一株长链烷烃降解菌及其应用

摘要

本发明涉及一株长链烷烃降解菌及其应用。其技术方案是：本发明所提供的菌株为不动杆菌(Acinetobacter？sp.)C3，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC？NO：M2015394，保藏日期为2015年6月19日；所述不动杆菌(Acinetobacter？sp.)C3的16S？rDNA的GenBank登录号为KR072554；菌株Acinetobacter？sp.C3为一株革兰氏阴性菌，菌落为规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈白色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈短杆状。该降解菌在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表面活性剂，能促进长链烷烃增溶、乳化、润湿和渗透作用，能高效地降解焦化废水和石化废水中的长链烷烃（C8~C40），实现了对工业废水生物强化深度再生处理。

说明书

技术领域

    本发明属于环境污染物生物处理技术领域。具体涉及一株长链烷烃降解菌及其应用。

背景技术

随着经济的发展，冶金生产中用冷却、乳化、防腐、抗磨和清洁的长链烷烃类精细化学品的需求日益增多，广泛的使用导致了冶金废水中存在长链烷烃物质，这类物质由于化学性质稳定、疏水性强，使生物可利用性差，很难自然降解，是严重持续破坏生态环境的有机污染物之一。如，焦化废水经生化处理后还含有大量的长链烷烃，而导致水质达不到工业再生水的标准。因此，研究有效去除长链烷烃的控制方法对保持生态环境良性循环、促进经济和社会的可持续发展具有十分重要的意义。

工业废水中的长链烷烃类污染物治理技术主要有物理法、化学法和生物法。虽然物理法和化学法治理长链烷烃类污染物能取得较好的效果，但造价高和易造成二次污染而限制了实际应用。生物法治理长链烷烃类污染物具有处理效果好、成本低、操作简单、绿色、无二次污染和应用范围广等优点而受到人们的广泛关注。

目前，已报道的石油烃类降解微生物的细菌和真菌有100多属，细菌较多，真菌较少。细菌中能降解石油烃的主要有：假单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、节杆菌属、微球菌属、黄杆菌属和不动杆菌属等。这些细菌对石油烷烃的降解效率有待于提高，即不能满足烷烃降解的实际应用，特别是对不动杆菌属的菌种报道甚少。如“一种稠油降解菌及其应用”（CN 101921722 A）专利技术，该技术的特点是得到能降解稠油的不动杆菌，但存在对环境适应不强、降解效率低等缺点；“高效油脂降解菌及其应用”（CN 103525720 A）专利技术，该技术的特点是得到能降解油脂的不动杆菌，主要针对工业油脂及餐饮垃圾污染物的降解，也存在可操作性差、降解效率低和菌株的适用范围受限等不足。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，目的是提供一株长链烷烃降解菌，该菌种能高效地降解工业废水中的长链烷烃组分，实现对工业废水生物强化深度再生处理。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一株长链烷烃降解菌，来源于武汉石化厂受污染的土壤，经人工富集、筛选和分离纯化所得到。该菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.)C3，由中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2015394，保藏日期为2015年6月19日；所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)C3的16S rDNA的GenBank登录号为KR072554；菌株Acinetobacter sp.C3为一株革兰氏阴性菌，菌落为规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈白色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈短杆状。

本发明提供的菌株Acinetobacter sp.C3应用于降解焦化废水和石化废水中的C8~C40组分，C8~C40组分得到了有效的去除；在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表面活性剂。由于其具有较强的乳化作用、增溶作用、润湿和渗透作用，增加了长链烷烃的溶解性和传递速度，从而提高了菌株Acinetobacter sp.C3对长链烷烃的降解效率。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明提供的菌株Acinetobacter sp.C3在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表面活性剂，产率为3~10g/L；该表面活性剂能将溶液的表面张力由最初的80.03mN/m降低到20.79mN/m，72h内乳化能力达60~100%。

2、本发明提供的菌株Acinetobacter sp.C3具有高效的降解长链烷烃能力，适用于对不同环境、不同浓度的长链烷烃的有效降解：对浓度为500~5000mg/L的正十六烷的降解率为85~100%；对浓度为500~10000mg/L的柴蜡混合物的降解率为78~92%；对冶金行业（独立焦化厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业等）中COD为80 ~400mg/L的废水处理后，出水水质的COD为30~60mg/L，达到工业再生水的标准（COD≤60mg/L）；对独立焦化厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业的废水中长链烷烃的去除率分别为52~73%、87~93%和88.5~95.2%。

因此，本发明提供的菌株Acinetobacter sp.C3应用于焦化废水和石化废水的治理，有良好的降解效果，实现了对工业废水生物强化深度再生处理。

附图说明

图1为本发明的菌株 Acinetobacter sp.C3的革兰氏染色图；

图2为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂的红外吸收光谱图；

图3为图1所示菌株 Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂临界胶束浓度的测定图；

图4为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂乳化性能的测定图；

图5为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3对石油烃的降解曲线图；

图6为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3对焦化废水降解前的气质联用图；

图7为图1所示菌株Acinetobacter sp.C3对焦化废水降解后的气质联用图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的描述，并非对其保护范围的限制。

实施例1

菌株Acinetobacter sp.C3的获取和鉴定。菌株Acinetobacter sp.C3的获取和鉴定的步骤是：

步骤一、样品采集及富集培养

从武汉石化厂长期受污染土壤中采集土壤样品，把采集的土壤样品加入蒸馏水中，摇匀，于1000×g离心10min，取上清，按接种量4%（v︰v）接种于正十六烷浓度为500mg/L的LB液体培养基中，在转速为125r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养24h，得到初培养液。

取初培养液4mL转接于正十六烷浓度为500mg/L的无机盐培养基中，在转速为125r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养36h，得到培养液。

再取培养液4mL转接于含正十六烷为唯一碳源的无机盐培养基中，转接6次，转接过程中逐渐增大正十六烷的浓度，浓度依次为：1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L和5000mg/L；然后在转速为125r/min和温度为35℃的恒温摇床中训化培养36h，得终培养液。

步骤二、分离纯化

取终培养液1 mL，用无菌水将其按体积比依次梯度稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7和10^-8的菌悬液，然后取200μL稀释好的各个浓度梯度的菌悬液均匀地涂布于正十六烷浓度为1000mg/L的固体LB平板上（每个浓度梯度做三个重复），于35℃的恒温培养箱中培养；待长出菌落后，挑取菌落于正十六烷浓度为1000mg/L的固体无机盐培养基平板上划线，倒置在35℃生化培养箱中恒温培养1~2d，挑取单菌落，采用平板划线分离法将菌落在无机盐平板上划线纯化，重复划线4~5次，得到纯化后的单菌落。挑取所有的单菌落接种于正十六烷浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，于转速为125r/min和温度为35℃的摇床中培养48h，采用气相色谱法检测降解后无机盐培养基中正十六烷的残余浓度，确定降解率最高的菌株，编号为C3。

步骤三、菌株的鉴定

将菌株C3接种于LB固体培养基上，于35℃生化培养箱中恒温培养48h，菌落为规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈白色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，如图1所示菌体呈短杆状；菌株C3的16S rDNA基因序列长度为1414bp，如序列表所示，提交到GenBank后，序列的登录号为KR072554，经NCBI Blast检索，本发明的菌株C3与Acinetobacter sp.的相似性达99%。故，根据菌株C3的形态特征和生理生化特征及其16S rDNA基因序列特征，确定菌株C3属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.），命名为Acinetobacter sp.C3。

所述的LB培养基配方为：酵母浸提物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L。所述富集培养基的pH值为6.8~7.2，在121.3℃湿热灭菌20 min备用。

所述的无机盐培养基配方为：硝酸铵1g，磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾1.36g，七水硫酸镁0.432g，氯化钙0.006g，微量元素1mL，蒸馏水1L。培养基的pH值为6.8～7.2，在121.3℃湿热灭菌20min。其中微量元素配方：一水硫酸锰1.69g/L，六水氯化钴0.24g/L，硼酸1.16g/L，二水钼酸钠0.024g/L，七水硫酸亚铁2.78g/L，七水硫酸锌1.15g/L，五水硫酸铜0.38g/L。

所述的正十六烷是用0.2μm微孔滤膜过滤后的产品。

所述的LB固体培养基配方：在LB培养基上加入2%（w/v）的琼脂，高温湿热灭菌。

所述的无机盐固体培养基配方：在无机盐培养基配方上加入2%（w/v）的琼脂，高温湿热灭菌。

实施例2

    温度对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至正十六烷浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，在转速为150r/min和培养温度分别为25℃、30℃、35℃和40℃的恒温摇床中培养48h，采用气相色谱法检测温度对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响，结果见表1。

       表1  温度对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响

温度（℃）降解率（%）2582.83096.43598.64086.3

由表1可以看出，菌株Acinetobacter sp C3在25~40℃范围内对正十六烷有一定的降解效果，在35℃时降解效果最佳。菌株Acinetobacter sp.C3对在较高温度40℃下也有较好的降解率，达86.3%。

本实施例说明菌株Acinetobacter sp C3对不同的温度环境中长链烷烃的降解性能较好。

实施例3

    pH值对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至正十六烷浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，调pH值分别为6.5、6.8、7.0、7.2和7.5，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，采用气相色谱法检测pH对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响，结果见表2。

        表2  pH值对菌株Acinetobacter sp.C3降解正十六烷的影响

pH降解率（%）6.579.76.890.27.099.17.297.57.583.2

从表2可以看出，pH值为7.0时，菌株Acinetobacter spC3对正十六烷的降解率高达99.1%，pH值在6.8~7.2都有较好的降解率（大于90%）。

本实施例说明菌株Acinetobacter sp.C3对在中性和偏碱性较宽的pH值范围内长链烷烃的降解性能较好。

实施例4

正十六烷初始浓度对菌株Acinetobacter sp.C3降解性能的影响。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至正十六烷初始浓度为500~5000mg/L和pH值为7.0的无机盐培养基中，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，采用气相色谱法检测正十六烷的残余浓度，结果见表3。

        表3  正十六烷初始浓度对菌株Acinetobacter sp.C3降解性能的影响

正十六烷浓度（mg/L）降解率（%）50099.41000100200098.4400096.3500085

从表3可以看出菌株Acinetobacter sp C3对正十六烷的降解率达85~100%。

本实施例说明菌株Acinetobacter sp C3对较宽浓度范围内长链烷烃的降解性能较好，为其在实际环境中的应用提供了保证。

实施例5

菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂的提取及性能研究。将1~2%（v/v）的菌株Acinetobacter sp C3的菌悬液接种至正十六烷浓度为500~5000mg/L的无机盐培养基中，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，得到发酵液；然后将发酵液在8000~12000r/min和4~8℃条件下离心15~20min，收集上清液；调上清液pH值至2~3；再按氯仿/甲醇溶液（2/1，v/v）︰pH为2~3的上清液的体积比为1︰0.5~1进行萃取抽提；将萃取后的有机相在20~30℃和-0.1MPa下减压蒸馏后，得到黄色表面活性剂，产率为3~10g/L。

采用红外分析法和薄层层析法(TLC)对菌株Acinetobacter sp.C3所产生的生物表面活性剂进行类别鉴定，并对生物表面活性剂的CMC值、排油圈值以及乳化性能进行了测定。

生物表面活性剂红外光谱扫描结果如图2所示，3436cm^-1处为-OH吸收，1649cm^-1处为NH⁺吸收；1543cm^-1和1389cm^-1为C=O的吸收；1079cm^-1处可能是PO-R的吸收；950cm^-1为P=0的吸收；668cm^-1处为P=S的吸收，511cm^-1为P-S的吸收。该生物表面活性剂初步鉴定为磷脂类活性剂。

将提取的生物表面活性剂用毛细管点样于硅胶薄板，放入层析缸进行薄层层析。展开剂为氯仿/甲醇/水＝65/15/2(v/v/v)。用高氯酸为显色剂，溶液的特征颜色反应显蓝色，说明此表面活性剂为磷脂类表面活性剂。与红外光谱扫描鉴定结果一致，故，可鉴定菌株Acinetobacter sp.C3产生的表面活性剂为磷脂类表面活性剂。

CMC值的测量结果如图3所示，当表面活性剂浓度低于35mg/L时，随着表面活性剂浓度增加，水的表面张力相应降低，当表面活性剂浓度高于35mg/L时，增加表面活性剂浓度不能使水的表面张力进一步降低，表明菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂的临界胶束浓度约为35mg/L，能把水的表面张力降低到20mN/m。

排油圈值：取培养皿，加水，水面上加0.1ml正十六烷，形成油膜。在油膜中心加入提取的生物表面活性剂，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，测量圆圈的直径为80mm。

菌株Acinetobacter sp.C3产生的生物表面活性剂的乳化性能结果如图4所示，72h内乳化能力为60~100%。说明菌株C3产生的表面活性剂乳化性能较好，具有很好的增溶效果、乳化能力和润湿渗透能力。

实施例6

    菌株Acinetobacter sp.C3对某独立焦化厂废水的降解。采集某独立焦化厂生化后废水，废水中含有一定量的C8~C16烷烃，COD为200~300mg/L。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至装有该独立焦化厂生化后废水的烧瓶中，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，能将该独立焦化厂废水COD降低到50~58.5mg/L，达到工业再生水的标准（COD≤60mg/L）；GC-MS分析用菌株Acinetobacter sp.C3处理前后的焦化废水中C8~C16烷烃的去除率为52~73%，大部分烷烃得到去除。菌株Acinetobacter sp.C3对除长链烷烃以外的有机物也有着较好的降解能力。

实施例7

    菌株Acinetobacter sp.C3对某新型煤化工企业废水的降解。采集某新型煤化工企业生化后废水，废水中含有大量的C16~C24的长链烷烃，COD为300~400mg/L。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至装有该新型煤化工企业废水的烧瓶中，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，能将该新型煤化工企业废水COD降低到40~60mg/L，达到工业再生水的标准（COD≤60mg/L）；GC-MS分析用菌株Acinetobacter sp.C3处理前后的焦化废水中C16~C24烷烃的去除率为87~93%。菌株Acinetobacter sp.C3对中长链烷烃有着很好的降解效果。

实施例8

    菌株Acinetobacter sp.C3对石油烃的降解。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至含1％（v︰v）柴蜡（柴油︰石蜡＝1∶1，v︰v）的无机盐培养基中（长链烷烃碳原子数为C20~C30），在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养，每隔12h利用吸光光度法测定培养液中石油烃的降解率，实验结果如图5所示。由图5可知，96~156h后，500~10000mg/L的柴蜡混合溶液的降解率达78~92%。

实施例9

    菌株Acinetobacter sp.C3对某联合焦化厂废水的降解。采集某联合焦化厂生化处理后废水，经深度处理后废水中含有大量的C30~C40长链烷烃，COD为80 ~200mg/L，结果如图6所示，未能达到工业再生水水质标准。将菌株Acinetobacter sp.C3接种至装有该新型煤化工企业废水的烧瓶中，在转速为150r/min和温度为35℃的恒温摇床中培养48h，能将出水COD降低到30~60mg/L，结果如图7所示，达到工业再生水的标准（COD≤60mg/L）；GC-MS分析用菌株Acinetobacter sp.C3处理前后的焦化废水中C30~C40长链烷烃的去除率为88.5~95.2%。

本具体实施方式具有以下优点：

1、本具体实施方式提供的菌株Acinetobacter sp.C3在发酵降解过程生成了一种磷脂类生物表面活性剂，产率为3~10g/L；该表面活性剂能将溶液的表面张力由最初的80.03mN/m降低到20.79mN/m，72h内乳化能力达60~100%。

2、本具体实施方式提供的菌株Acinetobacter sp.C3具有高效的降解长链烷烃能力，适用于对不同环境、不同浓度的长链烷烃的有效降解：对浓度为500~5000mg/L的正十六烷的降解率为85~100%；对浓度为500 ~10000mg/L的柴蜡混合物的降解率为78~92%；对冶金行业（独立焦化厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业等）中COD为80 ~400mg/L的废水处理后，出水水质的COD为30~60mg/L，达到工业再生水的标准（COD≤60mg/L）；对独立焦化厂、钢铁联合企业和新型煤化工企业的废水中长链烷烃的去除率分别为52~73%、87~93%和88.5~95.2%。

因此，本具体实施方式提供的菌株Acinetobacter sp.C3应用于焦化废水和石化废水的治理，有良好的降解效果，实现了对工业废水生物强化深度再生处理。

  序列表                     

<1> 1414

<2> DNA

<3> 不动杆菌Acinetobacter sp.

<4>

1     CCATGCAGTC GAGCGGAGTG ATGGTGCTTG CACTATCACT TAGCGGCGGA

51    CGGGTGAGTA ATGCTTAGGA ATCTGCCTAT TAGTGGGGGA CAACATCTCG

101   AAAGGGATGC TAATACCGCA TACGTCCTAC GGGAGAAAGC AGGGGATCAC

151   TTGTGACCTT GCGCTAATAG ATGAGCCTAA GTCGGATTAG CTAGTTGGTG

201   GGGTAAAGGC CTACCAAGGC GACGATCTGT AGCGGGTCTG AGAGGATGAT

251   CCGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG

301   TGGGGAATAT TGGACAATGG GGGGAACCCT GATCCAGCCA TGCCGCGTGT

351   GTGAAGAAGG CCTTATGGTT GTAAAGCACT TTAAGCGAGG AGGAGGCTCT

401   TTTGGTTAAT ACCCAAGATG AGTGGACGTT ACTCGCAGAA TAAGCACCGG

451   CTAACTCTGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC AGAGGGTGCA AGCGTTAATC

501   GGATTTACTG GGCGTAAAGC GCGCGTAGGC GGCCAATTAA GTCAAATGTG

551   AAATCCCCGA GCTTAACTTG GGAATTGCAT TCGATACTGG TTGGCTAGAG

601   TGTGGGAGAG GATGGTAGAA TTCCAGGTGT AGCGGTGAAA TGCGTAGAGA

651   TCTGGAGGAA TACCGATGGC GAAGGCAGCC ATCTGGCCTA ACACTGACGC

701   TGAGGTGCGA AAGCATGGGG AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC

751   ATGCCGTAAA CGATGTCTAC TAGCCGTTGG GGCCTTTGAG GCTTTAGTGG

801   CGCAGCTAAC GCGATAAGTA GACCGCCTGG GGAGTACGGT CGCAAGACTA

851   AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT

901   TAATTCGATG CAACGCGAAG AACCTTACCT GGCCTTGACA TAGTAGAAAC

951   TTTCCAGAGA TGGATTGGTG CCTTCGGGAA TCTACATACA GGTGCTGCAT

1001  GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG

1051  CGCAACCCTT TTCCTTACTT GCCAGCATTT CGGATGGGAA CTTTAAGGAT

1101  ACTGCCAGTG ACAAACTGGA GGAAGGCGGG GACGACGTCA AGTCATCATG

1151  GCCCTTACGG CCAGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGTCGG TACAAAGGGT

1201  TGCTACCTAG CGATAGGATG CTAATCTCAA AAAGCCGATC GTAGTCCGGA

1251  TTGGAGTCTG CAACTCGACT CCATGAAGTC GGAATCGCTA GTAATCGCGG

1301  ATCAGAATGC CGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT

1351  CACACCATGG GAGTTTGTTG CACCAGAAGT AGCTAGCCTA ACTGCAAAGA

1401  GGGCGGTACC A