趋化素-细胞素融合蛋白和其应用

摘要

本发明提供一种融合蛋白，其包含趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和连接至该趋化素多肽的细胞素多肽，其为一介白素、一TNF-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且该融合蛋白具有相较于该趋化素多肽的增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽的增进的细胞素活性。

说明书

mat="original" lang="zh">

趋化素 -细胞素融合蛋白和其应用 技术领域>

本发明涉及一种融合蛋白， 其包含趋化素和连接至该趋化素的细胞素， 其中该 趋化素和该细胞素具有共同的标的细胞， 且其具有增进的细胞素活性和增进的趋化 素活性的作用。 背景技术>

细胞素（ cytokine )是一群当细胞受外来刺激后所分泌出来（只有极少种细胞素 可表达于细胞膜） 的蛋白， 细胞素自细胞产生后可以就近或经由血液的运输而作用 于标的细胞以产生影响， 而且在极低的浓度下就会发挥作用， 广泛具有可促使标的 细胞生长、 分化或活化等功能， 许多细胞素可作用在免疫细胞而参与免疫反应。 细 胞素可依其结构作用不同大致分为趋化素 （ chemokines；)、 介白素 （ interleukins )、 生长因子（ growth factors )、 转形生长因子 （ transforming growth factors )、 群落生成 刺激因子 ( colony stimulating factors )、 月中瘤坏死因子 ( tumor necrosis factors )和干 扰素 ( interferons )等。>

趋化素 （chemokines )是一群可趋化吸引白血球的细胞素， 通常为分子量小、 带正电、 可分泌性的蛋白， 主要的功能是将免疫细胞吸引到组织受伤或是有病原感 染的区域， 白血球继而能够在此特定的部位进行吞噬反应（phagocytosis )或是引发 发炎反应 ( inflammation ), 以抵御病原， 趋化素所吸引的白血球可能包括属于先天 性免疫力（ innate immunity )的中性粒细胞（ neutrophils )、单核球 /巨噬细胞（ monocytes/ macrophages )、 自然杀伤细胞 ( natural killer cells )、 树突细胞 ( dendritic cells )和其 他白血球等， 或者是属于特异性免疫反应 ( adaptive immunity )的 T (淋巴）细胞（ Τ lymphocytes, T cells )或 B (淋巴） 细胞 ( B lymphocytes, B cells ), 在生物体的免疫 系统中扮演相当重要的角色。 趋化素大多拥有 4个高度保留的半胱胺酸 （cysteine, C )形成双硫键来稳定其结构， 依据前两个 C的间的氨基酸数不同和第一个 C有无 进行分类， 可分成 CXC (或称 α )、 CC (或称 β )、 C (或称 γ )与 CX₃C四个亚群>0>

CD40配体（ CD40 ligand, CD40L )是肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor, TNF ) 超家族（ superfamily )里的一员， 此种细胞素具有使肿瘤坏死与促进白血球细胞分 化、 增生、 凋亡的功用。 CD40L蛋白合成时为一跨膜蛋白（ transmembrane protein ) , 以人类 CD40L为例，蛋白共 261个氨基酸，首先氨基端 22个氨基酸为细胞内区域， 接着 24个氨基酸为穿膜区域， 靠羧基端 215个氨基酸序列为细胞外 （extracellular, Exc ) 区域， Exc区域在羧基端具有一个 TNF超家族蛋白均保留的 TNF同源 （ TNF homology, TNFh )区域。 CD40L主要以跨膜蛋白形式存在活化的 CD4+ T细胞表面， 也存在 CD8⁺T细胞、>

CD40L的受体为 CD40 , 分布于 B细胞、 树突细胞， 巨噬细胞等抗原呈现细胞

( antigen presenting cells, APCs )表面。 在生理上这些抗原呈现细胞可受到辅助性 T 细胞（ T helper cells )表达的 CD40L活化， 促进表达第二类主要组织相容性复合体

( major histocompatibility complex class II, MHC-II )分子与 B7分子以助抗原呈现。 CD40L透过与标的细胞上的 CD40结合而活化信息传递通路， 除了上述促进抗原呈 现的作用， CD40L在 B细胞可促进 B细胞增殖（ proliferation )、 免疫球蛋白的类型 转变（isotype switching ),抗体分泌、记忆性 B细胞的分化或避免细胞凋亡； CD40L 作用在巨噬细胞可加强其活化，促进其产生介白素 -12 (interleukin-12, IL-12) 以活化 第一型辅助性 T细胞（T helper 1, Thl )或是分泌一些趋化素， 或是促进一氧化氮

( nitric oxide, NO )产生以提升巨噬细胞防卫微生物的能力； 作用在树突细胞可使 其成熟活化， 活化的树突细胞除了表达大量 MHC-II分子以助抗原呈现， 还会分泌 TNF-α 以及 IL-8、 巨 细胞炎性蛋白 1α ( macrophage inflammatory protein la, MIP-la )等趋化素。>

目前已有许多研究将 CD40L应用在疫苗佐剂或是治疗上， 例如做为鸭 B型肝 炎病毒 ( duck hepatitis B virus, DHBV )疫苗 ( Gares et al, Clin Vaccine Immunol 13, 958-965 )、人类免疫缺陷病毒（ human immunodeficiency virus, HIV )DNA疫苗（ Stone et al., J Virol 80, 1762-1772 )的佐剂或是治疗人类自体免疫性疾病（ Howard & Miller, Autoimmunity 37, 411-418 )等。>

介白素 -2 ( interleukin-2, IL-2 )被归类在造血因子 （ hematopoietin ) 家族里 , 这家族包括了一些与细胞生长有关的荷尔蒙或其他细胞素等。 IL-2的功能包括： 调 节 T细胞的成熟和分化、 刺激 B细胞的增殖和抗体分泌、促进自然杀伤细胞的毒杀 能力、活化单核细胞和巨噬细胞等。 IL-2也可以刺激 T细胞与 B细胞持续表达 MHC， 也可以刺激自然杀伤细胞产生多种不同的细胞素， 包括 TNF-α、 IFN-γ和粒细胞 /巨 细胞集落刺激因子（ granulocyte/macrophage colony stimulating factor, GM-CSF )等。 研究显示 IL-2有抗肿瘤和提升疫苗的作用。>

然而， 本领域中仍然需要具较强活性的细胞素和趋化素。 发明内容>

本发明意外地发现， 包含趋化素和连接至该趋化素的细胞素的融合蛋白， 具有 增进的细胞素活性和增进的趋化素活性。>

因此， 本发明提供一种融合蛋白， 其包含一趋化素多肽， 其为一趋化素或其受 体结合域； 和连接至该趋化素多肽的一细胞素多肽， 其为一介白素、一 TNF-超家族 细胞素或其受体结合域； 其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞， 且该融合蛋白具有相较于该趋化素多肽的增进的趋化素活性， 以及相较于该细胞素 多肽的增进的细胞素活性。>

根据本发明， 该趋化素为一 CXC趋化素、 CC趋化素、 C趋化素和 CX₃C趋化>

根据本发明， 该细胞素多肽为一介白素、 一 TNF-超家族细胞素或其受体结合 域。 在本发明的具体实施例中， 该细胞素多肽为 IL-2、 CD40配体或其受体结合域。>

另一方面， 本发明提供一种经分离的核酸分子， 其编码本发明的融合蛋白。 又一方面， 本发明提供一种表达载体， 其包含本发明的核酸分子。 本发明亦提供一种宿主细胞， 其包含本发明的核酸分子或本发明的表达载体。 本发明的各个具体实施例的细节说明如后。 本发明的其他特征将会经由以下各 个具体实施例中的详细说明和申请专利范围而清楚呈现。>

无须进一步的阐述， 相信本发明所属技术领域中具有通常知识者基于前述说明 即可利用本发明至最广的程度。 因此， 可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明的 用， 而非以任何方式限制其余的揭露内容。 附图说明>

图 1为鸡 CD40L和其衍生蛋白 Ο401^Μ¾的示意图；>

图 2显示所表达的鸡重组融合蛋白的 SDS-PAGE和 western blot分析结果； 第 1道（lane 1 ): IL8CD40L_Exc,>Exc,预期大小为>

图 3显示純化单一蛋白的 SDS-PAGE和 western blot分析结果；>

第 1道： 标签蛋白， 预期大小为 21 kDa; 第 2道： IL-8, 预期大小为 13 kDa; 第 3道： SDF-1 , 预期大小为 11 kDa; 第 4道： IL-2, 预期大小为 32 kDa; 第 5道：>Exc,>

图 4显示 IL-8衍生蛋白趋化 PBMCs的情形；>

细胞受到胶体外的趋化素吸引， 会自中心胶体游向四周， 细胞在低放大倍率下 呈现云雾状， 胶体周围细胞愈多代表趋化细胞程度愈大， 在 2 μΜ下， IL8CD40L_Exc>

图 5显示 SDF-1衍生蛋白趋化 PBMCs的情形；>

在 2 μΜ下， SDFlCD40L_Exe、>

图 6显示 CD40L衍生蛋白活化巨噬细胞产生 NO的活性；>

A:>Exc;>Exc;>Exc;>

SDFlCD40L_TNFh;>

*> < 0.01 );>

图 7显示 IL-2融合蛋白促进淋巴球增生试验的结果；>

增生指数 ( stimulation index, SI ) -试验组别的 OD/仅以 RPMI 1640培养的 OD。 融合蛋白 SDF1IL2浓度在 0.625 - 160 nM时， 其 SI值显著高于单独 IL-2组别 ( < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 );>

图 8显示 IL-2融合蛋白作为新城疫病 （ND )疫苗佐剂， 可显著促进细胞免疫 反应； 施用 IL-2融合蛋白佐剂与 ND疫苗组别鸡只， 于新城疫病毒（ NDV )抗原再 刺激时， 其记忆淋巴细胞增生情形显著高于 ND疫苗组；>

图 9显示融合蛋白作为传染性支气管炎（IB )疫苗佐剂， 可显著促进细胞免疫 反应；>

进行传染性支气管炎病毒（IBV )抗原再刺激试验， 施用 IL-2融合蛋白佐剂与 ND疫苗组别鸡只， 其记忆淋巴细胞增生情形显著 （/? < 0.01 ) 高于 IB疫苗组； 施 用>Exc融合蛋白佐剂与>

除非另有指明 , 所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属技 艺中的通常技术者一般所了解的意义。>

本文所使用的 "一" 一词， 如未特别指明， 是指至少一个（一个或一个以上） 的数量。>

本文所使用的 "趋化素多肽" 一词是指一多肽， 其为趋化素（chemokine )或其 受体结合域 ( receptor binding domain )， 其中该趋化素包括但不限于 CXC趋化素、 CC趋化素、 C趋化素和 CX₃C趋化素。>

本文所使用的 "细胞素多肽" 一词是指一多肽， 其为细胞素（cytokine )或其受 体结合域， 其中该细胞素包括但不限于介白素和 TNF-超家族细胞素。>

本文所使用的 「趋化素活性」一词是指趋化素于生物体内所具备或可发挥的活 性， 包括但不限于趋化多种免疫细胞（包括单核细胞、 巨噬细胞、 T细胞、 B细胞、 自然杀伤细胞、 树突细胞和中性粒细胞等）。>

本文所使用的 "细胞素活性" 一词是指细胞素于生物体内所具备或可发挥的活 性， 包括但不限于促进 B细胞增殖、 免疫球蛋白的类型转变、 抗体分泌； 记忆性 B 细胞的分化或避免细胞凋亡； 促进巨噬细胞分泌介白素 -12 以活化第一型辅助性 T 细胞或分泌趋化素； 促进巨噬细胞产生一氧化氮以提升防卫微生物的能力； 促进树 突细胞成熟活化； 调节 T细胞的成熟和分化； 促进自然杀伤细胞的毒杀能力、 产生 多种不同的细胞素； 活化单核细胞和巨噬细胞； 和刺激 T细胞与 B 细胞持续表达 MHC等。>

本发明提供一种融合蛋白， 其包含一趋化素多肽， 其为一趋化素或其受体结合 域； 和连接至该趋化素多肽的一细胞素多肽， 其为一介白素、 一 TNF-超家族细胞素 或其受体结合域； 其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞， 且该融 合蛋白具有相较于该趋化素多肽更增进的趋化素活性， 以及相较于该细胞素多肽更 增进的细胞素活性。>

在本发明的较佳具体实施例中， 该趋化素多肽和该细胞素多肽是通过多肽接头 ( peptide linker )连接。 为了将两种蛋白接合在一起并且还保有原来的构形与功能， 可在两蛋白的中间加上适当的多肽接头以降低两蛋白折叠时的互相干扰。 而这类多 肽接头例如具有一定程度的弹性和亲水性的弹性多肽接头 （Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n>n (通常 n 小于 6 )。>

在本发明一具体实施例中， 该趋化素系为一 CXC趋化素。 在一特定实施例中， 该趋化素为基质细胞衍生因子 （SDF- 在另一特定实施例中， 该趋化素为 IL-8。>

在本发明的部分具体实施例中， 该趋化素多肽系具有选自下列的氨基酸序列之 一： SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18和其同源物 （homolog )和类 似物 ( analog )。>

在本发明部分具体实施例中， 该细胞素多肽为 IL-2、 CD40配体（ CD40 ligand; CD40L )或其受体结合域。>

在本发明部分具体实施例中， 该细胞素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38和其同源物和类似物。>

在本发明特定具体实施例中， 本发明的融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列之 一： SEQ ID NO: 40、 42、 44、 46和 48。>

另一方面， 本发明提供一种经分离的核酸分子， 其编码本发明的融合蛋白。 在本发明部分具体实施例中， 该经分离的核酸分子包含选自下列的编码趋化素 多肽的核苷酸序列之一： SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17和其同源 物和类似物。>

在本发明部分具体实施例中， 该经分离的核酸分子包含选自下列的编码细胞素 多肽的核苷酸序列之一： SEQ ID NO: 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和其同源物和类似物。>

在本发明特定具体实施例中，该经分离的核酸分子具有选自下列序列之一： SEQ ID NO: 39、 41、 43、 45和 47。>

又一方面， 本发明提供一种表达载体， 其包含本发明的核酸分子。>

本发明亦提供一种宿主细胞， 其包含本发明的核酸分子或本发明的表达载体。 以下实施例仅作为说明， 而非作为本发明的限制。 实施例 1: 原核表达载体的构建>

利用先前已构建的鸡 SDF-1、 IL-8、 CD40L衍生蛋白和 IL-2的表达载体（吴佩 珊， 国立中兴大学兽医微生物学研究所硕士论文 2008， 鸡 CD40L和趋化素的研究； Tsai et ai, Taiwan Vet J 31 : 38-45 )做为模版，进行重组聚合酶链反应，其中鸡 CD40L ( chCD40L)衍生蛋白包括 CD40L的细胞外区域 （ extracellular domain of CD40L,>Exc>¾>Exc、>Exc、>Fh、 IL8IL2等连接蛋白 （ conjugate protein )或融合蛋白 （ f sion protein ) 的基因序列。>

方法简述如下， 根据各基因序列分别设计出两对专一性引物对， 第一对引物的 正向引物带有限制性酶切位点 EcoR I切位和融合蛋白位于前段的 N-端基因序列， 反向引物则带有螺旋多肽接头和融合蛋白位于前段的 C-端基因序列，此对引物可专 一性扩增出编码融合蛋白前段与多肽接头的 DNA片段； 第二对引物的正向引物带 有螺旋多肽接头和融合蛋白位于后段的 N-端基因序列，反向引物则带有限制性酶切 位点； 切位和融合蛋白位于后段的 C-端基因序列， 此对引物则可专一性扩增出 编码多肽接头与融合蛋白后段的 DNA片段； 将这两 PCR产物做为模板， 以第一对 引物的正向引物与第二对引物的反向引物再做一次 PCR, 则两个片段会因为螺旋多 肽接头重迭的部分序列而达到连接的目的， 所得的产物即为其间含有螺旋多肽接头 的融合基因序列。将上述产物以限制性酶切位点 EcoR I与 I作用后，与经过 coR I和 o I作用过的 pET载体（ Novagen, Darmstad, Germany ) 以 T4 DNA接合酶 ( Invitrogen )在 16 °C进行 16 小时连接作用， 构建的原核表达载体分别命名为 pETSDFlCD40L_Exc、>Exc 和 pEm8IL2。 实施例 2: 重组蛋白的表达>

将构建好的原核表达载体转化至 E. coli表达菌株 BL21 ( DE3 ) 中， 以 0.5 mM IPTG诱导重组蛋白表达， 以离心的方式收取菌体去除培养液。所有的菌体接着以结 合缓冲液（ binding buffer )重悬， 使用高压细胞裂解仪 （ French Pressure Cell Press, Thermo IEC, Needham, Height, MA, USA )裂解菌体， 高速离心的后水溶性的蛋白会 位于上清液，以镍离子亲和柱进行纯化。不可溶蛋白则会位于离心后的底部团块中， 以 8 M尿素处理此部分不可溶蛋白后， 尿素会将蛋白质的折叠打开使其溶解于水溶 液中， 接着离心 12000 rpm 30分钟取其上清液进行透析， 将尿素慢慢置换出来， 使 蛋白重新折叠成原来的构型， 最后将蛋白质溶解于含有 10 %甘油的磷酸盐緩冲液 ( H 7.3 ) 中， 经 0.22 μιη滤膜过滤后， 以 BCA蛋白分析试剂盒（ Pierce, ockford, IL， USA )测定蛋白浓度， 储存在 -20 °C。 蛋白纯化后经 MALDI-TOF质谙仪分析鉴 定为正确的融合蛋白 , SDS-PAGE与 western blot (一级抗体为 anti-His抗体， 二级 抗体为 AP-标记的山羊抗小鼠 IgG抗体， 显色剂为 NBT/BCIP )分析显示所表达的 鸡重组融合蛋白 IL8CD40L_Exc、>Exc、>TNI¾和 SDF1IL2 等的分子量如预期大小， 分别为 52 kDa、 44 kDa、 38 kDa、 44 kDa和 26 kDa (参 见图 2 )。 此外， 亦制备纯化单一蛋白做为对照， 方法如前述（吴佩珊， 国立中兴大 学兽医微生物学研究所硕士论文 2008，鸡 CD40L和趋化素的研究； Tsai et al.， Taiwan Vet J3 : 38-45 )。 实施例 3: 趋化活性试验 ( chemotactic activity assay )>

评估趋化素 （ SDF-1或 IL-8 )与 CD40L衍生蛋白或 IL-2融合后的趋化活性， 以 Histopaque 1077 ( Sigma, Saint Louis, Mo, USA ) 分离周边血液单核细胞 ( eripheral blood mononuclear cells, PBMCs )， 以 PBS冲洗两次后，再以含 10 %胎 牛血清（ fetal bovine serum, FBS ) 的 RPMI 1640 ( Gibco, Grand Island, NY, USA ) 悬浮后加入融溶状态 0.6 %洋菜胶， 混合均匀， 使洋菜胶的终浓度为 0.3 %， 接着取 此混合液 2 μΐ/孔 点在 48孔盘的中央， 放入水箱五分钟使洋菜胶凝固， 而将细胞固 定在胶的范围内。 接着每孔加入 250 μΐ含有各浓度待测蛋白的培养液， 于 37 培 养隔夜后观察。>

依据各蛋白发挥趋化活性的最低有效浓度 ( minimal effective concentration, MEC ), MEC 值愈小即趋化活性愈佳， IL-8 无论融合 CD40L 衍生蛋白或 IL-2

( IL8CD40L_Exc或>

( 80?1 040!^₍；或80?1>Exc>Exc、 SDF ICD LTNF^ 或 SDF1IL2趋化细胞程度明显大于混合液或 SDF-1单一蛋白 （参见图 5 )。>

表 1 : 趋化活性的最低有效浓度（MEC )>

编>

蛋白名称 最低有效浓度>

A IL-8 125 nM>

B IL8CD40L_Exc 62.5 nM>

C IL8IL2 62.5 nM>

D SDF-1 125 nM>

E SDFlCD40L_Exc 62.5 nM>

F SDFlCD40LTNFh 62.5 nM>

G SDF1IL2 62.5 nM 实施例 4: CD40L衍生蛋白活化巨噬细胞产生一氧化氮（ nitric oxide, NO )活 性分析>

基于 CD40L可活化巨噬细胞产生 NO的特性， 评估趋化素与 CD40L衍生蛋白 融合后的 CD40L活性。分离周边血液单核细胞，以 PBS冲洗两次后，以含 10 % FBS 的 RPMI 1640外加 125 ng/ml鸡 IL-2和 4 μ^πιΐ LPS调整细胞至 2x l0⁶/ml， 24孔 盘中各放入 1 ml，两天后外加新鲜培养液 1 ml (同样添加 125 ng/ml 鸡 IL-2和 4 μ^ιηΐ LPS), 五天后完成刺激， 单核细胞会分化成巨噬细胞。 以 PBS冲洗三次去除悬浮细 胞后加入不同浓度的 CD40L衍生蛋白或融合蛋白， 并以培养液、 载体表达的标签 蛋白和加入 4 μ^πιΐ LPS的培养液分别做为阴性和阳性对照组，培养 48小时后取 50 μΐ利用可通过商业途径购买的试剂盒（ Griess Reagent System; Promega, Madison, WI, USA )测定培养液中亚硝酸（由 NO转化 )浓度。>

融合蛋白 IL8CD40L_Exe与只加入>Exe的组别相比，有显著较好的活性（>Exc的效果显著较单一>Exc蛋白更好 ( 5 ΏΜ,ρ < 0.01; 30-180 Μ,ρ < 0.05 )。 而在 SDF-1和>TOFh 的组合亦有类似结杲， 融合蛋白 SDFlCD^LxNFh的效杲也是显著比单一蛋白 ( CD40LTNFh )还要好（ 5 nM and 180 nM,/? < 0.01; 0.8 nM and 30 nM, ? < 0.05 ) (参 见图 6 )。 实施例 5: IL2融合蛋白促进淋巴球增生的活性>

基于 IL-2可促进淋巴球增生的活性， 评估趋化素与 IL-2融合后的 IL-2活性。 利用细胞内酸性磷酸酶（ acid phosphatase ) 的活性与细胞数成正比， 加入显色底物 对硝基磷酸苯酯 （ p-nitrophenyl phosphate, pNpp )。 分离周边血液单核细胞后， 以含 10% FBS的 RPMI 1640培养液加上不同浓度的蛋白、 10 μ^ηιΐ ConA (阳性对照组）、 或 10 nM标签蛋白 （阴性对照组）， 培养于 96孔板当中， 每孔细胞量为 2χ 10⁵， 培 养三天后 3000 rpm离心 10分钟，接着去掉培养液，每孔加入 100 μΐ的显色试剂 ( 0.1 M sodium acetate, H 5.5， 0.1% Triton X-100, and 10 mM pNpp )， 37 °C培养两个小 时， 接着加入 10 μΐ 1 N NaOH终止反应， 以波长 405 nm读取吸光值并计算增生指 数（ stimulation index, SI ), 其中 SI =试验组别的 OD/仅以 RPMI 1640培养的 OD。 结果显示融合蛋白 SDF1IL2于 0.625 - 160 nM时促进增生的活性均显著高于 IL-2 ( 0.625 nM, p < 0.05; 1.25 - 80 nM, p < 0.001 ; 160 ηΜ, ρ < 0.01 )， 此结果显示融合趋 化素后 IL-2活性显著提高 （参见图 7 )。 实施例 6: 融合蛋白作为禽类新城疫病（ Newcastle disease, ND )疫苗佐剂促进 疫苗引发的免疫反应>

以 IL-2融合蛋白作为禽类新城疫病（ Newcastle disease, ND )疫苗佐剂（ vaccine adjuvant ) 施用于鸡只， 于施用疫苗后抽取鸡血， 培养淋巴细胞并加入灭活的

( inactivated )新城疫病毒 ( Newcastle disease virus, NDV ) 为抗原， 进行抗原再刺 激试验 (antigen re-stimulation assay), 另于培养液加入 10 g/ml ConA做为阳性对照 组， 比较各组鸡只可识别 NDV抗原的记忆淋巴细胞 ( memory lymphocytes )增生情 形， 决定增生情形的方法与实施例 5所描述相同， 增生百分比 = (试验组别的 OD/ 仅以 RPMI 1640培养的 OD ) χ 100%。 与仅接种 ND疫苗的组别 （ ND vaccine )相 较， 接种 IL-2融合蛋白为 ND疫苗佐剂的组别 （SDF1IL2 + ND vaccine )可显著

( p < 0.05 )提升抗原再刺激时具抗原识别特异性（antigen-specific ) 的记忆淋巴细 胞增生活性（参见图 8 )。 实施例 7: 融合蛋白作为禽类传染性支气管炎（ infectious bronchitis, IB )疫苗 佐剂促进疫苗引发的免疫反应 以 IL-2 融合蛋白或>Exc融合蛋白作为禽类传染性支气管炎（infectious bronchitis, IB )疫苗佐剂， 于施用疫苗后抽取鸡血， 培养淋巴细胞并加入去活性传 染性支气管炎病毒（ infectious bronchitis virus, IBV )为抗原， 进行抗原再刺激试验， 比较各组鸡只可识别 IBV抗原的记忆淋巴细胞增生情形，决定增生情形的的方法与 实施例 5所描述相同，增生百分比 = (试验组别的 OD/仅以 RPMI 1640培养的 OD ) 100%。 与仅接种 IB疫苗的组别 （ IB vaccine )相较， 接种 IL-2融合蛋白为 IB疫 苗佐剂的组别 （ SDF1IL2 + IB vaccine ) ( p < 0.01 )或接种>Exc融合蛋白为>Exc + IB vaccine ) (p < 0.05 ) 均可显著提升抗原再刺 激时具抗原识别特异性的记忆淋巴细胞增生活性（参见图 9 )。>