越南奇楠沉香组织培养的方法

摘要

本发明公开了一种越南奇楠沉香组织培养的方法。该方法为将消毒后的外植体接种至丛芽诱导培养基中诱导出丛芽；再将丛芽接种到继代增殖培养基继续培养；然后接种至生根培养基中进行生根，生根后进行炼苗和田间栽培管理。本发明方法获得越南奇楠沉香无性系苗木的产率高，时间快，且所获得的苗木健壮，这些苗木一是可以解决种植业越南奇楠沉香苗木缺乏的问题；二是用越楠奇楠沉香的无性系苗进行人工诱导结香，能探索出最好最稳定的人工诱导结香技术，容易得到得香率高而均一、品质优良的沉香，能产生高效的经营效率；三是将推进越南奇楠沉香无性系育种、良种的中试和良种的推广。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养的方法，具体涉及涉及一种越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.组织培养的方法。

背景技术

越南奇楠沉香（Aquilaria crassna Pierre.）是瑞香科沉香属植物，天然分布于越南、柬埔寨、老挝、泰国等海拔300～900m、年降雨量1200mm左右的丘陵、山地，是东南亚国家生产高品质沉香木和沉香油的主要树种。由于过度砍伐，该树种在许多天然林中已濒临灭绝，《濒临绝种野生动植物国际贸易公约》（CITES，Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora）将越楠奇楠沉香列为及危品种。在广东部分区域有香农从越南引种越南奇楠沉香进行栽培，但种苗价格极高，一株奇楠沉香树苗价格高达10～20元不等。

越南奇楠沉香需生长6～8年开始开花，而优良的种子必须采自树龄15年以上的母树。奇楠沉香的种子寿命又极短，如果不经过特别处理，只能储存1周左右。即使在最佳保存条件下（湿度为25%，温度为8℃）保存一个月，发芽率也从41%降至22%。因此，越南奇楠沉香人工种植所需要的种苗极其匮乏。

种子繁殖只能繁殖常规苗木，不能繁殖无性系苗木。林木基因组杂合程度高，实生苗造林分化大。越南奇楠沉香也不例外，采用实生苗造林，会存在分化大，结香率及结香品质参差不齐的问题，影响了种植收益。越南奇楠沉香在自然条件下自然结香的比例是极低的，必须要经过人工诱导结香，才能保证有较高的结香率，但如果采用种子苗进行人工诱导结香，由于个体间遗传差异大，同样的方法所诱导的结香效果不一样，导致沉香的产量极不稳定，严重影响了香农种植的积极性。

要想人工栽培的越南奇楠沉香有高品质和稳定的结香率，必须通过组培快繁技术走越南奇楠沉香无性系化的道路。用无性系苗进行人工诱导结香，才能获得最好最稳定的人工诱导结香技术，才能获得得香率高而均一、品质优良的沉香，才能产生高效的经营效率。

越南奇楠沉香是从越南引进的珍贵树种，种质资源极其匮乏，少量已有的人工栽培奇楠沉香树由于来自种子苗，得香率也不稳定，如果奇楠沉香的种植不解决组培快繁的技术问题，不走无性系化的道路，将难以做到经营的集约化，生产的高效性，也无法满足市场对越南奇楠沉香种苗的大量需求。也将严重制约奇楠沉香无性系育种、良种的中试和良种的推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.组织培养的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.组织培养的方法，包括以下步骤： 

1）外植体的消毒：将越南奇楠沉香种子进行消毒处理；

2）丛芽诱导培养：将上步消毒后的种胚接种至丛芽诱导培养基中，每培养28～32天后将种胚转接至新的丛芽诱导培养基中，转接3～4次，奇楠沉香种胚即可被诱导出多个丛芽；

3）增殖培养：将上步诱导出丛芽的越南奇楠沉香组培苗接种到继代增殖培养基中，每培养28～32天将奇楠沉香增殖苗转接至新的继代增殖培养基中继续培养；

4）生根培养：将增殖培养中高度达2cm以上的单芽切下接种至生根培养基中，培养15～20天，当至少70%的增殖苗开始生根后进入炼苗阶段；

5）炼苗：将上步获得的奇楠沉香生根芽苗在光强3000～6000 Lx、温度26～30℃条件下炼苗10～20天；

6）移植及苗期管理：将炼苗后的苗木移植到土壤中，进行田间栽培管理。

进一步的，步骤1）中所述种子消毒处理具体方法为：将越南奇楠沉香种子用无菌水清洗干净后，用0.8～1.2g/L升汞消毒28～32min，再用无菌水清洗干净。

进一步的，步骤2）中所述丛芽诱导培养基为含有0.58～0.62mg/L6-BA和0.08～0.12 mg/L IBA的MS培养基。

进一步的，步骤2）、步骤3）和步骤4）的培养条件均为：温度24～26℃、光照8～10h·d^-1、光照强度2500～3500Lx。

进一步的，步骤3）中所述增殖培养基为含有0.18～0.22mg/L 6-BA和0.08～0.12 mg/LIBA的MS培养基。

进一步的，步骤4）中所述生根培养基为含有0.08～0.12mg/L NAA的MS培养基，并且其中大量元素的含量为正常MS的0.24～0.26倍，微量元素的含量为正常MS的0.45～0.55倍。

进一步的，步骤6）中所述的土壤含有68～72%黄泥和28～32% 泥炭土基质。

进一步的，步骤6）中所述田间栽培管理的具体方法为：移植后先在遮阳率为90～95%，相对湿度为85%～90%，温度为25～33℃的条件下培养12～14天；然后将苗木置于遮阳率为75%～80%，湿度为75%～80%，温度为25～33℃的条件下培养13～15天；最后将苗木置于遮阳率为40～60%的条件下进行培养，当苗木高度≥25cm后，将其完全在自然环境条件下进行培养。

进一步的，步骤6）中移植的时间为3～6月或9～11月。

本发明的有益效果是：

本发明建立了一种能够获得大量越南奇楠沉香无性系苗木的组织培养方法，其中，本发明通过研究发现越南奇楠沉香丛芽诱导培养基含有0.58～0.62mg/L6-BA和0.08～0.12 mg/L IBA、增殖培养基含有0.18～0.22mg/L 6-BA和0.08～0.12 mg/LIBA，生根培养基含有0.08～0.12mg/L NAA，且生根培养基的大量元素的含量为正常MS的0.24～0.26倍，微量元素的含量为正常MS的0.45～0.55倍，才能确保越南奇楠沉香无性系苗木的高产率，生长快，且苗木健壮。

本发明方法获得越南奇楠沉香无性系苗木的产率高，时间快，且所获得的苗木健壮，这些苗木一是可以解决种植行业越南奇楠沉香苗木缺乏的问题；二是用越楠奇楠沉香的无性系苗进行人工诱导结香，能探索出最好最稳定的人工诱导结香技术，容易得到得香率高而均一、品质优良的沉香，能产生高效的经营效率；三是将推进越南奇楠沉香无性系育种、良种的中试和良种的推广。

附图说明

图1为大量元素的含量（以MS为单位）对越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.生根率的影响；

图2为微量元素的含量（以MS为单位）对越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.生根率的影响；

图3为NAA的浓度（mg/L）对越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.生根率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

本实施从越南引进少量的越南奇楠沉香Aquilaria crassna Pierre.优树种子，经过组织培养繁殖，获得了20个无性系，并繁殖组培瓶苗苗木5万株供热带林业研究所森林培育与技术研究首席专家组营造无性系示范林。具体操作步骤如下：

1）外植体的消毒

将越南奇楠沉香种子用无菌水清洗2次，然后用1g/L升汞消毒30分钟，再用无菌水清洗干净，其洗4次，前3次每次5分钟，最后一次10分钟，即可。

2）丛芽诱导培养

将600粒消过毒的种胚接种至丛芽诱导培养基中，丛芽诱导培养基为含有0.6mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA的MS培养基，放入培养室培养，培养条件为温度25±1℃、光照8～10h·d^-1、光照强度2500～3500lx，培养30天后，获430个无污染的种胚，消毒成功率为71.7%；将无菌种胚再转接到新丛芽诱导培养基上，30天后获得170个萌发种胚；将萌发种胚接种到新丛芽诱导培养基中，培养30天后再转接至新丛芽诱导培养基中，再培养30天后获得113颗诱导出正常丛芽的奇楠沉香苗，丛芽诱导率为66.5%。

即在丛芽诱导培养过程中，将消毒后的种胚每培养28～32天后转接至新的丛芽诱导培养基中，转接3～4次后，奇楠沉香种胚即可被诱导出多个丛芽。

3）增殖培养

将上步诱导出丛芽的奇楠沉香苗接种到继代增殖培养基上，每培养28～32天将种胚转接至新的继代增殖培养基中继续培养；增殖转接时以3～4个丛芽为1 丛，每200mL 培养瓶接种3～4丛。

为了研究激素浓度及种类对越南沉香增殖苗的影响，对增殖培养基中的激素浓度及种类进行研究，本实施例对激素6-BA设计了0.2 mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L 3 个浓度梯度，各浓度每次处理7瓶，每瓶接种增殖芽3个，同时对IBA设置了0和0.1mg/L两个浓度（见表1），培养30 天后，统计增殖结果（见表1）。

从表1中可以看出，增殖培养基中的6-BA 浓度是影响增殖倍数的关键因子，IBA能部分抵消6-BA对增殖倍数的作用， IBA对增殖苗高度的影响显著。由表1可见在没有IBA的情况下，当6-BA的浓度为0.6mg/L，增殖芽数量的月增殖倍数最高，可达到3.3倍，但增殖苗月均高生长最低，只有0.5cm，不利于后期增殖苗的生根诱导。事实上当月增殖倍数达到2倍以上就满足大规模生产组培苗的条件。综合考虑，当激素配比为0.2mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA时，最适合大规模工厂化生产越南沉香组培苗。故最佳增殖培养基的配方为含有0. 2mg/L 6-BA和0.1mg/L IBA的MS培养基。

表1  激素浓度及种类对越南沉香增殖苗的影响

4）生根诱导培养

在增殖苗每一次进行转接时，将增殖培养中高度达2cm以上的越南沉香组培单芽切下接入生根培养基，培养15～20天，培养温度24～26℃、光照8～10h·d^-1、光照强度2500～3500Lx，当至少70%的增殖苗开始生根后即可转入炼苗阶段；

本实施例通过对生根培养基中大量元素、微量元素、激素的含量进行研究，发现当大量元素含量为0.25MS、微量元素含量为0.5MS、NAA浓度为0.1 mg/L时，最适合诱导越南沉香组培苗生根（见图1、图2、图3）。故生根培养基配方为含有0. 1mg/L NAA的MS培养基，但其中大量元素的含量为正常MS的0.25倍，微量元素的含量为正常MS的0. 5倍。

5）炼苗

适宜奇楠沉香生根芽苗炼苗条件为：光照强度为3000～6000Lx，温度26～30℃，6～8月适宜的炼苗时间为10～15天，其它季节适宜的炼苗时间为15～20天。奇楠沉香生根芽苗在炼苗初期对光照比较敏感，只要有阳光直接照射或光照强度超过8000lux以上，就能引起叶片黄化、白化、脱落，最终导致苗木死亡。同时，芽苗对温度也有一定的敏感性，6～8月炼苗，温室温度超过35℃即可引起黄化落叶，严重影响芽苗质量和移植成活率。

6）移植及苗期管理

将完成炼苗的有根苗木小心从培养瓶中取出，用清水漂洗净苗木基部的培养基，当天移植入含质量百分比为70% 黄泥和30% 泥炭土基质的营养袋中，营养袋规格为6×11cm。

奇楠沉香组培苗在移植过程中对光照也比较敏感，苗木移植前期在遮阳率为90～95%，相对湿度为85%～90%，温度为25～33℃的条件下培养12～14天；然后进入苗木移植中期，即将苗木置于遮阳率为75%～80%，湿度为75%～80%，温度为25～33℃的条件下培养13～15天；最后进入苗木移植后期，即将苗木置于40～60%遮阳率、温湿度与自然条件相同条件下进行培养直至苗木高度达到25cm，才可以在完全自然环境条件下进行培养。

具体操作如下：

1）苗木移植前期：苗床加盖薄膜，在薄膜上加盖1 层遮阳率为90% 的遮荫网；晴天每天喷雾5～6次，阴天每天喷雾4～5次，雨天每天喷雾2～3次；温度高时，在遮荫网上淋降温水，控制苗床温度为25～35℃。

2）苗木移植中期：苗床上两头及侧边的薄膜每间隔1米设置一个通风口，白天盖遮阳率为80% 的遮阳网，晴天时，每天淋水4～5次，阴天每天淋水3～4次，若是雨天，则全天仅盖薄膜，每天淋水1～2次。

3）苗木移植后期：无需再盖薄膜，但在白天仍需盖40～60%的遮阳网，直至苗木高度≥25cm，才可以将遮阳网完全去除。

与其它林木种类有所不同的是，越南奇楠沉香组培苗在移植过程中对温度的敏感性较低，6～8月的移植成活率仍然可以达到70%以上，这可能与自然界越南奇楠沉香也是6～8月发芽成苗有关。因此，奇楠沉香组培苗木可以常年移植，最适的移植季节为3～6月和9～11月，成活率可达80%以上。

本发明建立的越南奇楠沉香无性系苗木的组织培养方法，产率高，时间快，且所获得的苗木健壮，这些苗木一是可以解决种植业越南奇楠沉香苗木缺乏的问题；二是用越楠奇楠沉香的无性系苗进行人工诱导结香，能探索出最好最稳定的人工诱导结香技术，容易得到得香率高而均一、品质优良的沉香，能产生高效的经营效率；三是将推进越南奇楠沉香无性系育种、良种的中试和良种的推广。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。