调控4对棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用途

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控4对棉花DELLA基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用途。本发明要解决的技术问题是为提高棉花产量提供一种新选择。本发明的技术方案是利用RNAi技术同时调控4对棉花DELLA基因GhGAIs在棉花纤维中的表达。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。经本发明载体对目标基因进行调控后，改良的棉花衣分和衣指明显提高，棉花产量潜力明显增加。本发明方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济效益的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控4对棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用途。

背景技术

棉花是最重要的天然纤维作物，我国是世界上最大的产棉国和纺织品出口国，棉花在我国国民经济中占有举足轻重的地位。

棉花纤维是由棉花外珠被表皮细胞经起始、伸长、次生壁合成和成熟四个时期发育而成的单细胞纤维。植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。在棉花纤维和胚珠中上调赤霉素(GA)、生长素(IAA)和油菜素内酯(BR)合成酶基因，提高胚珠和纤维中相关激素的水平，可以促进棉花纤维的起始或生长、定向改良棉花纤维产量和品质性状，表明植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。关于靶标植物激素信号转导元件从而调控植物激素在纤维发育中信号转导的研究目前还很少。

DELLA蛋白是GA信号传导途径中一个关键的负调控因子。GA通过诱导DELLA蛋白的泛素化和降解，解除DELLA蛋白的抑制，促进GA反应基因的表达。此外，多种激素和环境信号都能直接或间接调控DELLA蛋白的降解，进而影响植物的生长发育及对环境的反应。迄今为止还未见通过调控棉花DELLA基因来改良棉花纤维的报道。根据棉花基因组测序的结果，棉花中DELLA蛋白由1个基因家族编码，单个棉花基因组含有4个编码基因，而异源四倍体的陆地棉中含有4对编码基因，分别命名为GhGAI1A和GhGAI1D、GhGAI2A和GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAI4D(表1)。每对基因为不同亚基因组(A和D亚基因组)上的直系同源基因，相同核苷酸序列>95％。前人通过克隆及异源表达等手段分析了部分棉花DELLA蛋白基因的功能，但目前还没有棉花DELLA蛋白基因在棉花纤维发育中功能的报道，也没有通过调控DELLA蛋白基因改良棉花纤维产量品质的报道。

表1棉花DELLA蛋白基因及其在已测序的基因组中的编码序列

基因 陆地棉 雷蒙德氏棉 亚洲棉 GhGAI1A Gh_A07G0717   Cotton_A_30811 GhGAI1D Gh_D07G0779 Gorai.001G089400   GhGAI2A Gh_A01G1242   Cotton_A_41295 GhGAI2D Gh_D01G1446 Gorai.002G177000   GhGAI3A Gh_A06G0504   Cotton_A_20431 GhGAI3D Gh_D06G0560 Gorai.010G067000   GhGAI4A Gh_A05G0135   Cotton_A_11125 GhGAI4D Gh_D05G0197 Gorai.009G021700  

发明内容

本发明要解决的技术问题是为提高棉花产量提供一种新选择。

本发明的技术方案是调控4对棉花DELLA基因GhGAIs表达的植物表达载和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAI4D。

具体的，所述载体包含串联了靶向所述4对基因的RNAi元件，该RNAi元件具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

具体的，调控所述RNAi元件的启动子为纤维次生壁合成期特异性启动子。

优选的，所述的启动子为棉花FbLate-2基因启动子(pFbl2)，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。

具体的，所述的宿主细胞为根癌农杆菌。

本发明还提高棉花纤维产量的物质，其主要活性成分为所述植物表达载体，或者含有所述植物表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述的载体在提高棉花纤维产量中的用途。

本发明还提供了所述的宿主细胞在提高棉花纤维产量中的用途。

本发明的有益效果：本发明通过研究和分析，证明DELLA蛋白在棉花纤维生长发育中具有重要作用。并通过在棉花纤维次生壁合成时期全面下调8个DELLA基因GhGAIs的表达，获得了衣分(棉花纤维占种子重量的百分比)和衣指(百粒棉籽上纤维的重量)明显提高的转基因棉花。试验结果证明，经本发明载体对目标基因进行调控后，改良的棉花衣分和衣指明显提高，纤维产量明显增加。本发明方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济效益的潜力。

附图说明

图1：GAIsRNAi的表达载体T-DNA区的基因结构图

CaMV35S-P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S-T，花椰菜花叶病毒35S终止子；D1-D4，棉花GAI1-4基因的DELLA和VHYNP结构域的编码序列，两个反向重复的D1-D4串联序列及间隔序列构成GAIsRNAi元件；GUS:NPTII，β-葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；LB,T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子；pFbl2，棉花FbLate-2基因启动子；RB,T-DNA右边界。

图2：p5-pFbl2-GAIRNAi表达载体构建流程

具体实验方法见实施例2。CaMV35S-P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S-T，花椰菜花叶病毒35S终止子；GAI-DELLA，4个棉花GAI片段的串联序列；GUS:NPTII，β- 葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；LB,T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子；pFbl2，棉花FbLate-2基因启动子；RB,T-DNA右边界；REP origin，质粒复制原点。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。

图3：4对棉花DELLA蛋白基因(GhGAI1A和GhGAI1D、GhGAI2A和GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAI4D)在GAIsRNAi转基因棉花开花后18天纤维中的表达水平

WT代表非转基因棉花。FGi为GAIsRNAi转基因棉花，其后的数字显示不同的转化子和纯合株系。

具体实施方式

下述实施例中所用到的常规实验操作：

1.DNA的提取

基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

2.RNA的提取

RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

3.DNA片段的PCR扩增

扩增体系如下：10×Ex PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，25mmol/L MgCl₂2μL，引物1(5μmol/L)1μL，引物2(5μmol/L)1μL，Ex Taq DNA聚合酶1U，基因组DNA约60ng，加入ddH₂O至25μL。

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

4.DNA片段的回收、连接和克隆

使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4 DNA ligase进行DNA片段连接。回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：10×T4 DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4 DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1︰3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。

5.GUS组织化学染色 

由于实验室采用的表达载体具有GUS报告基因，一般用GUS组织化学染色检测跟踪转基因。具体方法：取少量转基因棉花叶片(有伤口)置于96孔板中，加入GUS染液[0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，0.01mol/L Na₂EDTA，500mg/L X-Gluc，1％Triton X-100 (v/v)，0.14mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)]，在37℃恒温条件下放置2h左右，充分染液后再用75％乙醇脱色。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。

实施例1调控棉花DELLA基因的RNAi元件GAIsRNAi的获得

DELLA蛋白属于一个大的GARS蛋白家族，除在C端含有家族共有的GARS结构域外，在N端具有DELLA蛋白特有约100个氨基酸的DELLA和VHYNP结构域。如前所述，陆地棉含有4对DELLA蛋白的直系同源基因，成对共生同源基因的核苷酸序列相似性很高(相同核苷酸>95％)，而非直系同源基因的核苷酸序列相似性较低。为全面调控棉花DELLA蛋白基因的表达，我们根据4对直系同源的DELLA蛋白基因，选取了编码4种DELLA蛋白的DELLA和VHYNP结构域的D基因组序列(SEQ ID No.1～4)。通过PCR方法将4个序列串联，并最终扩增成含间隔序列的反向重复序列，即GAIsRNAi元件(SEQ ID No.No.5)。该序列在棉花中转录后，可以形成靶定4对DELLA蛋白基因的双链RNA序列，从而通过RNAi机制下调这些基因的表达水平。同时，DELLA和VHYNP结构域的编码序列是DELLA蛋白基因特有的，GAIsRNAi元件的表达不会影响其他GRAS蛋白的表达和功能。

首先，用陆地棉基因组DNA为模板分别扩增GAI1～4的DELLA和VHYNP结构域编码序列，引物分别为GAI1i-F/R、GAI2i-F/R、GAI3i-F/R和GAI4i-F/R(表2)，方法同上述常规试验操作的DNA片段扩增。进一步用上述DNA片段回收方法回收扩增的GAI1～4片段。

表2 GAIsRNAi元件扩增引物序列

引物 碱基序列(5'--3') 用途 GAI1i-F GACGAGTTATTAGCTGTTTTGG GAI1片段扩增上游引物 GAI1i-R AAGCTCATCGTTGAACTCGATCAACAAATTTTG GAI1片段扩增下游引物 GAI2i-F CGAGTTCAACGATGAGCTTTTGGCGGTTTTG GAI2片段扩增上游引物 GAI2i-R TAGTCCATCGTTAAGTTCAGAGAGCATGC GAI2片段扩增下游引物 GAI3i-F CTGAACTTAACGATGGACTACTCGCCGGT GAI3片段扩增上游引物 GAI3i-R GAAAACCATCCTCAGCGAACTCAGTTAGC GAI3片段扩增下游引物 GAI4i-F TTCGCTGAGGATGGTTTTCTAGCCGGAG GAI4片段扩增上游引物 GAI4i-R CTCCTACTTGTCCCTCCGTTAACTGATTATTCAAACT GAI4片段扩增下游引物

第二，利用不对称重叠PCR方法将回收的4个GAI片段串联。先将GAI1和GAI2、GAI3和GAI4分别串联。构建4个扩增体系如下：

(1)回收的GAI1片段约5ng，2μL引物GAI1i-F(5μmol/L)，1μL引物GAI1i-R(1μmol/L)；

(2)回收的GAI2片段约5ng，1μL引物GAI2i-F(1μmol/L)，2μL引物GAI2i-R(5μmol/L)；

(3)回收的GAI3片段约5ng，2μL引物GAI3i-F(5μmol/L)，1μL引物GAI3i-R(1μmol/L)；

(4)回收的GAI4片段约5ng，1μL引物GAI4i-F(1μmol/L)，2μL引物GAI4i-R(5μmol/L)。

扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸3min。分别将体系1和体系2混合、体系3和体系4混合，56℃，1min，72℃，3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，目的条带GAI1+GAI2 和GAI3+GAI4分别回收。

进一步用GAI1+GAI2和GAI3+GAI4为模板完成4个GAI片段的串联。构建2个扩增体系如下：

(5)回收的GAI1+GAI2片段约5ng，2μL引物GAI1i-F(5μmol/L)，1μL引物GAI3i-R(1μmol/L)；

(6)回收的GAI3+GAI4片段约5ng，1μL引物GAI3i-F(1μmol/L)，2μL引物GAI4i-R(5μmol/L)。

扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸3min。将体系5和体系6混合，56℃，1min，72℃，3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带GAI1+GAI2+GAI3+GAI4。

在设计引物时，GAI4引物的扩增片段包含了GhGAI4的DELLA和VHYNP结构域编码序列以及结构域的临近序列。该结构域的临近序列相当于RNAi元件的必要组成——间隔序列，有利于两个反向重复序列形成双链RNA。

最后用直接扩增发夹RNA的方法¹以片段GAI1+GAI2+GAI3+GAI4为模板扩增获得含间隔序列的4个GAI片段的反向重复序列。反应体系中含回收的GAI1+GAI2+GAI3+GAI4约5ng，2μL引物GAI1i-F(5μmol/L)，1μL引物GAI4i-R(1μmol/L)，其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，35个循环；72℃延伸3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收约1800bp的目的条带，按常规方法回收、克隆和测序验证，最终获得GAIsRNAi元件(图1)。

GAIsRNAi元件依次包括GAI1+GAI2+GAI3+GAI4(包括DELLA和VHYNP结构域编码序列以及结构域的临近序列)+GAI4反向重复序列+GAI3反向重复序列+GAI2反向重复序列+GAI1反向重复序列。GAIsRNAi元件的序列如下，其中下划线所示为间隔序列：

gacgagttattagctgttttgggttacaaagttcggtcatcagatatggcggatgtagctcaaaaattggaaatgttggagaaagttatgggtactgctcaagaaaatgggatttcacagcttggtgatactgttcattttaatccttcagatctatctggttgggttcaaaatttgttgatcgagttcgacgatgagcttttggcggttttgggttacaaggtcaaaacttcagacatggctgaagtggctcgaaagcttgagcggttggaggaggctatgtgtaatgttcaagatgatgggatttctcaccttgcttctgaaactgttcattataatccttccgatctgtcgacttggctcgagagcatgctctctgaacttaacgatggactactcgccggtgctggttataaagtccggtcgtcggagctacgacaaatagctcagcgactggaacgactcgaaaccgccatgggtaattcgcctgcagatttctctcaacttgcctccgatgccatactctataacccttctgatctggcctgctgggtcgactcgctgctaactgagttcgctgaggatggttttctagccggagctggatacagagttaggtcatcggagctgcgaaaagtagctcagcgacttgaacgacttgaaaccgccatggttaattctcccgcagatttgtctcaacttgcttccgataccatccactataacccttccgatctagcctcctgggttgactcgctgctgtccaagtttactcagcctcctacttgtccctccgagttcatcatggatcctgaaaccaatcagacggtggtaagcgacgcatggaccactgccgaacctcatatgccgcaggtgcaccagaatatttcttaccagcaacaaagtttgaataatcagttaacggttgataatcagttaacggttgtaacagcaatggaggaagattccggtatacggttggttcatatgttgatgacgtgtgcggagtgcgttcaacgtggagacttctcattggctgagtaagctcggacagcagcgagtcaacccaggaagctagatcggaagggttatagtggatggtatcggaagcaagttgagacaaatctgcgggagaattaaccatggcggtttcaagtcgttcaagtcgctgagctacttttcgcagctcggatgacctaactctgtatccagctccggctagaaaaccatcctcagcgaactcagttagcagcgagtcgacccagcaggccagatcagaagggttatagagtatagcatcggaggcaagttgagagaaatctgcaggcgaattacccatggcggtttcgagtcgttccagtcgttgagctacttgtcgtaactccgacgaccggactttataaccagcaccggcgagtagtccatcgttaagttcagagagcatgctctcgagccaagtcgacagatcggaaggattataatgaacagtttcagaagcaaggtgagaaatcccatcatcttgaacattacacataacctcctccaactgctcaagctttcgagccacttcagccatgtctgaagttttgaccttgtaacccaaaaccgccaaaagctcatcgttgaactcgatcaacaaattttgaacccaaccggatagatctgaaggattaaaatgaacagtatcaccaagctgtgaaatcccatcttcttgagcagtacccataactttctccaacatttccaatttttgagctacatccgccatatctgatgaccgaactttgtaacccaaaacagctaataactcgtc 

实施例2纤维次生壁合成期特异的GAIsRNAi表达载体的构建

GAIsRNAi元件构建入植物表达载体p5的流程见图2。p5是由传统的植物表达载体pBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域，图2)替换为了组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)控制报告基因GUS和标记基因NptII的融合基因表达盒，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。

按前述常规操作方法用引物(pFbl2F，5’-aagctTGCAGACTTAGGATTGGATG-3’和pFbl2R，5’-ggatccGGTTAACCGAAATACAAAGCA-3’)从棉花基因组中扩增克隆启动子pFbl2，并在启动子两端加上HindⅢ和BamHⅠ位点。用HindⅢ和BamHⅠ将pFbl2启动子从克隆载体上切下(HindⅢ为部分酶切)，连接到用HindⅢ和BamHⅠ酶切的p5载体上构建p5-pFbl2载体。进一步用BamHⅠ和KpnⅠ将GAIsRNAi元件从克隆载体上切下(BamHⅠ为部分酶切)，插入到p5-pFbl2载体的相应位点上，即获得最终的表达载体p5-pFbl2-GAIsRNAi。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书,将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

实施例3棉花的遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表3。具体方法如下：对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量(约20～40颗)去壳后的种子置于灭菌后的100mL三角瓶中，先用75％酒精预洗种子1min，轻轻倒出酒精再加入0.1％HgCl₂灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌)，轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床(30℃、100rpm)上，每隔8小时换一次无菌水，待胚根长出1cm左右(约36～48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30℃暗培养至下胚轴伸长到3cm左右(约48h)。侵染约20h前，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/L Km和125mg/L Sm的液体YEB培养基中，置于28℃ 摇床(200rpm)，培养约20h后测量菌液的OD值(OD₆₀₀)，OD₆₀₀在0.8-1.0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离1min，弃上清后用含有共培养液体培养基(含100μmo1/L AS，乙酰丁香酮)的按1:1体积比重悬菌体后收集重悬液于100mL三角瓶，置于摇床(30℃、100rpm)培养约20min。将下胚轴切成长约1cm的小段，置于重悬液中并在摇床(30℃、100rpm)上侵染50min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养(30℃、16h光照/8h黑暗，下同)15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤转入液体悬浮培养基中并置于摇床(30℃、100rpm)上悬浮培养10d左右，通过筛网过滤将细小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培养至长约1cm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作必须在严格的无菌条件下完成。

生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。收获T0代转基因棉花种子，继续种植T1代并收获种子，播种T1代种子后对萌发的T2代幼苗进行GUS组织染色(见常规操作方法)，筛选出纯合的转基因T2代株系(全部为GUS阳性或GUS阴性植株)，移栽T2代纯合株系，并检测靶标基因GhGAIs的表达水平和比较纤维产量和品质性状变化。

表3根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986；Gelrite:Sigma,货号:G1910；SH:Schenk&Hildebrandt,1972。

实施例4棉花GhGAIs基因转录水平的检测

提取对照和转基因棉花开花后18天纤维的RNA，逆转录合成cDNA一链，以此为模板进行定量PCR检测。具体操作步骤为：用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。定量PCR在CFX96定量PCR检测系统(Bio-Rad)上进行，在25μL的反应体系包括12.5μL 2×Super Mix(Bio-Rad)，上下游引物各0.2μmol/L 和1μL一链cDNA。温度循环参数为95℃预变性2min；95℃，10sec，57℃，20sec，扩增40循环。用棉花Actin4基因作内标。用定量PCR仪自带的分析软件Bio-Rad CFX Manager 2.0计算各个基因的相对表达量。所有定量PCR引物序列见表4。

如图3，GAIsRNAi转基因棉花在开花后18天的纤维中4对靶标基因GhGAIs的转录水平普遍较非转基因株系降低，显示pFbl2启动的GAIsRNAi元件可以成功抑制DELLA蛋白基因的表达。

表4定量PCR引物序列

引物 碱基序列(5'---3') 用途 GhGAI1A-F GGACCACCTCAACCCGATG GhGAI1A上游引物 GhGAI1A-R CGATGCGTTCGGCCAATTC GhGAI1A下游引物 GhGAI1D-F GGACCGCCTCAACCGGATA GhGAI1D上游引物 GhGAI1D-R CGATGCGTTCGGCCAATTG GhGAI1D下游引物 GhGAI2A-F CACCCACCAACGTTAAATCT GhGAI2A上游引物 GhGAI2A-R ACCACGGGACGAGTTGAAG GhGAI2A下游引物 GhGAI2D-F CACCCACCAACGTTAAATCC GhGAI2D上游引物 GhGAI2D-R ACCACGGGACGAGTTGAAT GhGAI2D下游引物 GhGAI3A-F TTCTTTAGAAGCTTGCAGGG GhGAI3A上游引物 GhGAI3A-R CCAATGGCTCGTGCCTTTCT GhGAI3A下游引物 GhGAI3D-F TTCTTTAGAAGCTTGCAGGA GhGAI3D上游引物 GhGAI3D-R CAATGGCTCGTGCCTTTCC GhGAI3D下游引物 GhGAI4A-F GTTCATCATGGATCCTGTAAG GhGAI4A上游引物 GhGAI4A-R GAATCTTCCTCCATTGCTGG GhGAI4A下游引物 GhGAI4D-F GTTCATCATGGATCCTGAAAC GhGAI4D上游引物 GhGAI4D-R GAATCTTCCTCCATTGCTGT GhGAI4D下游引物 GhAct4-F TTGCAGACCGTATGAGCAAG GhActin4上游引物 GhAct4-R ATCCTCCGATCCAGACACTG GhActin4下游引物

实施例5 GAIsRNAi转基因棉花产量和纤维品质性状的考察

衣分和衣指均是棉花重要的产量性状。衣分是指籽棉上纤维重量对籽棉重量之比，以百分率表示；也就是纤维重量占整个种子及纤维总重量的比例。衣指是百粒棉籽上纤维的重量。T2代GAIsRNAi转基因棉花的衣分和衣指的分析结果如表5。转基因棉花单株与对照相比，衣分提高4～24％，衣指提高20～80％，显示GAIsRNAi转基因棉花具有很高的增产潜力。

表5 GAIsRNAi转基因棉花纤维产量性状

样品 衣分(％) 衣分比对照增加(％) 衣指(g) 衣指比对照增加(％) WT 38.6   5.5  

 

FGi01-10 48.1 24.61 9.9 80.0 Fgi02-2 44.2 14.51 6.6 20.0 FGi02-3 43.5 12.69 7.7 40.0 FGi04-2 40.2 4.15 6.6 20.0 FGi05-1 42.1 9.07 7.1 29.1 FGi06-13 42.0 8.81 7.2 30.9 FGi07-1 40.8 5.70 6.6 20.0 FGi08-7 42.5 10.10 7.3 32.7

注：上表中WT为非转基因棉花。FGi为GAIsRNAi转基因棉花，其后的数字显示不同的转化子和纯合株系。

将GAIsRNAi转基因棉花及对照的棉纤维样品送农业部棉花品质监督检测测试中心(安阳)，依据ASTM D5867-95《HVI900大容量纤维测试仪试验方法》，采用HFT9000在温度20℃相对湿度65％的环境条件下，对上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率、马克隆值共5项指标进行测试。结果见表6，显示GAIsRNAi转基因棉花的纤维品质与对照相比没有明显变化。

表6 GhGAIsRNAi转基因棉花的纤维品质性状

注：上表中WT为非转基因棉花。FGi为GAIsRNAi转基因棉花，其后的数字显示不同的转化子和纯合株系。

上述实例表明，本发明改良棉花的方法，能够实现在纤维次生壁合成期特异调控4对棉花DELLA蛋白基因表达，达到改良棉花纤维产量(衣分和衣指)的目的。

参考文献： 

1.Yue-Hua Xiao,Meng-Hui Yin,Lei Hou,and Yan Pei(2006)Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA,BioTechniques 41:548-552(November 2006)。