一种2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物及其在药学中的应用

摘要

本发明公开了一种2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物，其晶体结构属三斜晶系，其空间群为P1，分子式为C38H24CoN10。Co(II)原子为五配位。本发明还公开了所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物在制药中的应用。本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物能够抑制人肝癌细胞Hep-G2生长，诱导人肝癌细胞Hep-G2的凋亡，阻滞人肝癌细胞Hep-G2在G2期，还具有以非经典插入方式作用于DNA的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物及其在药学中的应用。

背景技术

在目前癌症治疗中，铂类抗癌药物的使用占了抗癌药物的70％，其中的代表性药物顺铂， 能够有效地治疗多种癌症，是治疗睾丸和卵巢癌最为有效的抗癌药物之一，但它也有一定的 局限性，容易在肿瘤细胞中产生耐药性，对机体有严重的副作用，如恶心，腹泻，肾和肝功 能衰竭等。因此，人们迫切需要研制出更有效、毒性更小或是具有DNA靶向结合的抗癌药 物。钴是人体必需微量元素，参与体内维生素B12合成、刺激骨髓造血和调节红细胞新陈代 谢等重要生理功能，并可以抑制机体中的恶性肿瘤细胞的生长。苯并咪唑类化合物具有独特 的抗癌活性特点：(1)以微管蛋白作为主要的靶分子抑制肿瘤细胞的有丝分裂，(2)介导以 Caspase蛋白酶活化和细胞色素C释放为特征的细胞凋亡，(3)抑制乏氧诱导因子和血管内 皮生长因子的释放，(4)苯并咪唑是许多DNA小沟结合剂的重要结构单元，可以以沟面结 合的方式作用于DNA。通过合成含双苯并咪唑的Co(II)配合物，希望可以寻找出低毒、抗癌 活性高、抗癌谱广的金属配合物，用以代替铂类药物的抗癌治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物及其应用，获得 2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物的体外抗人肝癌细胞Hep-G2的结果。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：

一种2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物，其晶体结构为，

所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物在制药中的应用。

所述的制药中的应用，包括制备抑制人肿瘤细胞Hep-G2生长的药物中的应用。

所述的抑制人肿瘤细胞Hep-G2生长的药物，其抑制有效浓度为20～500μmol/L。

本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物能够抑制人肝癌细胞Hep-G2生长，诱导 人肝癌细胞Hep-G2的凋亡，阻滞人肝癌细胞Hep-G2在G2期，还具有以非经典插入方式作 用于DNA的作用。

附图说明

图1为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物对Hep-G2细胞的抑制作用，顺铂 作为参照(n＝4)。

图2为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物作用于Hep-G2细胞48h后的流式 凋亡图。

图3为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物作用于Hep-G2细胞48h后的流式 凋亡率柱状图。

图4为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物作用于Hep-G2细胞的周期分布。

图5为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物作用于Hep-G2细胞的周期分布率 柱状图。

图6为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物与DNA相互作用的的紫外-可见谱 图。

图7为本发明所述的2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

1. 2,3双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物(C₃₈H₂₄CoN₁₀)的制备

CoCl₂·6H₂O 0.1189g(0.5mmol)的水溶液(5mL)加入到2,3-双苯并咪唑吡啶0.0770 g(0.25mmol)在DMF溶液(3mL)中搅拌反应3min后，再加入浓氨水5mL搅拌30s后，转移至 高压反应釜中，于180℃下反应2天，反应结束时，以5℃/h的速率梯度降至室温，过滤，去 离子水洗涤，得到深紫色块状晶体。

2.红外光谱检测

配合物用KBr压片在4000-400cm^-1范围测定红外图谱，如图7所示。

3.晶体结构测定

将尺度合适的、表面无裂痕且光滑的晶体在Agilent G8910A CCD衍射仪上测定。在温度 293(2)K下，衍射光源是通过石墨单色器单色化的Mo-Kα射线采用扫描模式进行扫描，衍射数据用Lp因子及其经验吸收进行校正。晶体结构由SHELXL–97 程序解析。

表1 2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物的晶体参数和结构精修(T＝293(2))

4. 2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物[C₃₈H₂₄CoN₁₀]的晶体结构及分析

2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物属三斜晶系，其空间群为P1，分子式为C₃₈H₂₄CoN₁₀。Co(II) 原子为五配位，如Co1原子分别与三个不同配体的苯并咪唑基的N原子协调配位 和两个苯并咪唑吡啶基的吡 啶环上的N原子协调配位它们的键角 N7-Co1-N10A＝117.15(11)°，N1-Co1-N10A＝94.61(11)°，N1-Co1-N2＝79.04(11)°， N7-Co1-N6＝77.14(11)°)。Co(II)原子与配位的N原子不共一平面。其键长和键角如表2所示。

表2 2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物的键长和键角(°)

5.采用MTT法检测细胞存活率

药物分组：设置五个浓度梯度，它们的终浓度依次为500μmol/L、100μmol/L、20μmol/L、 4μmol/L、0.8μmol/L；阳性对照组：顺铂，设五个浓度梯度，终浓度依次为500μmol/L、 100μmol/L、20μmol/L、4μmol/L、0.8μmol/L；空白对照组：不加药物，只含细胞的1640完 全培养基；无细胞对照组：只含1640完全培养基(不加药物和细胞)。

操作方法：选对数生长期的细胞，先用PBS磷酸盐缓冲液冲洗两遍，再用适量含EDTA的 0.25％胰蛋白酶消化1～1.5min，使贴壁细胞变为单个细胞悬浮液，细胞计数板进行计数。调整 细胞的浓度为5×10⁴个/mL接种到96孔板中，每孔加入的体积为100μL。放入含5％CO₂的37℃ 恒温培养箱中培养24h后，每个孔内加入100μL不同浓度梯度的测试药物。每个测试样品的浓 度梯度设4个复孔平行试验，每个测试药物重复3次实验。加完药后放入培养箱中培养48h，取 出加入MTT测试液(PBS配制为5mg/mL)，每孔20μL，继续孵育4h后，将其上清小心去掉并 向每个孔内加入DMSO150μL，振荡96孔板让结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上选取570nm 波长测定每孔的OD值。通过对细胞抑制率的计算，作图求出半数细胞抑制浓度(IC₅₀)。细胞 抑制率计算公式如下：

表3 2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合物对Hep-G2细胞的抑制作用(n＝4)

图1为2,3-双苯并咪唑吡啶钴(II)配合物对Hep-G2细胞的抑制作用的柱状图，顺铂作为 参照(n＝4)。

6. 2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物对Hep-G2细胞凋亡和周期的影响

6.1流式检测细胞凋亡

选对数生长期的细胞，计数细胞密度为2×10⁵个/mL接种到6孔板中，每孔加入2mL。放入 含5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h后，更换等体积含药的完全培养基。给药48h后，用不 含EDTA的0.25％胰蛋白酶收集六孔板的细胞，800r/min离心5min，弃掉培养液，预冷的PBS 洗两遍，500μL的Binding Buffer加入到PBS洗好的细胞中重浮细胞，加5μL Annenxin V-FITC 与细胞混匀反应5min后再加入5μLPI，混匀在室温下避光反应15min。转移进流式管中，在流 式细胞仪上检测。

6.2流式检测细胞周期

选对数生长期的细胞，计数细胞密度为5×10⁵个/mL接种到6孔板中，每孔加入2mL。放入 含5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h后，更换等体积含药的完全培养基。给药48h后，用含 EDTA的0.25％胰蛋白酶收集六孔板的细胞，800r/min离心5min，弃上清液，室温的PBS洗两 遍，缓慢地加入预冷的70％乙醇在-20℃固定24h后，离心沉淀细胞弃乙醇固定液，加入室温 PBS，使细胞静置水合15min，离心去上清。加入RNaseA到细胞悬液中在水浴37℃孵育30min 后，加入PI进行染色，室温下避光反应30min，在流式细胞仪上检测细胞周期的变化。图2为 2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞48h后的流式凋亡图。

表4 2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞48h后的流式凋亡率

图3为2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞48h后的流式凋亡率柱形图，如 图3所示，2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物选取终浓度为25、50、100μmol/L作用于Hep-G2细 胞，设置空白对照组。由图3可得出，随着2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物浓度的增大，Hep-G2 细胞的总凋亡率也逐渐地增大。空白对照组的总凋亡率为2.67％±0.52％，2,3双苯并咪唑吡啶 钴配合物浓度为25μmol/L时，Hep-G2细胞的总凋亡率为10.45％±0.36％，当浓度递增到 50μmol/L，Hep-G2细胞的总凋亡率稍上升到15.75％±0.83％，随着浓度继续增加时，Hep-G2 细胞的总凋亡率由C组的15.75％±0.83％增加到了D组的44.66％±1.22％，与空白对照组相比 要高出很多。Hep-G2细胞的坏死率也随着浓度的增加而增大，但整体上Hep-G2细胞总凋亡 率要高于坏死率，所以2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物主要以凋亡方式抑制Hep-G2细胞的增殖。 给药组细胞的总凋亡率与空白对照组细胞的总凋亡率有显著差异(P＜0.05)。

6.3 2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物对肿瘤细胞Hep-G2周期的影响

图4为2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞的周期分布。

表5 2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞的周期分布率

图5为2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞的周期分布率柱形图，如图5 所示，2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物选取终浓度为25、50、100μmol/L作用于Hep-G2细胞， 设置空白对照组。由图5可知，2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物作用于Hep-G2细胞48h后，随 着给药浓度的递增，G1期的细胞数量呈现出下降的趋势，由空白对照组的68.39％±0.77％降 到100μmol/L组的39.73％±0.78％，S期的细胞数量无明显变化，而G2期细胞数量呈现上升 趋势，由空白对照组的15.98％±0.35％上升到40μmol/L组的41.62％±0.45％，表明2,3双苯 并咪唑吡啶钴配合物诱导Hep-G2细胞凋亡是通过将Hep-G2细胞周期阻滞在G2期。给药组 与空白对照组的周期阻滞作用具有显著差异(除了25μmol/L组的S期)(P＜0.05)。

7.钴配合物与DNA相互作用的紫外-可见吸收光谱及结合常数

实验方法

(1)Tris-HCl缓冲溶液配制

称取Tris 0.3028g，NaCl 0.5265g，先用一定量的去离子水溶解，再用适量浓盐酸调pH 值约7.2，然后定容至500mL。

(2)CT-DNA溶液的配制及浓度确定

称取1.00mg丝状CT-DNA溶解于1.00ml Tris-HCl缓冲溶液中配成1.00mg/ml的溶液， 在4℃条件下轻轻摇晃过夜使其溶解，取少量母液稀释50倍后测其在260nm和280nm处 的吸光度值，若A₂₆₀/A₂₈₀＝1.8～1.9，则说明溶液中基本上不含蛋白质、酚和RNA，符合实验 要求，没有必要进一步纯化处理。DNA的浓度以碱基对的摩尔浓度计算，其在260nm处的 摩尔吸光系数为6600M^-1cm^-1。DNA的浓度计算公式如下：

$\left[DNA\right]=\frac{A_{260}}{6600}\times K$

[DNA]为DNA的摩尔浓度，A₂₆₀为该浓度DNA溶液在260nm处的吸光值，K为稀释倍 数。

(3)配合物及配体溶液的配制

以DMSO作为溶剂，在超声助溶的条件下，分别将相应质量的各金属配合物及配体配制 浓度为2.285×10^-3mol/L溶液，静置备用。

(4)紫外-可见吸收光谱检测配合物与DNA作用曲线

在紫外-可见吸收光谱仪中，往参比池和样品池的比色皿中加入2970μl Tris-HCl缓冲溶 液，调零。样品池中加入30μl配合物溶液，参比池中加入30μl DMSO，然后每次分别向样品 池和样品池中加入3μl的CT-DNA溶液，用1000μl的微量加样枪吹打混匀后，静置3min， 在200-700nm的范围检测吸收光谱变化，并记录各吸收光谱曲线最大吸收峰处的吸光度值。

(5)配合物与DNA结合常数K_b的计算

配合物与DNA相互作用的结合常数计算公式如下：

$\frac{\left[DNA\right]}{{ϵ}_A-{ϵ}_F}=\frac{\left[DNA\right]}{{ϵ}_B-{ϵ}_F}+\frac{1}{K_b({ϵ}_B-{ϵ}_F)}$

ε_A为任意DNA浓度下溶液的摩尔吸光系数，ε_B是配合物与DNA完全键合时的摩尔吸光 系数。ε_F为未加入DNA前纯配合物的摩尔吸光系数。以-[DNA]/(ε_A-ε_F)做纵坐标对[DNA]作 图，得出斜率和截据，斜率和截距的比值即结合常数K_b。图6为2,3-双苯并咪唑吡啶钴配合 物与DNA相互作用的紫外-可见谱图，[Complex 7]:2.285μmol/L；[DNA]:2.77,5.54,8.31, 11.08,13.85,16.62,19.39,22.16,24.93μmol/L。

从图6中可以看出，当在固定2,3双苯并咪唑吡啶钴配合物的浓度时，随着DNA浓度 的增加，吸收峰的强度会逐渐下降，表现出减色效应，并且发生轻微的红移，根据拟合出的 方程y＝5.3939x+144.52，R²＝0.9844，计算出配合物与DNA的结合常数K_b为3.73×10³M^-1，说 明配合物以非经典插入方式与DNA发生相互作用。