鱼类类立克次氏体特异性PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及养殖领域，具体公开了鱼类类立克次氏体特异性PCR检测试剂盒及检测方法，本发明所述的鱼类类立克次氏体的PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH

说明书

技术领域

本发明涉及养殖领域，特别涉及引起鱼类结节病类立克次氏体特异性PCR快速检测试剂盒及检测方法，即一种鱼类结节病类立克次氏体的基因检测试剂及检测方法，适用于鱼类类立克次氏体的流行病学监测、类立克次氏体的检测及基因工程技术等领域。

背景技术

对于水产养殖动物，已明确立克次氏体是具有病原学意义的，但目前尚无具体为某种立克次氏体引起水产养殖动物病害的明确记述，常以类立克次氏体(Rickettsia-like organisms，RLO)予以记述和报道。

类立克次氏体为多形性，但主要是球形的革兰氏阴性菌，直径为0.5～1.5μm，专性细胞内增生，在宿主组织细胞有膜结合的胞质空泡内复制。

1994年，Chern等曾报道，类立克次氏体于1992年10月至1993年2月间在中国台湾引起罗非鱼大批发病死亡，病变主要是所有器官存在白色结节和显微肉芽肿，脾脏肿胀。1995年姜明等在患真鲷(Pagrosomus major)病毒病的病鱼肠上皮组织中检测出类立克次氏体。2000年，Chen等报道了中国台湾养殖的石斑鱼感染了类立克次氏体。这种高致死率的病害已使中国的海水及淡水养殖业遭受了巨大损失。目前世界许多国家和地区都已发现寄生在鱼体内的类立克次氏体，感染的鱼类有罗非鱼、海鲈、石斑鱼、真鲷、虹鳟、大西洋鲑、银鲑鱼、大麻哈鱼等。

对于鱼类类立克次氏体的检测和鉴定，主要通过细胞分离培养、组织印片染色观察、组织切片、核酸探针以及免疫学的方法。但这些方法有的准确率低，有的耗时长，有的敏感性差。为了及早发现养殖鱼类是否被类立克次氏体感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鱼类类立克次氏体特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于鱼类类立克次氏体的检测。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种鱼类类立克次氏体的PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：KCl，MgCl₂，Tris-HCl，pH5.8，dNTP；

(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鱼类类立克次氏体的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物RLO-F：5’-TAGGAGATGAGCCCGCGTTG-3’，下游引物RLO-R：5’-ATTTCACATCCAACTTAATCT-3’；

(3)Taq DNA聚合酶；

(4)灭菌的ddH₂O；

(5)阳性对照液：鱼类类立克次氏体基因组DNA；

(6)阴性对照液：ddH₂O。

采用试剂盒检测鱼类类立克次氏体的方法为：

(1)鱼类类立克次氏体DNA的提取：取肝脏、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用灭菌的ddH₂O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，5U/μL Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶上，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在390bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为类立克次氏体阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的类立克次氏体。

优选的试剂盒包括：

(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：

(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鱼类类立克次氏体的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物RLO-F：5’-TAGGAGATGAGCCCGCGTTG-3’，下游引物RLO-R：5’-ATTTCACATCCAACTTAATCT-3’，浓度为10μM；

(3)Taq DNA聚合酶           5U/μL；

(4)灭菌的ddH₂O        1.0mL；

(5)阳性对照液：鱼类类立克次氏体基因组DNA；

(6)阴性对照液：ddH₂O。

采用试剂盒检测鱼类类立克次氏体的优选方法方法为：

(1)鱼类类立克次氏体DNA的提取：取50-100mg的肝脏、脾脏、肾脏组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL灭菌的ddH₂O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶上，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在390bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为类立克次氏体阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的类立克次氏体。

与现有技术相比，本发明所述的鱼类结节病病原类立克次氏体的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：

(1)本发明采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测鱼类结节病病原类立克次氏体的方法，适用于对鱼类类立克次氏体进行快速检测。

(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与鱼类类立克次氏体特异性地结合，与其他鱼类病原都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于鱼类类立克次氏体的早期监控。

附图说明

图1为感染类立克次氏体罗非鱼组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为类立克次氏体感染罗非鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为类立克次氏体；标号2为鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)；标号3为锦鲤疱疹病毒(KHV)；标号4为草鱼出血病病毒(GCRV)；标号5为鳜鱼弹状病毒(SCRV)；标号6为真鲷虹彩病毒(RSIV)；标号7为病毒性神经坏死病毒(VNNV)；标号8为病毒性出血败血症病毒(VHSV)，标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

图3为8尾患结节病杂交鳢组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-10为8尾杂交鳢组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

图4为2尾患结节病海鲈组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-4为2尾海鲈组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

图5为4尾患结节病罗非鱼组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-6为4尾罗非鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例一：鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒

本实施例所述的鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。

试剂盒由下列部分构成(9样份)：

(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：

(2)检测引物：上游引物RLO-F：5’-TAGGAGATGAGCCCGCGTTG-3’，下游引物RLO-R：5’-ATTTCACATCCAACTTAATCT-3’，浓度为10μM，上下游引物混合，400μL。

(3)Taq DNA聚合酶             5U/μL。

(4)灭菌的ddH₂O         1.0mL。

(5)阳性对照液：鱼类类立克次氏体基因组DNA。

(6)阴性对照液：ddH₂O。

(7)操作说明书一份。

(8)长方体盒子，可装上述1～7号部件，9.0×5.0×5.0cm³。

(9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。

上述阳性对照是取100mg类立克次氏体感染的罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL灭菌的ddH₂O溶解而得。

PCR扩增反应体系(20μL)为：

PCR扩增反应条件为：

95℃      5min

1个循环

95℃      30s

55℃      30s

72℃      30s

30个循环

72℃      10min

1个循环

扩增产物4℃保存。

实施例二：鱼类类立克次氏体PCR检测方法

使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取50mg待检样品，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的灭菌的ddH₂O溶解，作为PCR反应的模板。

(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(RLO-F、RLO-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

(4)反应结束后，取10μL加入2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，电泳25min后，于紫外仪上观察，若在390bp处出现明亮的反应条带，则为类立克次氏体阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中390bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。

实施例三：鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒特异性实验

使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)分别以提取的类立克次氏体、鲤疱疹病毒II型、锦鲤疱疹病毒、草鱼出血病病毒、鳜鱼弹状病毒、真鲷虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒、病毒性出血败血症病毒的核酸作为模板，进行PCR检测。

(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(RLO-F、RLO-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 5.5μL，模板3.0μL。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，电泳25min后，于紫外仪上观察，若在390bp处出现明亮的反应条带，则为类立克次氏体阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在390bp处出现明亮的反应条带，显示类立克次氏体阳性。标号2～8(分别为鲤疱疹病毒II型、锦鲤疱疹病毒、草鱼出血病病毒、鳜鱼弹状病毒、真鲷虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒、病毒性出血败血症病毒)的电泳带在390bp处无反应条带出现，显示类立克次氏体阴性。表明本发明所述的试剂盒对类立克次氏体的特异性强。

实施例四：鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒对患结节病杂交鳢的检测

使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)分别以从发病池塘中取的8尾患结节病杂交鳢组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。

(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(RLO-F、RLO-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，电泳25min后，于紫外仪上观察，若在390bp处出现明亮的反应条带，则为类立克次氏体阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

(5)实验结果分析：检测所取8尾杂交鳢中，8尾杂交鳢类立克次氏体均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为类立克次氏体，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图3。

实施例五：鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒对患结节病海鲈的检测

使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)分别以从发病池塘中取的2尾患结节病海鲈组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。

(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(RLO-F、RLO-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，电泳25min后，于紫外仪上观察，若在390bp处出现明亮的反应条带，则为类立克次氏体阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

(5)实验结果分析：检测所取2尾海鲈中，2尾海鲈类立克次氏体均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为类立克次氏体，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图4。

实施例六：鱼类类立克次氏体PCR快速检测试剂盒对患结节病罗非鱼的检测

使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)分别以从发病池塘中取的4尾患结节病罗非鱼组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。

(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(RLO-F、RLO-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，电泳25min后，于紫外仪上观察，若在390bp处出现明亮的反应条带，则为类立克次氏体阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

(5)实验结果分析：检测所取4尾罗非鱼中，4尾罗非鱼类立克次氏体均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为类立克次氏体，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图5。