原油污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法

摘要

本发明涉及原油污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法。在石油勘探、开采、储存、运输、加工、销售等过程中，经常发生原油泄漏、污染农田、河流和水源的事故，石油污染导致土壤生态系统破坏。本发明在专用液体发酵培养基中培养食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70和乙酸钙不动杆菌BS6，收集发酵液离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞，加入甘油和硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。本发明是一种高效、经济的环境友好型土壤修复技术，石油降解率均可达到85%以上，具有处理成本低、施工简单、无二次污染、对环境影响小等优点。

说明书

技术领域

    本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及一种原油污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法。

背景技术

在石油勘探、开采、储存、运输、加工、销售等过程中，经常发生原油泄漏、污染农田、河流和水源的事故，石油污染导致土壤生态系统破坏，危害植物无法生长，轻度则其有毒物能通过农作物、地下水进入食物链系统，最终直接危害人体的健康。石油污染土壤修复涉及到环境科学、环境工程、微生物学、土壤学、生态学、地理学、植物学、分子生物学、地质学、植物营养学、农学等20多个专业领域。微生物修复是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、清除或降解石油，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。该技术已被应用于石油污染处理表现出了良好的应用价值，国内外专家学者认为是生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术，无二次污染等特点，是石油污染修复的主要发展方向，也是解决石油污染土壤生态修复的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种原油污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法，通过生物修复的方式对原油污染土壤进行有效修复。

本发明所采用的技术方案是：

原油污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤一：发酵：

调节液体发酵培养基A的pH至6.0-6.5，并进行常规无菌处理，按液体质量6-9%无菌操作接入食烷烃戈登氏菌NR 39，恒定温度30±1℃，搅拌速度200-240rpm，通风量0.27-0.30M³/min，罐压0.07-0.08MPa，发酵4小时后按照液体质量6-9%无菌操作接入友好戈登氏菌NR 70，随后两菌共同持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0-3.0×10⁷个/mL时终止发酵；

调节液体发酵培养基B的pH至6.0-6.5，并进行常规无菌处理，按液体重量6-9%无菌操作接入乙酸钙不动杆菌BS6, 恒定温度30±1℃，搅拌速度200-240rpm，通风量0.27-0.30M³/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0-3.0×10⁷个/mL时终止发酵；

步骤二：菌体细胞分离：

分别收集步骤一液体发酵培养基A的食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70的混合发酵液和液体发酵培养基B的乙酸钙不动杆菌BS6发酵液，酵母分离离心机离心分离除去发酵液中水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞；

步骤三：制剂制取：

在步骤二获得的浅红色粘稠状菌体细胞中，按照菌体：甘油体积比1: （0.8-1.2）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土体积比1：（0.6-1)的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。

步骤一中的食烷烃戈登氏菌NR 39（Gordonia alkanivorans）于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9935，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

步骤一中的友好戈登氏菌NR 70（Gordonia amicalis）于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9932，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

步骤一中的乙酸钙不动杆菌BS6（Acinetobacter calcoaceticus）于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9944，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

步骤一中的液体发酵培养基A的配方如下：

甘油 16-20g/L，大豆油 8-10 g/L，蛋白胨 18-22g/L，葡萄糖 4-6 g/L，K₂HP0₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2-1.5 g/L，吐温80 2-4 ml/L，生物素 3μg/L，腺嘌呤 5-10mg/L，余量水定容至1L。

步骤一中的液体发酵培养基B的配方如下：

酵母粉 5-8g/L，可溶性淀粉 8-10 g/L，蛋白胨 11-13 g/L，葡萄糖 6-8 g/L，K₂HP0₄ 0.75-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0-1.5 g/L，吐温80 2-4 ml/L，生物素 2-6μg/L，余量水定容至1L。

如所述的原油污染土壤复合微生物修复剂的制备方法制得的原油污染土壤复合微生物修复剂。

本发明具有以下优点：

本发明是一种高效、经济的环境友好型土壤修复技术，核心技术是高效降解菌株的筛选和功能菌剂的制备，食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70、乙酸钙不动杆菌BS6的石油降解率均可达到85%以上。本发明操作简单、修复效果好、成本费用低、不破坏地面设施的土壤修复技术，相比其他方法具有处理成本低、施工简单、无二次污染、对环境影响小等优点。对维持土壤的生态平衡和保护地下水资源具有良好效果。生物修复技术在石油产区环境污染的应用，节约企业环境治理成本。同时，对于保护生态环境，解决能源产业发展与环境保护工作矛盾，推动石油化工产业绿色化可持续发展具有良好的经济、社会效益。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的原油污染土壤复合微生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：发酵：

调节液体发酵培养基A的pH至6.0-6.5，并进行常规无菌处理，按液体质量6-9%无菌操作接入食烷烃戈登氏菌NR 39，恒定温度30±1℃，搅拌速度200-240rpm，通风量0.27-0.30M³/min，罐压0.07-0.08MPa，发酵4小时后按照液体质量6-9%无菌操作接入友好戈登氏菌NR 70，随后两菌共同持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0-3.0×10⁷个/mL时终止发酵；

调节液体发酵培养基B的pH至6.0-6.5，并进行常规无菌处理，按液体重量6-9%无菌操作接入乙酸钙不动杆菌BS6, 恒定温度30±1℃，搅拌速度200-240rpm，通风量0.27-0.30M³/min，罐压0.07-0.08MPa，持续发酵72-76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0-3.0×10⁷个/mL时终止发酵。

液体发酵培养基A的配方如下：

甘油 16-20g/L，大豆油 8-10 g/L，蛋白胨 18-22g/L，葡萄糖 4-6 g/L，K₂HP0₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2-1.5 g/L，吐温80 2-4 ml/L，生物素 3μg/L，腺嘌呤 5-10mg/L，余量水定容至1L。

液体发酵培养基B的配方如下：

酵母粉 5-8g/L，可溶性淀粉 8-10 g/L，蛋白胨 11-13 g/L，葡萄糖 6-8 g/L，K₂HP0₄ 0.75-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0-1.5 g/L，吐温80 2-4 ml/L，生物素 2-6μg/L，余量水定容至1L。

步骤二：菌体细胞分离：

分别收集步骤一液体发酵培养基A的食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70的混合发酵液和液体发酵培养基B的乙酸钙不动杆菌BS6发酵液，酵母分离离心机离心分离除去发酵液中水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞。

步骤三：制剂制取：

在步骤二获得的浅红色粘稠状菌体细胞中，按照菌体：甘油体积比1: （0.8-1.2）的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土体积比1：（0.6-1)的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。

步骤一中的食烷烃戈登氏菌NR 39于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9935。

步骤一中的友好戈登氏菌NR 70于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9932。

步骤一中的乙酸钙不动杆菌BS6于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9944。

实施例1：

步骤一：发酵：

调节液体发酵培养基A的pH至6.0，并进行常规无菌处理，按液体质量9%无菌操作接入食烷烃戈登氏菌NR 39，恒定温度29℃，搅拌速度240rpm，通风量0.27M³/min，罐压0.08MPa，发酵4小时后按照液体质量6%无菌操作接入友好戈登氏菌NR 70，随后两菌共同持续发酵76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×10⁷个/mL时终止发酵；

调节液体发酵培养基B的pH至6.5，并进行常规无菌处理，按液体重量6%无菌操作接入乙酸钙不动杆菌BS6, 恒定温度31℃，搅拌速度200rpm，通风量0.30M³/min，罐压0.07MPa，持续发酵76hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×10⁷个/mL时终止发酵。

液体发酵培养基A的配方如下：

甘油20g/L，大豆油 8 g/L，蛋白胨22g/L，葡萄糖 4 g/L，K₂HP0₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，吐温80 2 ml/L，生物素 3μg/L，腺嘌呤10mg/L，余量水定容至1L。

液体发酵培养基B的配方如下：

酵母粉 5g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨 11 g/L，葡萄糖8 g/L，K₂HP0₄ 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，吐温80 2 ml/L，生物素6μg/L，余量水定容至1L。

步骤二：菌体细胞分离：

分别收集步骤一液体发酵培养基A的食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70的混合发酵液和液体发酵培养基B的乙酸钙不动杆菌BS6发酵液，酵母分离离心机离心分离除去发酵液中水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞。

步骤三：制剂制取：

在步骤二获得的浅红色粘稠状菌体细胞中，按照菌体：甘油体积比1: 0.8的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土体积比1： 1的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。

实施例2：

步骤一：发酵：

调节液体发酵培养基A的pH至6.2，并进行常规无菌处理，按液体质量7%无菌操作接入食烷烃戈登氏菌NR 39，恒定温度30℃，搅拌速度220rpm，通风量0.28M³/min，罐压0.07MPa，发酵4小时后按照液体质量7%无菌操作接入友好戈登氏菌NR 70，随后两菌共同持续发酵74hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.5×10⁷个/mL时终止发酵；

调节液体发酵培养基B的pH至6.2，并进行常规无菌处理，按液体重量7%无菌操作接入乙酸钙不动杆菌BS6, 恒定温度30℃，搅拌速度220rpm，通风量0.28M³/min，罐压0.07MPa，持续发酵74hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达2.5×10⁷个/mL时终止发酵。

液体发酵培养基A的配方如下：

甘油 18g/L，大豆油 9 g/L，蛋白胨 20g/L，葡萄糖 5 g/L，K₂HP0₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3g/L，吐温80 3 ml/L，生物素 3μg/L，腺嘌呤 7mg/L，余量水定容至1L。

液体发酵培养基B的配方如下：

酵母粉 6g/L，可溶性淀粉 9 g/L，蛋白胨 12 g/L，葡萄糖 7 g/L，K₂HP0₄ 0.85g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2 g/L，吐温80 3 ml/L，生物素 4μg/L，余量水定容至1L。

步骤二：菌体细胞分离：

分别收集步骤一液体发酵培养基A的食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70的混合发酵液和液体发酵培养基B的乙酸钙不动杆菌BS6发酵液，酵母分离离心机离心分离除去发酵液中水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞。

步骤三：制剂制取：

在步骤二获得的浅红色粘稠状菌体细胞中，按照菌体：甘油体积比1: 1的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土体积比1：0.8的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。

实施例3：

步骤一：发酵：

调节液体发酵培养基A的pH至6.5，并进行常规无菌处理，按液体质量6%无菌操作接入食烷烃戈登氏菌NR 39，恒定温度31℃，搅拌速度200rpm，通风量0.30M³/min，罐压0.07MPa，发酵4小时后按照液体质量9%无菌操作接入友好戈登氏菌NR 70，随后两菌共同持续发酵72hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达3.0×10⁷个/mL时终止发酵；

调节液体发酵培养基B的pH至6.0，并进行常规无菌处理，按液体重量9%无菌操作接入乙酸钙不动杆菌BS6, 恒定温度29℃，搅拌速度240rpm，通风量0.27M³/min，罐压0.08MPa，持续发酵72hr，显微镜检测计数发酵液中细胞数达3.0×10⁷个/mL时终止发酵。

液体发酵培养基A的配方如下：

甘油 16g/L，大豆油10 g/L，蛋白胨 18g/L，葡萄糖6 g/L，K₂HP0₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2 g/L，吐温80 4 ml/L，生物素 3μg/L，腺嘌呤 5mg/L，余量水定容至1L。

液体发酵培养基B的配方如下：

酵母粉8g/L，可溶性淀粉 8 g/L，蛋白胨13 g/L，葡萄糖 6 g/L，K₂HP0₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，吐温80 4 ml/L，生物素 2μg/L，余量水定容至1L。

步骤二：菌体细胞分离：

分别收集步骤一液体发酵培养基A的食烷烃戈登氏菌NR 39、友好戈登氏菌NR 70的混合发酵液和液体发酵培养基B的乙酸钙不动杆菌BS6发酵液，酵母分离离心机离心分离除去发酵液中水，把离心获得的两种粘稠状菌体充分搅拌混合均匀，获得浅红色粘稠状菌体细胞。

步骤三：制剂制取：

在步骤二获得的浅红色粘稠状菌体细胞中，按照菌体：甘油体积比1: 1.2的比例加入甘油，并搅拌混合均匀，再按照菌体：硅藻土体积比1： 0.6的比例加入细度为300目硅藻土，搅拌混合均匀，获得淡粉色固体制剂即目的产品。

采用上述方法制得的修复剂的石油降解率可达到85%以上。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。