提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌及应用

摘要

本发明公开了提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌及应用,重组工程菌用下述方法构建：(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，克隆lmbW基因；(2)将lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP04载体；(3)将pAP04载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌。本发明重组菌不仅使林可霉素A组份发酵效价高，而且林可霉素B组份下降。有利于简化下游分离纯化过程，降低生产成本、节能、减排，提高经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的 重组工程菌及应用。

背景技术

林可霉素是由林可链霉菌产生的的林可酰胺类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌引起 的感染性疾病。林可链霉菌发酵过程中，产生林可霉素A和B两种组份。林可霉素A组份是 药效活性组份，林可霉素B组份是副产物，其活性只有A组份的25％，且毒性较大。发酵中 产生的过量林可霉素B需要在下游分离纯化工艺中除去，才能满足药品的要求。因此提高林 可霉素A组份，减少林可霉素B组份，对林可霉素发酵工业过程是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是针对目前林可霉素生产现状，提供提高林可霉素A组份和减少林可霉素B 组份的重组工程菌。

本发明的第二个目的是提供上述提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程 菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

本发明的第三个目的是提供第二种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌。

本发明的第四个目的是提供第二种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

本发明的第五个目的是提供第三种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌。

本发明的第六个目的是提供第三种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

本发明的第七个目的是提供第四种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌。

本发明的第八个目的是提供第四种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工 程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所 示序列为下游引物，克隆lmbW基因；

(2)将lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP04载体；

(3)将pAP04载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组 份的重组工程菌。

上述一种重组工程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

第二种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.3所示序列为上游引物，以SEQ ID No.4所 示序列为下游引物，克隆metK基因；

(2)将metK基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP05载体；

(3)将pAP05载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组 份的重组工程菌。

上述第二种重组工程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

第三种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所 示序列为下游引物，克隆lmbW基因；

(2)将lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP04载体；

(3)以pAP04载体为模板，以SEQ ID No.5所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列 为下游引物，克隆lmbW基因；

(4)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.3所示序列为上游引物，以SEQ ID No.4所 示序列为下游引物，克隆metK基因；

(5)将metK基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP05载体；将步骤 (3)获得的lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pAP05载体上，构建pAP06载体；

(6)将pAP06载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少B组份的重组 工程菌。

上述第三种重组工程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

第四种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所 示序列为下游引物，克隆lmbW基因；

(2)将lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP04载体；

(3)以pAP04载体为模板，以SEQ ID No.5所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列 为下游引物，克隆lmbW基因；

(4)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.3所示序列为上游引物，以SEQ ID No.4所 示序列为下游引物，克隆metK基因；

(5)将metK基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP05载体；将步骤 (3)获得的lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pAP05载体上，构建pAP06载体；

(6)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.6所示序列为上游引物，以SEQ ID No.7所 示序列为下游引物，克隆lmbJ基因；以SEQ ID No.8所示序列为上游引物，以SEQ ID No.9 所示序列为下游引物，克隆lmbG基因；

(7)以lmbJ基因和lmbG基因为模板，以SEQ ID No.6为上游引物，以SEQ ID No.9为下游 引物，进行重叠延伸PCR，获得lmbJ-lmbG串联片段；

(8)将lmbJ-lmbG串联片段连接到pAP06载体上，构建了pAP07载体；

(9)将pAP07载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组 份的重组工程菌。

上述第四种重组工程菌在发酵提高林可霉素A组份和减少B组份的应用。

本发明重组菌不仅使林可霉素A组份发酵效价高，而且林可霉素B组份下降。有利于简 化下游分离纯化过程，降低生产成本、节能、减排，提高经济效益。

具体实施方式

本发明各实施例所使用的林可链霉菌来源于ATCC 25466，感受态大肠杆菌为感受态DH5 α。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种提高林可霉素A组份和减少B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，设计如下引物：以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以 SEQ ID No.2所示序列为下游引物，克隆lmbW基因(GenBank:EU124663.1)；

5’-GCCCAAGCTTCTTCAGACGGACCGAGGTGCC-3’(下划线处为HindIII酶切位点)；SEQ ID No.1

5’-GCCGGGATCCTCCGCGTGGTTCAGGGCACA-3’(下划线处为BamHI酶切位点)；SEQ ID No.2

50μL PCR反应体系为：10μL的5×buffer，5μL dNTPs，5μL DMSO，1μL上游 引物，1μL下游引物，1μL基因组模板，1μL聚合酶，余量用纯净水补齐。

PCR参数如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min； 4℃+∞。

扩增得到lmbW基因片段。用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。

(2)将lmbW基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体(Du,L.,Liu,R-H.,Ying, L.,Zhao,G-R.(2012)An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia  coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis.Int J Mol Sci 13,4797-4806.)上，构建了pAP04载体；

50μL酶切体系为：5μL 10×buffer，30μL质粒或基因片段，5μL限制性内切酶， 余量用纯净水补齐。37℃反应30min。反应结束后，用DNA纯化试剂盒，回收酶切产物。

用T4连接酶对基因片段和载体片段进行连接，22℃反应30min。

连接产物转化感受态大肠杆菌，在LB固体培养基，加入安普霉素抗生素，混匀，铺平板。 37℃培养，培养过夜，筛选阳性转化子。将构建好的载体用测序，确保序列的正确性。

(3)将pAP04载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素 B组份的重组工程菌。

筛选步骤为：按照链霉菌遗传转化的常规方法，包括原生质体转化或大肠杆菌-链霉菌结 合转移方法，将pAP04载体转化到林可链霉菌中。用安普霉素抗生素，筛选获得重组菌株。 繁殖孢子，用20％甘油，在-80℃保存。

实施例2

第二种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，设计如下引物：以SEQ ID No.3所示序列为上游引物，以 SEQ ID No.4所示序列为下游引物，克隆metK基因(GenBank：KP225159)；

5’-ACGCAAGCTTGTGTCCCGTCGTCTGTTCAC-3’(下划线处为HindIII酶切位点)；SEQ ID No.3

5’-GCCGGAATTCGGGGCACCGCGTAGTCGAAGTA-3’(下划线处为EcoRI酶切位点)；SEQ ID No.4

PCR反应体系和参数设置同实施例1(其中引物不同)。

扩增得到metK基因片段。用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。

(2)将metK基因以酶切连接的方式，连接到pUWL201apr载体上，构建pAP05载体。

酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。

(3)将pAP05载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组 份的重组工程菌。

筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。

实施例3

第三种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以实施例1获得的pAP04载体为模板，以SEQ ID No.5所示序列为上游引物，以SEQ ID  No.2所示序列为下游引物，克隆lmbW基因；

5’-GCCGGAATTCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTG-3’(下划线处为EcoRI酶切位点)；SEQ ID No.5  PCR反应体系和参数设置同实施例1(其中引物和模板不同)。

扩增得到lmbW基因片段，用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。

(2)将获得的lmbW基因以酶切连接的方式，连接到实施例2获得的pAP05载体上，构建了 metK和lmbW串联的pAP06表达载体。

酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。

(3)将pAP06载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组 份的重组工程菌。

筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。

实施例4

第四种提高林可霉素A组份和减少林可霉素B组份的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以林可链霉菌基因组为模板，以SEQ ID No.6所示序列为上游引物，以SEQ ID No.7所 示序列为下游引物，PCR扩增lmbJ基因片段；以SEQ ID No.8所示序列为上游引物，以SEQ ID  No.9所示序列为下游引物，克隆lmbG基因片段；

5’-GAAGATCTGACTGTCCCTCGCGTCCCA-3’(下划线处为BglII酶切位点)；SEQ ID No.6

5’-GTTGTGGGGTGGTCAGCCAGTCTCCTCGGCGGTGGTGTC-3’；SEQ ID No.7

5’-GACACCACCGCCGAGGAGACTGGCTGACCACCCCACAAC-3’；SEQ ID No.8

5’-GGACTAGTCAGGTACAGCGGCAGACGG-3’(下划线处为SpeI酶切位点)；SEQ ID No.9

PCR反应体系同实施例1(其中引物不同)。

PCR参数如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min； 4℃+∞。

扩增得到lmbJ和lmbG基因片段，用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。

(2)以片段lmbJ和lmbG为模板，以SEQ ID No.6为上游引物，以SEQ ID No.9为下游引物， 进行重叠延伸PCR，获得lmbJ-lmbG串联片段。用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。

(3)将lmbJ-lmbG串联片段连接到实施例3获得的pAP06上，构建了载体pAP07。

用SpeI和BamHI载体pAP06进行酶切，用SpeI和BglII对片段lmbJ-lmbG进行酶切60min， 分别纯化回收。

由于BglII与BamHI是同尾酶，将纯化后的载体片段和片段lmbJ-lmbG，用T4连接酶进 行连接。

连接产物转化感受态大肠杆菌，在LB固体培养基，加入安普霉素抗生素，混匀，铺平板。 37℃培养，培养过夜，筛选阳性转化子。将构建好的载体用测序，确保序列的正确性。

(4)将pAP07载体转化到林可链霉菌，筛选，获得提高林可霉素A组份和减少林可霉素 B组份的重组工程菌。

筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。

实施例5

实施例1、实施例2、实施例3、实施例4获得的重组工程菌的发酵与HPLC测定

按照常规链霉菌的发酵工艺，制备平板孢子、液体种子，转接到发酵培养基中。在30℃， 250r/min培养7天，结束发酵。

取第7天重组工程菌发酵液，离心，取上清液。加入甲醇，震荡混合。离心，取上清， 用0.45μm F膜过滤，用于HPLC分析。

林可霉素HPLC检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.005mol/L乙酸铵溶液(用 氨水溶液调节pH值至9.0)-甲醇(5:5)为流动相；检测波长为214nm；柱温25℃；流速 1.0mL/min。

发酵培养基配方(质量百分比)：10％葡萄糖，2％黄豆粉，0.15％玉米浆，0.8％硝酸钠， 0.5％氯化钠，0.03％硫酸铵，0.03％磷酸氢二钾，0.8％碳酸钙，调节pH至7.1，余量为纯净水。

各重组工程菌的发酵结果见表1。

表1 重组工程菌的发酵效价