一套用于炭疽杆菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于炭疽杆菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明中公开了可用作炭疽杆菌实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸和DNA构建物PA和capA。本发明的质粒标准分子解决了炭疽杆菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证炭疽杆菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为炭疽杆菌实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于炭疽杆 菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。

背景技术

炭疽杆菌(Bacillus anthraci)归属于芽胞杆菌属(Bacillus)。炭疽杆菌能引 起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之 一。平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染，故已引起世界多国相关 部门的重视。

目前炭疽杆菌的检测方法分为两类,一类是传统的培养及其改进方法，依 赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差；一类是聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光 PCR方法，主要是针对炭疽杆菌区别于芽胞杆菌属其它细菌的多个靶基因，选 择特异序列，建立PCR以及实时荧光PCR方法。炭疽杆菌PCR相关检测方法近 年来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为食源性病原微生物 的可靠检测方法。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分 子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分 析的标准品，构建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标 准物质得到了越来越多的深入研究和应用，但是针对炭疽杆菌实时荧光PCR检 测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实际炭疽杆菌实时荧光PCR时，各单 位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异 性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造 成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。

发明内容

本发明的目的在于提供一套适用于炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒 标准分子及其应用。

本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含炭疽 杆菌的大分子毒素基因PA基因序列和/或炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基 因序列。

在另一优选例中，所述炭疽杆菌大分子毒素基因PA的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％) 的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:3所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 SEQ ID NO.:3所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100 ％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列选自下 组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％) 的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 SEQ ID NO.:1所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100 ％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸含有炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因 序列和炭疽杆菌的大分子毒素基因PA序列，以及任选地连接两种基因序列的接 头序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包 含本发明第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子 序列和/或载体序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物中包含炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA 基因序列和炭疽杆菌的毒素PA的基因序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。

在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为炭疽杆菌检测的标准分子(质 粒标准分子)。

在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19， pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK和pGEM。

在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQ ID NO：2或4所示。

本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方 面所述的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增炭 疽杆菌大分子毒素基因PA的基因序列。

在另一优选例中，特异性扩增炭疽杆菌大分子毒素基因PA的基因序列的所 述的引物对选自下组：

SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物对；

SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物对；

SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对；和

SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示的引物对。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述所述引物对特异性扩 增炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列。

在另一优选例中，特异性扩增炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列的 引物对选自下组：

SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的引物对；

SEQ ID NO.:16和SEQ ID NO.:17所示的引物对；和

SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的引物对。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序 列如SEQ ID NO.:13所示。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序 列如SEQ ID NO.:20所示。

本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第 二方面所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在 于，用于炭疽杆菌的检测。

在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。

在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。

本发明的第五方面，提供了一套炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测方法，所 采用的标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述 的DNA构建物。

本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：

(i)炭疽杆菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷 酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物；

(ii)特异性扩增炭疽杆菌序列的引物对，所述引物对为：

SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对；和/或

SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的序列构成的引物对。

在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合(combination)，较佳地所 述组分(i)和(ii)是各自独立的。

在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。

本发明的第七方面，提供了一套炭疽杆菌的质粒标准分子的制备方法，包 括以下步骤：

①人工合成炭疽杆菌的毒素PA基因序列和/或炭疽杆菌的大分子荚膜基因 capA基因序列，所述炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列和所述毒素PA 表达基因序列分别如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO：3所示；

②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到炭疽杆菌的质粒标准分 子。

在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19，pUC18，pUC118， pUC119，pBlueScript II SK或pGEM。

在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明质粒标准分子PA的图谱。

图2是本发明所得质粒标准分子PA稳定性检测结果图。

图3是利用本发明质粒标准分子PA建立的实时荧光PCR标准曲线。

图4是本发明质粒标准分子capA的图谱。

图5是本发明所得质粒标准分子capA稳定性检测结果图。

图6是利用本发明质粒标准分子capA建立的实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于炭疽杆菌PCR检测的 多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒 将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧 光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的炭疽杆菌实时荧光PCR检测 方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于炭疽杆菌 实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法 和应用。

检测菌株

炭疽(anthrax)由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的人兽共患病,是 牧区食草动物的一种常见疾病。炭疽芽胞杆菌与其他同源蜡样杆菌属的区别在于 两个毒性质粒,即编码炭疽毒素的pXO1质粒和编码荚膜合成酶的pXO2质粒。由 于炭疽芽孢在环境中抵抗力极强,在军事上一直被列为是头号生物战剂。快速检 验和鉴定炭疽芽孢杆菌无论是对人和食草动物炭疽病诊断还是应对可能出现的生 物恐怖袭击都十分重要。

近年发展起来的定量PCR检验诊断技术为快速诊断该病提供了手段。本研究 采用TaqMan实时荧光定量PCR技术,以pXO1质粒上的PA基因、pXO2质粒上 的capA基因。因此，它们可以作为炭疽杆菌菌种检测的关键基因。

实时荧光PCR检测炭疽杆菌的原理

采用实时荧光PCR技术可特异性扩增炭疽杆菌基因组DNA中毒素PA基因 序列或炭疽杆菌大分子荚膜基因capA基因序列，设计针对以上靶基因的引物 和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光 信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增 已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)。PCR方法中，阳性标准物质(或 阳性标准分子)可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质(或阳性 标准分子)可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应 基因的绝对含量(拷贝数或浓度)。

标准物质

标准物质是具有一套或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设 备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。

质粒标准分子

本发明中涉及两种检测炭疽杆菌的特异性序列并在此基础上设计了两种 质粒标准分子，一种炭疽杆菌的特异性序列是炭疽杆菌毒素PA基因，长度为 2227bp；另一套炭疽杆菌的特异性序列是炭疽杆菌大分子荚膜基因capA基因， 长度为1236bp。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一套炭疽杆菌的质粒标 准分子，该质粒标准分子包含炭疽杆菌大分子荚膜基因capA基因序列，所述炭 疽杆菌大分子荚膜基因capA基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示：

(SEQ ID NO.:1)。

本发明的质粒标准分子，较佳地含有炭疽杆菌的PCR检测的靶基因炭疽杆 菌大分子荚膜基因capA基因序列。

本发明中所述的炭疽杆菌大分子荚膜基因capA基因，在DNA、RNA和蛋白 质的合成中起作用，它可作为炭疽杆菌检测的一套靶基因，所述炭疽杆菌大分 子荚膜基因capA基因的序列较佳的如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO：2所示，其中第402 位到第1637位为capA基因序列：

(SEQ ID NO.:2)。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一套炭疽杆菌的质粒 标准分子，该质粒标准分子包含炭疽杆菌毒素PA表达基因序列，所述炭疽杆 菌毒素PA表达基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示：

(SEQ ID NO.:3)。

本发明的质粒标准分子，较佳地含有炭疽杆菌的PCR检测的靶基因炭疽杆 菌毒素PA表达基因序列。

本发明中所述的炭疽杆菌毒素PA表达基因，在DNA、RNA和蛋白质的合成 中起作用，它可作为炭疽杆菌检测的一套靶基因，所述炭疽杆菌毒素PA的序 列较佳的如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的另一个较佳的实施方式中，本发明所述的质粒标准分子的序列 如SEQ ID NO：4所示，其中第423位到第2649位为PA基因序列：

(SEQ ID NO.:4)。

在本发明的另一较佳的实施方式中，根据本发明的质粒标准分子中含有炭 疽杆菌大分子荚膜基因capA基因序列和炭疽杆菌毒素PA基因序列。较佳地， 所述capA序列如SEQ ID NO.:1所示，所述PA序列如SEQ ID NO.:3所示。

本发明中如上所述炭疽杆菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步 骤：

①提取质粒标准分子；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准 分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离 子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤 ③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标 准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却 气流量较佳地为10L/min～25L/min，最佳地为16.86L/min，辅助气流量较佳 地为0.5L/min～3.0L/min，最佳地为0.88L/min，雾化气流量为较佳地为0.5 L/min～2.43L/min，更佳地为1.123L/min，功率较佳地为1200W～1400W，最 佳地为1350W。

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分 辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

具体实施说明：

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分 辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区 域)，记录仪器读数。

④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和 280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为 ng/μL。

(2)HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的 磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲 线。

④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷 含量。

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。

本发明还提供了一套炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标 准物质是如上所述的质粒标准分子。

本发明还提供了一套如上所述的炭疽杆菌的质粒标准分子的制备方法，包 括以下步骤：

①人工合成所述炭疽杆菌的特异性序列，所述序列如SEQ ID NO：1和/ 或3所示；

②将步骤①所得炭疽杆菌的序列克隆至克隆载体上，得到炭疽杆菌的质粒 标准分子。

其中步骤①所述的人工合成的方法较佳地为：全基因合成或者PCR引物扩 增的方法获得该序列。

本发明所述质粒标准分子构建方法较佳地包括以下步骤：

①NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Genbank中查询炭疽杆菌的大分 子毒素基因PA基因和/或大分子荚膜基因capA基因；

②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位 点加至所选择序列的5’端和3’端。

③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、 DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子。

所述的质粒载体可以是常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大 肠杆菌中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：pUC19，pUC18，pUC118， pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19克隆载体。

④测序验证质粒标准分子的序列。

⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。

所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧 光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒标准分子作 为实时荧光PCR方法检测炭疽杆菌的标准物质的能力。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种检测炭疽杆菌的试 剂盒，所述试剂盒中包括：

标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO.:3和/或SEQ ID NO.:1所示的 多核苷酸；

优选地，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ  ID NO.:3所示的序列，所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；

和/或，

所述试剂盒中还包括用于特异性扩增SEQ ID NO.:1所示序列的引物序列， 所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:15所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:16和SEQ ID NO.:17所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括探针序列，所述探针序列分别针对 炭疽杆菌大分子毒素基因PA基因和/或炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因。

在另一优选例中，所述探针序列如SEQ ID NO.:13和/或SEQ ID NO.:20所 示。

在另一优选例中，所述标准分子为质粒标准分子，分别SEQ ID NO.:2或 SEQ ID NO.:4所示的序列。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明 各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的主要优点在于：

(1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的 优点，同时本发明解决了炭疽杆菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题， 保证炭疽杆菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为炭疽杆菌实时荧光PCR 方法检测提供质量控制；

(2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实 时荧光PCR检测炭疽杆菌时，特异性强，灵敏度高，线性稳定。

(3)本发明提供的试剂盒中包含了检测炭疽杆菌的致质粒标准分子(携带 毒素PA基因的PA质粒标准分子)和/或质粒标准分子(携带大分子荚膜基因 capA基因的capA质粒标准分子)，

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold  Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本文中所涉及的生 物材料和试剂，如无特别说明，均可自市售渠道获得。

实施例1 质粒标准分子的构建

实验试剂和实验仪器：

质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，其它生化试剂均为进口分装或国产分析 纯生化试剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。

实验方法包括以下步骤：

1、在GenBank中搜索炭疽杆菌的基因毒素PA基因序列；

2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，基因毒素 PA基因序列长度为2227bp，两端加上BamHI酶切位点；

3、将处理后的序列送至宝生物工程(大连)有限公司，由其负责进行全 基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得 基因毒素PA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，将所得全长基因克隆 至质粒载体pUC19(购自TAKARA公司)中，构建获得包含OMPW基因序列的质粒 标准分子PA(其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示)，构建所得质粒标准分子 PA的质粒图谱如图1所示。

4、大量培养含有包含所得质粒标准分子PA的重组大肠杆菌，利用质粒大 量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子PA。经过紫外 分光光度计以及电泳进行纯度分析，之后质粒DNA标准分子置于-20℃保存， 抽提质粒的方法包括以下步骤：

a、将100～200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上 清；

b、加入12mL SolutionⅠ(含有RNase A)，振荡充分混匀；

c、加入12mL SolutionⅡ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体 充分裂解；

d、加入16mL SolutionⅢ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的 白色沉淀；

e、≥12000×g，4℃离心10分钟；

f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL 收集管中)，5000×g室温离心5分钟；

g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室 温离心5分钟；

h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释) 清洗吸附柱；

i、重复上述清洗步骤；

j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；

k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3mLTE缓冲液，室 温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的 质粒标准分子溶液，保存在-20℃。

5、测序验证质粒标准分子PA

将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分 别为北京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍 捷基(上海)贸易有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术 有限公司、上海生工生物技术有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生 物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来说，序列长度与定量有直接关 系，8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于定值的要求。详 见ISO导则35，标准物质定值部分的具体要求。

序列考察公式：序列正确率＝正确碱基数目/碱基总数

测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100％，该质 粒序列中的第423位到第2649位为基因毒素PA基因。

实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取 等步骤得到高纯度的质粒标准分子PA经测序验证，该质粒标准分子插入片段 序列与设计完全相符。

采用上述相同的方法，构建capA质粒，将所得基因大分子荚膜基因capA基 因序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)，克隆至质粒载体pUC19中，构建获得包 含capA基因序列的质粒标准分子capA(其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示)， 构建所得质粒标准分子capA的质粒图谱如图4所示。经测序验证，该质粒标准 分子插入片段序列与设计完全相符。

实施例2 质粒标准分子PA和capA的均匀性检验

均匀性是表征物质中一套或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通 过测量取自不同包装单元(如瓶、包等)或取自同一包装单元不同位置的规定 大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定 的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的 空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证 明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其量值不会受到分装等 因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求， 从各质粒DNA标准物质中随机抽取15瓶。

2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分 光光度重复测定3次，取平均值。

3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为： 抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著 性差异，则应满足下式的统计要求。

$F=\frac{\frac{Q_1}{v_1}}{\frac{Q_2}{v_2}}\le F_{\alpha }({\nu }_1,{\nu }_2)$

其中组间差方和计算公式为：

$Q_1=\underset{i=1}{\overset{m}{\Sigma }}{n}_i{(\overline{x_i}-\overline{\stackrel{‾}{x}})}^2$

组内差方和计算见公式为：

$Q_2=\underset{i=1}{\overset{m}{\Sigma }}\underset{j=1}{\overset{nj}{\Sigma }}{(x_{ij}-{\bar{x}}_i)}^2$

ν₁＝m-1(组间自由度)

ν₂＝N-m(组内自由度)。

实验结果：

1、质粒标准分子PA和capA的均匀性检验结果分别如表1－4所示

表1 质粒标准分子PA均匀性检验数据(单位：ng/μL)

表2 质粒标准分子PA的均匀性统计结果

PA的均匀性统计结果见表2，在95％置信水平下，F值小于F_0.05(14，30)， 证明该质粒标准分子PA是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》 均匀检验合格要求。

表3 质粒标准分子capA均匀性检验数据(单位：ng/μL)

表4 质粒标准分子capA的均匀性统计结果

capA的均匀性统计结果见表3，在95％置信水平下，F值小于F_0.05(14，30)， 证明该质粒标准分子capA是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》 均匀检验合格要求。

实施例3 质粒标准分子PA和capA的稳定性考察

稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规 定范围内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随 时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过 程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不 确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。稳定性良好的质粒标准分子，其 特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推移而改变，检测结果不会 受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样 品在相同条件下随着时间的推移进行测量。

1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、4 个月、7个月、10个月、12个月对制备的质粒标准分子(PA在-80℃保存，capA 在-20℃保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期 稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法对质粒标准分子进行了跟踪考察。

2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如 下：

直线斜率可用下式计算：

${\beta }_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}(X_i-\bar{X})(Y_i-\bar{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(X_i-\bar{X})}^2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；——所有 时间点的平均值；——所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

${\beta }_0=\bar{Y}-{\beta }_1\bar{X}$

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

$s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(Y_i-{\beta }_0-{\beta }_1{X}_i)}^2}{n-2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；β₁，β₀—— 回归系数；n——测量系数。

β₁的标准偏差由下式给出：

$s\left({\beta }_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(X_i-\bar{X})}^2}}$

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若 |β₁|＜t_0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

实验结果：

1、质粒标准分子PA稳定性考察结果如表5和图2所示，：

表5 质粒标准分子PA的稳定性监测数据(单位：ng/μL)

统计结果如表6所示。

表6 质粒标准分子PA的稳定性统计结果

由统计结果可知，质粒标准分子PA在-20度条件下保存12个月是稳定的。

2、质粒标准分子capA稳定性考察结果如表7和图5所示：

表7 质粒标准分子capA的稳定性监测数据(单位：ng/μL)

统计结果如表8所示。

表8 质粒标准分子capA的稳定性统计结果

由统计结果可知，质粒标准分子capA在-20℃条件下保存12个月是稳定 的。

实验例4 用紫外分光光度法对质粒标准分子进行定量

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法包括以下步骤：

1、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

2、取实施例制备所得DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；

3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。

4、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果：

1、经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子PA的浓度如表9所示：

表9 紫外分光光度法定值结果(单位：ng/μL)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD PA 65.7 66.1 66.6 66.6 66.7 67.2 67.2 67.3 66.7 0.57

2、经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子capA的浓度如表5所示：

表10 紫外分光光度法定值结果(单位：ng/μL)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD capA 33.2 29 30 31.1 31.3 31.5 31.6 33 31.3 1.40

实施例5 用HR-ICP-MS对质粒标准分子PA和capA进行定量

实验试剂为P标准溶液(NIST，SRM3139a)。实验仪器为：电感耦合等离 子体发射质谱仪(Thermofisher element2)。

实验方法包括以下步骤：

1、根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元素的含 量；

2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为 1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。

3、配制梯度浓度的磷标准溶液(0、1、2、3、4、5g/L)，并用此标 准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；

4、将质粒标准分子稀释3000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标准分子， 并根据标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；

5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子的浓度；

6、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果：

1、经计算，质粒标准分子PA的磷元素的含量为10.22％。经过HR-ICP-MS 定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表11所示，稀释倍数为2000，换算 得到质粒分子的质量浓度，如表12所示。

表11 质粒标准分子PA的磷元素含量(单位：μg/L)

表12 质粒标准分子PA的质量浓度结果(单位：ng/μL)

2、经计算，质粒标准分子capA的磷元素的含量为10.20％。经过HR-ICP-MS 定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表13所示，稀释倍数为2000，换算得 到质粒分子的质量浓度，如表14所示。

表13 质粒标准分子capA的磷元素含量(单位：μg/L)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD capA 1.79 1.55 1.71 1.71 1.69 1.6 1.63 1.74 1.7 0.08

表14 质粒标准分子capA的质量浓度结果(单位：ng/μL)

质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD capA 35.1 30.4 33.5 33.5 33.1 31.4 32.0 34.1 32.9 1.53

实施例6 研制的质粒标准分子PA和capA在实时荧光PCR检测中的应用

实验试剂：针对PA和capA质粒标准分子，设计了数十对引物，分别扩增 目标序列中的基因片段，将设计的引物和探针交由宝生物工程(大连)有限公 司合成，Master Mix购自Life technology公司。实验仪器包括：实时荧光定 量PCR扩增仪(Life technology)离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。

质粒标准分子PA和capA在实时荧光PCR检测中的应用：

引物(分别使用表15中所示引物)、探针、PCR检测体系

PCR加样体系：

反应条件PCR程序：

95℃  10分钟；

95℃  15秒，60℃  1分钟，40个循环。

将实施例1制备所得的质粒标准分子PA稀释为不同浓度的质粒标准分子 (1.36×10⁶copies/μL、1.36×10⁵copies/μL、1.36×10⁴copies/μL、1.36×10³copies/μL、 1.36×10²copies/μL、1.36×10¹copies/μL、1.36×10⁰copies/μL)，capA稀释为不同 浓度的质粒标准分子(7.93×10⁶copies/μL、7.93×10⁵copies/μL、7.93×10⁴copies/μL、 7.93×10³copies/μL、7.93×10²copies/μL、7.93×10¹copies/μL、7.93×10⁰copies/μL) 将不同浓度的质粒标准分子分别作为模板，按照文献中的方法进行实时荧光 PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关 系，建立标准曲线。

实验结果

1、本实例中对数十对引物进行了测试，实验结果表明有4对引物能够针 对炭疽杆菌的毒素PA的基因序列进行有效扩增，有3对引物能够针对炭疽杆 菌的大分子荚膜基因capA基因序列进行有效扩增。最终获得的能够成功扩增 目标序列的引物和探针序详见表15。

表15 实验中采用的引物和探针序列

针对炭疽杆菌的毒素PA的基因序列，引物对1的检测效果最好，特异性 强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测1.36 copies/μL的目标序列；引物对2和3的灵敏度较低，能够检测到 1.36×10²copies/μL的目标序列；引物对4能够检测到1.36×10¹copies/μL 的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。

针对炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列，引物对5的检测效果最 好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检 测7.93copies/μL的目标序列；引物对6的灵敏度较低，能够检测到 7.93×10²copies/μL的目标序列；引物对7能够检测到7.93×10¹copies/μL 的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。

2、质粒标准分子PA在实时荧光PCR检测中的应用

使用引物对1，分别以不同浓度的质粒标准分子PA(如：1.36×10⁶copies/μL、 1.36×10⁵copies/μL、1.36×10⁴copies/μL、1.36×10³copies/μL、1.36×10²copies/μL、 1.36×10¹copies/μL、1.36×10⁰copies/μL)作为标准品建立实时荧光PCR的标准曲 线。建立的标准曲线见图3，相关系数达到0.998，线性良好，表明质粒标准 分子PA适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增炭疽杆菌的 阳性标准物质。

使用引物对5，分别以不同浓度的质粒标准分子capA(如： 7.93×10⁶copies/μL、7.93×10⁵copies/μL、7.93×10⁴copies/μL、7.93×10³copies/μL、 7.93×10²copies/μL、7.93×10¹copies/μL、7.93×10⁰copies/μL)作为标准品建立实 时荧光PCR的标准曲线。建立的标准曲线见图6，相关系数达到0.991，线性良 好，表明质粒标准分子capA适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR 扩增炭疽杆菌的阳性标准物质。

在实际炭疽杆菌检测时，可利用该线性良好引物对制作的标准曲线，通过 实验荧光PCR方法检测出待测样品中炭疽杆菌特定基因的拷贝数，并可根据炭 疽杆菌特定基因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出炭疽杆菌的具体 个数。由于目前针对炭疽杆菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空 白，在实际炭疽杆菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒 DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的 定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极 大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准分子可以解决实时荧光 PCR检测炭疽杆菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增炭疽杆菌的实时荧 光PCR方法，保证检测结果的可比性，为炭疽杆菌实时荧光PCR方法检测提供 生物计量技术支持。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。