线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COXⅠ）基因作为目的基因；以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物，能特异性地扩增貂肉COXⅠ基因，从而将貂肉从羊肉、牛肉中检测出来；且能够将其与猫、狐狸等相近种属的肉区分开来；具备特异性高的优点。另外，采用DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物，其灵敏度高，所能检测到的最低浓度为2×10^-4ng/uL；因此，即使掺杂有微量貂肉也能被检测出来。

本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂，含有如下引物：

DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，

DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT，如SEQ ID NO.2所示，

DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如SEQ ID NO.3所示，

DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂盒，含有10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL，10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO₄ 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer 2.5uL；

    其中：

DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如SEQ ID NO.1所示，

DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT，如SEQ ID NO.2所示，

DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如SEQ ID NO.3所示，

DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如SEQ ID NO.4所示。

附图说明

图1为实施例1检测结果图；从左向右顺序为：阴性对照，阳性对照，牛肉，羊肉，狗肉，猫肉，狐狸肉，貂肉；结果显示：第2、8管为绿色，其余为橘黄色；

图2为PCR检测方法灵敏度示意图；从右向左顺序为：Marker，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度；

图3为LAMP检测方法灵敏度示意图；从左向右顺序为：Marker，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度。

具体实施方式

下述实施例中：所用试剂除由生产厂家直接提供的以外，其它均为分析纯；水，如果没有特别说明，为超纯水。

实施例1  设计引物

    从GenBank中检索获得貂的COXⅠ序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；根据上述序列利用PrimerExplore软件设计引物如下：

DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT （如SEQ ID NO.1所示），

DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT（如SEQ ID NO.2所示），

DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC（如SEQ ID NO.3所示），

DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC（如SEQ ID NO.4所示）。

实施例2  特异性实验

（1）提取样品DNA作为模板

    严格无菌采集牛、羊、狗、猫、狐狸、貂的新鲜肌肉组织作为样品，然后采用酚氯仿提取法分别提取样品中的DNA。分别以超纯水（阴性对照），本实验室保存的含有貂肉COXⅠ基因的阳性质粒（阳性对照），牛肉DNA，羊肉DNA，狗肉DNA，猫肉DNA，狐狸肉DNA，貂肉DNA为模板建立LAMP反应体系；DNA模板浓度均为20ng/uL。

（2）LAMP反应体系的建立

通过摸索内外引物浓度比、dNTP浓度、反应温度、反应时间等建立的LAMP反应体系：25μL，其组成为：10umol/L的DAF3、DAB3各0.5uL，10umol/L 的DAFIP、DABIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP 4uL，50mmol/L的 MgSO₄ 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermo buffer 2.5uL，最低浓度为20ng/uL的模板2uL，余量为超纯水。

其中，dNTP和MgSO₄购自宝生物工程（大连）有限公司、Betaine购自美国Sigma公司、Bst DNA聚合酶（8U/ uL）和10×Thermo buffer购自美国NEB公司、SYBR GREEN I核酸染料购自北京Solarbio公司。

LAMP扩增反应

     将上述LAMP反应体系（按照实施例1获取模板的顺序排列）同时置于64℃恒温水浴中进行LAMP扩增40min；反应结束后加入1uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；反应液颜色依次为橘黄色、绿色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、绿色（如图1所示）。其中，橘黄色为阴性结果，绿色为阳性结果。

实施例3

  从山东省内屠宰厂采集鲜牛肉样品30个，鲜羊肉样品30个；从山东省动物医院采集鲜貂肉样品10个；采用实例1的方法提取样品的DNA作为模板、建立LAMP反应体系、进行LAMP扩增反应，检测结果如表1所示：

表1

 牛肉羊肉貂肉牛肉和羊肉牛肉和貂肉羊肉和貂肉样品数量303010301010阳性数量001001010阳性比例/%001000100100

     由实施例2和3可以得出，实施例1的引物能特异性扩增貂肉DNA，只有模板中含有貂肉DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN Ⅰ后的反应液才显示绿色；而模板中含有其他任意非貂肉（牛、羊、猫、狐狸、狗）

DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN Ⅰ后的反应液显示橘黄色。因此，以实施例1的引物，采用上述LAMP反应体系，以荧光染料SYBR GREEN Ⅰ作为显色剂，能够将貂肉与其他动物（牛、羊、猫、狐狸、狗）的肉区分开来；从而能用于鉴别肉品中是否含有貂肉。

实施例4   灵敏度实验

将实施例1的阳性对照所用DNA分别以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的稀释度进行稀释，分别以稀释后的DNA为模板，分别进行LAMP和PCR，比较两种检测方法的灵敏度。结果显示：LAMP法的扩增灵敏度比普通PCR法要高；普通PCR可以检测到第3个稀释梯度（如图2所示）；而LAMP法在第4个稀释梯度仍可以检测到（如图3所示）。

<110>山东省兽药质量检验所

<120>一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法

<160>4

   

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

GCTATGGGCC  TTAGGGTT                                          18

 

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CATTTAGGGT  GTAGCCTGT                                         19

                                          

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GTGAAGAACG  ATGTCTAGTG  ATGAGTTTTA  TTTACAGTGG  GTGGC          45

 

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GCACATTTTC  ACTACGTTCT  TTCAAGGAAC  CAGTGAACGA  ATCC            44