DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用

摘要

本发明公开了DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用。通过实验证明：DBeQ是一个白色念珠菌Vps4蛋白的有效抑制剂，DBeQ是通过对Vps4蛋白的抑制作用进而对ESCRT系统产生影响，表现为白色念珠菌菌丝的生长受到了抑制。因此，DBeQ不仅可以作为进一步开发抗白色念珠菌感染的基础，还可以被开发为一种研究细胞功能的研究工具用于观察细胞在ESCRT系统被抑制后的变化。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)是一种常见的条件致病真菌，通常在人体粘膜表 面造成局部感染，在免疫缺陷病人中白色念珠菌往往可造成系统性感染。由于HIV的 感染以及肿瘤病人和器官移植病人数量的增加，白色念珠菌的感染日益成为重要的临 床问题。研究表明在癌症病人中，白色念珠菌是最常见的造成感染的真菌(在癌症病 人体内分离出的真菌病原体中70％属白色念珠菌)，同时，具有抗药性菌株的出现和传 播也进一步增加了治疗的难度。例如，传统上fluconazole是有效的治疗药物，然而目 前已出现多个抗该药物的白色念珠菌菌株，因此，开发新型药物成为了一个日渐迫切 的课题。

白色念珠菌的一个特点是其形态可以在单细胞的酵母态与纤维状的菌丝态之间变 化。研究表明，只有菌丝态的白色念珠菌才能完成其对内皮或粘膜的侵袭。感染的病 人取样研究还发现，侵入上皮组织的白色念珠菌都以菌丝态存在。因此，目前证据表 明菌丝态的形成是白色念珠菌得以侵袭人体组织的一个决定因子。由于局部感染的建 立是导致白色念珠菌进入血液导致系统性病变的基础，该菌的形态变化很可能是其致 病性的关键因素。因此，干预菌丝形成有可能成为开发新型药物的基础。

转运必需内体分选复合物(endosomalsortingcomplexrequiredfortransport，ESCRT) 最初是在内体(endosome)内陷形成多囊泡体(multivecicular body,MVB)的过程中 发现的，其作用是完成膜蛋白的降解，其包括5种蛋白复合物，分别命名为ESCRT 0、 I、II、III和Vps4/Vta1。其中，Vps4属于AAA ATPase。研究表明，ESCRT系统的缺失 会导致MVB形成的障碍，并且在内体上出现一个特殊的结构，称为E型区域(class E  compartment)。

发明内容

本发明的一个目的是提供式Ⅰ所示的DBeQ的新用途。

本发明提供了式Ⅰ所示的DBeQ在制备抗白色念珠菌的产品中的应用：

上述应用中，所述抗白色念珠菌是通过抑制白色念珠菌的菌丝生长体现的。

上述应用中，所述抑制白色念珠菌的菌丝生长是通过抑制Vps4蛋白活性体现的。

上述应用中，所述抑制白色念珠菌Vps4蛋白活性是通过1)抑制Vps4蛋白的 ATPase活性和/或2)抑制ESCRT系统功能体现的。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在抑制白色念珠菌的菌丝生长中的应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在制备抑制白色念珠菌的菌丝生长的产品中的 应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在制备抑制Vps4蛋白的ATPase活性的产品中 的应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在抑制ESCRT系统功能中的应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示的DBeQ在制备抑制ESCRT系统功能的产品中的应用。

上述应用中，所述Vps4蛋白来源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具体为白色念 珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3；所述Vps4蛋白的氨基酸序列具体如序列表 中序列2所示。

本发明的另一个目的是提供一种抗白色念珠菌的产品。

本发明提供的产品的活性成分为式Ⅰ所示的DBeQ，所述产品的用途为如下(1) -(4)中的至少一种：

1)抗白色念珠菌；

2)抑制白色念珠菌的菌丝生长；

3)抑制Vps4蛋白的ATPase活性；

4)抑制ESCRT系统功能。

上述产品在抑制白色念珠菌的菌丝生长中的应用也属于本发明的保护范围。

上述产品在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述产品在抑制ESCRT系统功能中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制ESCRT系统功能是通过抑制Cps转运进入液泡中体现的。

上述产品或上述应用中，所述Vps4蛋白来源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具 体为白色念珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3；所述Vps4蛋白的氨基酸序列具 体如序列表中序列2所示。

本发明发现了DBeQ可以抑制白色念珠菌菌丝的生长，并通过实验进一步证明 DBeQ是一个白色念珠菌Vps4蛋白的有效抑制剂，DBeQ是通过对Vps4蛋白的抑制 作用进而对ESCRT系统产生影响，表现为白色念珠菌菌丝的生长受到了抑制。因此， DBeQ不仅可以作为进一步开发抗白色念珠菌感染的基础，还可以被开发为一种研究 细胞功能的研究工具用于观察细胞在ESCRT系统被抑制后的变化。

附图说明

图1为白色念珠菌Vps4蛋白的纯化。M为标准蛋白；1为未诱导的E.coli全菌； 2为诱导后的E.coli全菌；3为细胞破碎液；4为亲和层析柱的穿过峰；5为凝血酶酶 切后亲和层析柱的洗脱峰。

图2为DBeQ的分子式。

图3为DBeQ抑制Vps4的ATPase活性。

图4为DBeQ影响Cps的分布。图4a为GFP-Cps在BWP17中充满整个液泡；图 4b为GFP-Cps在vps4-/-中只是集中在液泡表面，呈现戒指状；图4c为GFP-Cps BWP17 在30uM DMSO处理4h后，GFP-Cps的分布和a基本相同；图4d为GFP-Cps BWP17 在30uM DBeQ处理4h后，GFP-Cps的分布与a相比发生改变，但不如Vps4敲除作 用明显。

图5为白色念珠菌的不同菌丝生长状态。图5a为白色念珠菌的酵母态；图5b为 单菌丝态，当酵母态处于诱导条件(37℃，20％serum或Ph7)下会长出菌丝；图5c 为多菌丝态，当菌丝不能正常维持极性时，会出现两根或多根菌丝。

图6为Vps4的缺失抑制了白色念珠菌菌丝生长。图6a为使用pH诱导；图6b为 使用血清诱导。其中，T为总菌丝数；S为单菌丝数；M为多菌丝数；BWP17URA3 为野生型；v4-/-URA3为Vps4敲除型；v4-/-EQV4URA3为Vps4敲除后补充入Vps4 E235Q显性负突变体。

图7为DBeQ抑制白色念珠菌菌丝生长。图7a为使用Ph7诱导菌丝；图7b为使 用血清诱导菌丝。

图8为GFP-Cps在BWP17和vps4-/-中分布模式图。图8a为酵母型白色念珠菌； 图8b为GFP-Cps在BWP17中的分布；图8c为GFP-Cps在vps4-/-中的分布。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大肠杆菌DH5α感受态细胞是北京全式金生物技术有限公司的产品。

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞是北京全式金生物技术有限公司的产品。

白色念珠菌BWP17(营养型为arg-/his-/ura-)在文献“Wilson,R.B.,Davis,D.,and  Mitchell,A.P.1999.Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption  with short homology regions.J.Bacteriol.181(6):1868–1874.PMID:10074081”中公开过， 公众可从北京师范大学获得。

白色念珠菌vps4-/-(简写v4-/-，营养型为arg+/his+/ura-)是运用基因敲除的方法 将白色念珠菌BWP17基因组中的两个vps4拷贝敲掉，且其余基因与白色念珠菌 BWP17一致的菌株。基因敲除的方法在文献“Fonzi W.A.,and Irwin M.Y..Isogenic strain  construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics,1993,134:717-728.”中公开 过，公众可以从北京师范大学获得。

白色念珠菌BWP17URA3是将ura基因导入白色念珠菌BWP17的基因组中，且 保持白色念珠菌BWP17基因组的其他序列不变得到的菌株。白色念珠菌BWP17 URA3在文献“Tseng T L,Lai W C,Lee T L,et al.,2014,A role of Candida albicans CDC4 in the negative regulation of biofilm formation.Can.J.Microbiol.,61(4),247-255”中公开 过，公众可从北京师范大学获得。

白色念珠菌v4-/-URA3是将ura基因导入白色念珠菌vps4-/-的基因组中，保持白 色念珠菌vps4-/-基因组的其他序列不变得到的菌株，白色念珠菌v4-/-URA3在文献 “Tseng T L,Lai W C,Lee T L,et al.,2014,A role of Candida albicans CDC4in the  negative regulation of biofilm formation.Can.J.Microbiol.,61(4)，247-255”中公开过， 公众可从北京师范大学获得。

pGEX-4T-2质粒是GE公司的产品。

Pmet-GFP CIp10质粒在文献“Zheng X D,Wang Y M,Wang Y.CaSPA2is important  for polarity establishment and maintenance in Candida albicans[J].Molecular microbiology, 2003,49(5):1391-1405.”中公开过，公众可从北京师范大学获得。

Vps4E235Q显性负突变体的构建方法在文献“Besteiro S,Williams R A M, Morrison L S,et al.Endosome sorting and autophagy are essential for differentiation and  virulence of Leishmania major.J.Biol.Chem.,2006,281(16):11384-11396”中公开过，公 众可从北京师范大学获得。

Tryptone和Yeast Extract是英国Oxoid公司的产品；DTT和凝血酶是德国Merk 公司的产品；PMSF、EDTA、Acr-Bis和ATP二钠盐水合物是美国Sigma公司的产品； Agar是北京鼎国生物技术有限公司的产品；Agarose是西班牙Biowest公司的产品； DNA Marker和蛋白质Marker、Pfu DNA聚合酶是北京全式金生物技术有限公司的产 品；Glutathione Sepharose 4B是层析介质GE Heathcare公司的产品；DNA Ligase是 Takara公司的产品；DMSO(DBeQ的溶剂)是北京百灵威科技有限公司的产品；DBeQ (图2)是美国Selleck公司的产品；柠檬酸钠是美国Hampton Research公司的产品。

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠；YPD培养基：2％酵 母提取物，1％胰蛋白胨，2％葡萄糖；GMM培养基：0.67％YNB，2％葡萄糖；诱导 培养基：在YPD或GMM中加入20％小牛血清(serum)，或Ph7GMM。

Buffer A的配方：50mM Tris，300mM NaCl，1mM EDTA，HCl调pH至8.0，抽 滤，1mM DTT现用现加，0.2mM PMSF现用现加。

Buffer B的配方：50mM Tris，20mM GSH，ph8.0。

5*Assay buffer的配方：250mM Tris(ph7.4)，100mM MgCl₂.6H2O，5mM  EDTA.2Na+。

高速冷冻离心机Avanti J-25是德国BECKMAN公司的产品；超声细胞破碎仪是 美国Sonics公司的产品；TU-1800紫外-可见分光光度计是北京普析通用仪器有限公司 的产品；荧光酶标仪是德国BMG Labtech公司的产品；数控恒温槽是宁波天恒仪器厂 的产品；凝胶成像系统和PCR仪是美国Bio-Rad公司的产品；HZQ-QX全温震荡培 养箱是哈尔滨东联电子技术开发有限公司的产品；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪是BioRad 公司的产品；CA-920垂直层流洁净台是上海汇龙环境工程装备有限公司的产品；酸 度计520A是美国Orion的产品。

实施例1、DBeQ在抑制白色念珠菌Vps4蛋白中的应用

一、Vps4蛋白的表达及纯化

1、重组载体Vps4-pGEX-4T-2的构建

(1)PCR扩增

提取白色念珠菌BWP17的基因组DNA，以白色念珠菌BWP17的基因组DNA为 模板，采用Vps4-BamHI-F和Vps4-SalI-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物， 即为Vps4基因。引物序列如下：

Vps4-BamHI-F:5‘ATGGATCCAGCATGTCGGGGGCGTCTG3’；

Vps4-SalI-R:5’ATGTCGACTTAATTACCTTCTTGACCG3’。

PCR反应体系：白色念珠菌gDNA 1ul；Vps4-BamHI F 1ul；Vps4-SalI R 1ul；Pfu  DNA聚合酶1ul；Buffer 5ul；dNTP 1ul；H₂O 39ul；

PCR反应条件：95℃5min；[95℃30s，55℃30s，72℃90s]30次；72℃10min。

(2)电泳

1％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，胶回收。

(3)连接

用BamHI及SalI酶将步骤(1)得到的PCR产物双酶切，得到大小为1320bp的 PCR产物；用BamHI及SalI酶将pGEX-4T-2载体双酶切，得到大小4970bp的骨架载 体，过夜将1320bp的PCR产物和大小4970bp的骨架载体连接，得到重组载体 Vps4-pGEX-4T-2。并对其进行测序验证。

结果表明：重组载体Vps4-pGEX-4T-2为将pGEX-4T-2载体的BamHI和SalI酶切 位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的Vps4基因，保持pGEX-4T-2载体的 其他序列不变得到的载体。该载体表达的Vps4蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2 所示。

2、Vps4蛋白的获得

(1)将测序正确的重组载体Vps4-pGEX-4T-2转化BL21(DE3)感受态细胞，得到 重组菌Vps4-pGEX-4T-2/BL21(DE3)。

(2)挑含有Vps4-pGEX-4T-2/BL21(DE3)的单克隆到含有50ug/ml Amp LB培养 基中，37℃，190rpm过夜培养。

(3)将20ml过夜培养菌液加入到1L的LB培养基中，37℃，190rpm培养至 OD600＝0.6～0.8，约3～4h。

(4)向培养基中加入IPTG，终浓度为0.5mM，37℃，190rpm培养4～6h，收集 诱导后的菌液(菌体内含有高表达量的Vps4蛋白)。

3、Vps4蛋白的纯化

将诱导后的菌液6000rpm，15min离心，弃上清，收集沉淀。用80-200ml bufferA 将沉淀重悬，转移至烧杯中，沉淀量少时可减少buffer A的用量，充分吹打混匀，加 入PMSF和DTT，终浓度为0.2mM、1mM，混匀。烧杯置于冰上，进行超声破碎， 破碎4s，间隔16s，80次，450W。对破碎的菌液进行离心，12000rpm，30min，收集 上清，并将上清转移至干净烧杯中。用0.45um水系滤膜对上清进行过滤，除去细胞碎 片。采用镍柱亲和层析进行纯化，得到纯化后的Vps4蛋白，用SDS-PAGE检测Vps4 蛋白的结果如图1所示：Vps4蛋白大小为48.44kDa。

二、孔雀绿测活法鉴定DBeQ对Vps4蛋白的抑制作用

1、测活体系配制

设置如下各组测活体系：

实验组1(5nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul DBeQ (储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至25nM)混匀 得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的 终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为5nM)；

对照组1(5nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为100％DMSO 溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至25nM)混匀得到的测活体系(后续加入 10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为5nM，体系内不含蛋白)；

实验组2(10nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul  DBeQ(储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至50nM) 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为10nM)；

对照组2(10nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为 100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至50nM)混匀得到的测活体 系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为10nM， 体系内不含蛋白)；

实验组3(15nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul  DBeQ(储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至75nM) 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为15nM)；

对照组3(15nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为 100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至75nM)混匀得到的测活体 系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为15nM， 体系内不含蛋白)；

实验组4(20nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul  DBeQ(储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至100nM) 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为20nM)；

对照组4(20nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为 100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至100nM)混匀得到的测活体 系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为20nM， 体系内不含蛋白)；

实验组5(30nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul  DBeQ(储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至150nM) 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为30nM)；

对照组5(30nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为 100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至150nM)混匀得到的测活体 系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为30nM， 体系内不含蛋白)；

实验组6(40nM)：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul  DBeQ(储存母液为100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至200nM) 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM、DBeQ在体系中的终浓度为40nM)；

对照组6(40nM对照)：将30ul 5*assay buffer和10ul DBeQ(储存母液为 100％DMSO溶解浓度为5mM，使用前12％DMSO稀释至200nM)混匀得到的测活体 系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为40nM， 体系内不含蛋白)；

对照组0：将30ul Vps4蛋白(41.67nM，溶剂为5*assay buffer)和10ul 12％DMSO 混匀得到的测活体系(后续加入10ul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系 中的终浓度为25nM，体系内不含DBeQ)；

将上述各组测活体系，每个体系做4个平行。混匀后室温孵育10min。

2、测活反应

向上述各组测活体系中加入10ul 1mM的ATP(ATP终浓度为200mM)，混匀， 室温反应30min；避光加入50ul孔雀绿试剂，混匀，室温反应10min；加入10ul 0.2M 柠檬酸钠，混匀，室温反应5min；测定OD630。

3、数据处理

计算相对活性(RA，relative activity)。相对活性＝(实验组n-对照组n)/(对照 组0-对照组n)，最后用SPSS19.0分析IC50。

使用孔雀绿法可以通过测定磷酸根的浓度，来测定Vps4蛋白的ATPase的活性。 结果如图3所示：随着DBeQ浓度的增加，RA的值越来越低，进而说明DBeQ可以 抑制白色念珠菌Vps4蛋白的ATPase活性，其IC₅₀为13.325μM。

实施例2、DBeQ对白色念珠菌Cps(羧肽酶)分布的影响

白色念珠菌中含有液泡这一结构(图8a)，如果野生型的ESCRT系统完好时，细 胞表达连有绿色荧光蛋白的cps(GFP-CPS)，其液泡内会充满绿色(图8b)；如果突 变型(比如敲除Vps4)的ESCRT系统缺陷时，细胞表达连有绿色荧光蛋白的cps (GFP-CPS)不能有效的被转运进入液泡，所以只有液泡膜是绿色，而且由于细胞的 膜转运体系缺陷，在液泡膜的某处还会有积聚，显示为绿色的亮点，此结构成为E型 区域(class E compartment)(图8c)，本实施例通过研究DBeQ对白色念珠菌Cps分 布的影响，进而研究DBeQ对ESCRT系统的影响。具体步骤如下：

1、重组载体Pmet-GFP-Cps CIp10的构建

(1)以白色念珠菌BWP17gDNA为模板，采用Cps-ClaI F和Cps-PstI R引物进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即Cps基因，引物序列如下：

Cps-ClaI F：5'GCCGATCGATATGATTGGACTTCCATTG3'；

Cps-PstI R：5'CGAACTGCAGTTATTTATTGTTTGCCTTG3'。

将PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，切胶回收。

(2)用ClaI和PstI将步骤(1)得到的PCR产物双酶切，得到大小为1743bp的 PCR产物；用ClaI和PstI酶将Pmet-GFP CIp10载体双酶切，得到大小为约5500bp的 骨架载体，过夜将1743bp的PCR产物和大小为约5500bp的骨架载体连接，得到重组 载体Pmet-GFP-Cps CIp10。并对其进行测序验证。

结果表明：重组载体Pmet-GFP-Cps CIp10为将Pmet-GFP CIp10载体的ClaI和PstI 酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的Cps基因，保持Pmet-GFP CIp10 载体的其他序列不变得到的载体。

2、重组载体的线性化

用SalI内切酶将重组载体Pmet-GFP-Cps CIp10线性化，得到线性化的重组载体 Pmet-GFP-Cps CIp10。

3、重组菌的获得

采用醋酸锂法将线性化的重组载体Pmet-GFP-Cps CIp10分别转化BWP17菌株和 vps4-/-菌株，分别得到重组菌Pmet-GFP-Cps CIp10/BWP17和Pmet-GFP-Cps CIp10/ vps4-/-。

4、营养型鉴定

在GMM(arg+/his+)平板上长出的单菌落Pmet-GFP-Cps CIp10/BWP17的营养 型为arg-/his-/ura+，在GMM(0.67％YNB，2％葡萄糖)平板上长出的单菌落 Pmet-GFP-Cps CIp10/vps4-/-的营养型为arg+/his+/ura+。

5、DBeQ处理

(1)分别挑取营养型正确的单菌落Pmet-GFP-Cps CIp10/BWP17和单菌落 Pmet-GFP-Cps CIp10/vps4-/-到5ml YPD培养基中，得到含有Pmet-GFP-Cps CIp10/ BWP17的菌液和含有Pmet-GFP-Cps CIp10/vps4-/-的菌液，30℃、200rpm过夜培养。

(2)取10ul含有Pmet-GFP-Cps CIp10/BWP17的菌液和含有Pmet-GFP-Cps CIp10/ vps4-/-的菌液分别加入到1ml GMM培养基(0.67％YNB，2％葡萄糖并添加相应的氨基 酸)中，分别得到培养体系1和培养体系2，30℃水浴4h。实验组和对照组设置如下：

实验组1：向培养体系1加入3ul 10mM DBeQ(DMSO溶解)处理，DBeQ终浓 度为30uM；

对照组1：向培养体系1加入3ul 10mM DMSO处理，DMSO最终占体系总体积 的3‰；

对照组2：培养体系1；

对照组3：培养体系2。

6、检测Cps的分布

菌液离心，用适量ddH₂O重悬沉淀，取2ul滴到载玻片上，压上盖玻片制成临时 装片，荧光显微镜下观察Cps(GFP-cps)的分布。

结果如图4所示：对照组2即野生型白色念珠菌(图4a)和对照组1(图4c)中 的GFP-CPS可以正常进入液泡，所以可见充满绿色的圆形结构(即充满GFP-CPS的 液泡)；对照组3即vps4敲除菌株(图4b)中，GFP-CPS不能进入液泡并在有些液泡 膜上有积聚，所以形成绿色的环并且在部分环上有绿色的亮点；而实验组1即野生型 白色念珠菌加人30μM的DBeQ(图4d)，可见部分细胞的液泡内部为绿色，说明 GFP-CPS可以进入液泡，然而在部分细胞中也可以看到液泡膜明显形成一个绿色的 环，显示GFP-CPS不能彻底的定位到液泡中。以上结果说明：DBeQ是通过抑制Vps4 蛋白来抑制ESCRT系统功能。DBeQ可作为ESCRT系统的小分子抑制剂，用于关闭 细胞的ESCRT系统功能，从而扰乱膜转运体系，有利于ESCRT系统缺陷下的细胞行 为的研究，可作为一个细胞生物学工具用于关闭ESCRT系统以研究细胞的各类功能。

实施例3、DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用

一、菌丝的诱导

1、挑菌

由于白色念珠菌BWP17野生型本身是arg-his-ura-缺陷型，文献报道ura基因影响 出芽，为了排除ura的影响，我们选择白色念珠菌BWP17URA3和白色念珠菌v4-/- URA3作为实验对象，研究DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的作用。

分别挑取平板上的白色念珠菌BWP17URA3和白色念珠菌vps4-/-URA3单菌落 (或者-70℃甘油保存的菌株，加入到5ml YPD培养基中，分别得到白色念珠菌BWP17 URA3的菌液和白色念珠菌vps4-/-URA3的菌液，30℃、200rpm过夜摇菌。

2、菌液的处理

设置如下各组：

第一组：向白色念珠菌BWP17URA3的菌液中加入3ul 10mM的DBeQ(DMSO 溶解)，DBeQ最终浓度为30uM；

第二组：向白色念珠菌BWP17URA3的菌液中加入3ul DMSO，DMSO最终占体 系总体积的3‰；

第三组：白色念珠菌BWP17URA3的菌液；

第四组：白色念珠菌vps4-/-URA3的菌液。

3、菌丝诱导

使用20％serum诱导或Ph7诱导上述各组的菌液中菌丝的生长。具体步骤如下：

(1)20％serum诱导

取10ul的菌液加入到800ul GMM培养基(添加相应氨基酸)中，加入200ul小 牛血清，混匀，37℃水浴培养3h，得到诱导后的菌液。

(2)Ph7诱导

取10ul菌液分别加入到1000ul Ph7的GMM培养基(添加相应的氨基酸)中， 混匀，37℃水浴培养3h，分别得到诱导后的菌液。

4、制片

12000rpm、1min离心上述各组获得的诱导后的菌液，并适量ddH₂O重悬沉淀， 取2ul制成临时装片，镜下观察菌丝形态。

二、菌丝的形态观察

第三组(白色念珠菌BWP17URA3)菌丝诱导的形态观察结果如图5所示，其中， 图5a为白色念珠菌的酵母态；图5b为单菌丝态菌丝(当白色念珠菌的酵母态处于诱 导条件(37℃，20％serum或Ph7)下会长出的菌丝)；图5c为多菌丝态菌丝(当单菌 丝态菌丝不能正常维持极性时，会出现两根或多根菌丝)。

菌丝诱导率的结果如图6和图7所示：第三组和第四组的菌丝诱导率的结果如图 6所示：图6a为使用pH诱导；图6b为使用血清诱导，T为总萌发率；M为多菌丝率； S为单菌丝率；T＝M+S，从图中可以看出，如果敲除Vps4基因，其诱导菌丝的比例 明显下降(下降约40-50％)，其中，血清(serum)诱导的环境下出现较多的多菌丝态， 表明其具有维持极性的缺陷。第一组、第二组和第三组的菌丝诱导率的结果如图7所 示：图7a为使用pH诱导；图7b为使用血清诱导，从图中可以看出：加入30nM DBeQ 可以对白色念珠菌的出芽率有20％左右的抑制效率，多菌丝率有所上升但不明显。说 明DBeQ可以抑制白色念珠菌菌丝生长。