新的抗体片段、组合物和其用途

摘要

抗体片段包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括轻链可变结构域和两个恒定结构域，所述第二多肽包括重链可变结构域和两个恒定结构域，其中两个链恒定结构域是轻链恒定结构域且两个恒定结构域是CH1重链恒定结构域。

说明书

技术领域

本公开内容涉及具有改进的体内稳定性的新的抗体片段。

背景技术

射靶疗法，癌症治疗的新前沿，其采用特异性地阻断维持转化的 表型的决定性基因产物的药理学工具(药物或抗体)。当前，临床中采用 癌症射靶疗法用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)、络氨酸激酶分子 ABL成瘾、用于治疗依赖于表皮生长因子受体(EGFR/HER-1)活化的非 小细胞性肺癌(NSCLC)的亚型和结肠-直肠癌(CRC)、以及用于治疗 BRAF依赖型黑素瘤。

具有络氨酸激酶活性的受体(RTK)是用于射靶疗法的令人感兴趣 的候选，因为它们在数种类型的肿瘤中经常是超活化的。它们可被不 同类型的靶分子抑制，比如抗体——其在与受体的胞外部分相互作用 后能够扰乱(perturb)受体诱导的胞内信号传导——和干扰受体催化活 性的化学合成的小分子。

在不同的RTK中，原癌基因c-met的产物肝细胞生长因子受体 (HGFR/Met)逐渐成为癌症中最重要的活化癌基因之一。Met控制称为 ‘穿入性生长’的遗传程序，其包括促有丝分裂(pro-mitogenic)、促侵 袭性(pro-invasive)和抗凋亡因子(cue)。通过这些生理信号，Met提供给 肿瘤更好地适应性，帮助其克服癌症进程中的选择性障碍。而且，Met 通过其促进肿瘤血管生成的能力维持肿瘤生长。在过去的几年中，Met 还致使对由使用抗血管生成剂处理的肿瘤发展的攻击性和对常规的放 射疗法的抗性负责。额外地，MET基因变更可以是转化的主要原因， 在所有那样的情况中，其中它已经被遗传学选择，用于初级(primary) 转化表型的长期维持。

所有上文所列举的发现已经促进了适于抑制Met信号传导的数个 分子的研发，其包括HGF的竞争性抑制剂、化学的Met激酶抑制剂、 抗HGF和抗Met抗体。这些分子中的一些直到现在只测试用于研究目 的。临床试验当前进行到中和抗HGF抗体、抗Met抗体和数个小分子。

从数个观点来看，能够抑制Met信号传导的抗Met抗体将是优选 的。抗体是高度特异性的、稳定的，并且由于其自然设计，它们通常 被宿主良好地耐受。在过去的几年中，做出了多种努力以生成治疗性 抗Met抗体。然而，出现了许多失败，这是因为大多数的抗Met抗体 表现为激动剂，模拟HGF活动。这主要地归因于如下事实：由于其二 价结构，抗体可稳定受体二聚体，允许Met的转磷酸作用，以及其随 后的活化。在一种情况中，激动剂抗Met抗体(5D5)被工程化并以单价 形式(单臂-5D5)转化，其与HGF结合竞争，被赋予了治疗潜力(1、2)。 此分子最近已经进入了III期临床试验，结合厄洛替尼(3)用于治疗特征 为肿瘤中高水平的Met表达的非小细胞性肺癌患者的亚型。

单克隆抗体DN30是针对人Met受体的胞外部分的小鼠IgG2A(4)。 它以亚纳摩尔的亲和力与Met受体胞外区的第四IPT结构域结合。起 初，它被表征为Met的部分激动剂，能够促进一些但不是所有的Met 介导的生物细胞应答。随后表明它可以通过受体‘脱落’的机理充当 肿瘤生长和转移的抑制剂(5)。受体脱落是对不同生长因子、细胞因子、 受体和黏附分子起作用的蛋白质降解的生理学细胞机制。Met脱落以两 个步骤表述：首先，金属蛋白酶，ADAM-10，剪切识别紧靠跨膜区上 游定位的特异性序列的Met的胞外结构域；然后剩余的跨膜片段成为 第二蛋白酶(γ-分泌酶)的底物，所述第二蛋白酶从膜分离包含激酶的部 分，并且快速地指引(address)其朝向蛋白酶体降解通路(6,7)。DN30发 挥的此机制的增强导致暴露在细胞表面处的Met受体的数目减少。同 时，它在胞外空间中释放可溶性、‘诱饵’胞外域。后者与完整跨膜受 体竞争配体结合，并且通过与真实的Met形成异源二聚复合物抑制受 体同源二聚化。所有这些活动强烈地损害Met介导的信号传导并导致 妨碍下游生物学效应。

最近，本发明人证明DN30抗Met单克隆抗体的单价Fab片段 (DN30 Fab)清除任何对抗活性(agonistic activity)并维持诱导脱落的能 力，因而产生有效的Met抑制剂(8)。通过DN30-Fab诱导Met脱落依 赖于选择性抗体-抗原相互作用，但是独立于受体活化。此活动机制基 于从细胞表面简单清除Met，给予DN30-Fab比其它抑制剂强的优势， 这是因为它可以有效地针对所有形式的Met活化——不论是否是HGF 依赖性的，由过表达、突变或基因扩增诱导。

虽然重组DN30-Fab对临床应用是非常有吸引力的，但是短的Fab 血浆半衰期——主要地归因于肾清除率——严重地限制其患者治疗的 应用。

当前，改善Fab片段的药理学特性的最巩固的技术是通过与聚乙 二醇(PEG)的结合增加其分子量。临床中，Fab聚乙二醇化是在采用Fab 的大多数情况中追寻的途径。聚合物链与抗体片段的共价附连——高 效获取且不损失抗原结合特性——不是显而易见的方法且需要强的构 建努力。

用于改善Fab片段的药理学特性的另一个技术是在EP-A-1718 677中公开的技术。这样的程序——用于生成上文评述的单臂形式的单 克隆抗体5D5，是相同细胞中三个不同抗体链——轻链(VL-CL)、重链 (VH-CH1-CH2-CH3)和重链的Fc部分(CH2-CH3)的产物——在重组基 础上。CH2-CH3结构域不是野生型：包括突变，其引起特异性立体结 构。在一个多肽中，CH2-CH3区合并形成凸起的序列，而在其它多肽 中，CH2-CH3区包含形成空腔的序列，所述凸起可插入该空腔中(隆突 进入孔结构)。这些立体结构的存在允许异源二聚体的优选形成，在该 异源二聚体中重链与Fc片段形成二硫键，但是根本没有排除同源二聚 体的形成(即两条重链链接在一起，和两个Fc链接在一起)。使得不需 要的同源二聚体与需要的异源二聚体分离的纯化是必需的。因而“单 臂的程序”，尽管非常精妙，但是它是繁琐的，这是由于它在全过程中 需要额外的步骤，这使制造复杂且减少了重组抗体的产量。

因此，感受到增加Fab血浆半衰期用于体内治疗用途的不同方案 的必要性。

发明内容

本公开内容的目标是提供具有改进的体内稳定性的抗体片段。

根据本发明，由于在随后的权利要求中具体记载的主题，上述目 标被实现，所述权利要求被理解为形成本公开内容的组成部分。

本公开内容的实施方式提供了包括第一多肽和第二多肽的抗体片 段，所述第一多肽包括轻链可变结构域和两个恒定结构域，所述第二 多肽包括重链可变结构域和两个恒定结构域，其中两个链恒定结构域 是轻链恒定结构域且两个恒定结构域是重链CH1恒定结构域，其以不 同组合融合于可变结构域。

本公开内容的进一步的实施方式涉及如上文所限定的抗体片段， 其在体内比包括轻链和重链可变结构域的Fab分子更稳定。

仍进一步的实施方式涉及如上文所限定的抗体片段，其与肝细胞 生长因子受体(HGFR/Met)特异性结合。

附图说明

现在将完全通过说明性和非限制性实例的方式，并且参阅附图详 细地描述本发明，其中：

图1：嵌合的MvDN30或鼠DN30 Fab处理的嗜Met(Met-addicted) 细胞中的Met脱落和下调。A SNU-5为人胃癌细胞系；B H1993-NC1 为非小细胞性肺癌细胞系。在具有指示浓度的衍生自DN30mAb的两 个抗体片段的无血清培养基中温育细胞48小时。使用抗Met抗体通过 细胞提取物的蛋白质印迹分析测定总Met水平。两条Met条带对应于 未加工的(p190 Met)和成熟的(p145 Met)形式的受体。使用抗Met抗体 通过条件培养基的蛋白质印迹分析测定Met脱落。两种分子都有效地 诱导Met脱落/下调。

图2：嵌合的MvDN30或鼠DN30 Fab处理的嗜Met细胞的生长 测定。A EBC-1为非小细胞性肺癌细胞系；B Hs746T为人胃癌细胞系。 在96孔平皿(1000/孔)中10％的FCS培养基中铺板细胞。24小时后， 使用增加浓度的抗体处理细胞进一步的72小时。通过Cell  titer-glo(Perkin Elmer)评估细胞的数目。每个点是三个值的平均值；短 横线代表标准差。两种分子都有效地抑制嗜Met细胞的细胞生长。

图3：新的DN30衍生的分子的示意性表示。顶部：嵌合的DN30  Fab(MvDN30)；中部：具有一前一后的复制恒定结构域的双恒定结构 域Fab(DCD-MvDN30.1)；底部：具有相互交换的复制恒定结构域的双 恒定结构域Fab(DCD-MvDN30.2)。VH：DN30重链的可变结构域。 VL：DN30轻链的可变结构域。CH1：衍生自人IgG1重链的恒定结构 域1。CL：衍生自人κ轻链的恒定结构域。Strep和His标签：被包括 以允许蛋白质纯化和免疫检测的序列。

图4：新的DN-30衍生的分子的分析。指示的纯化蛋白经历还原 条件下的SDS-PAGE。使用Gel Code Blue(Pierce)对凝胶染色。所有分 子显示出具有期望分子量的两个条带。

图5：DCD-MvDN30分子与Met的结合。MvDN30、DCD-MvDN30.1 和DCD-MvDN30.2(液相)与Met-Fc嵌合体(固相)的ELISA结合分析。 使用抗strepTAG抗体揭示结合。O.D.：光密度；A.U.：任意单位。每 个点是三个值的平均值；短横线代表标准差。新的分子以相同高的亲 和力结合至Fc-Met。

图6：DCD-MvDN30分子的对抗活性。使A549细胞饥饿24小时， 并且然后使用指示浓度下的不同分子在37℃下刺激10分钟。使用抗 Met抗体通过免疫沉淀法，然后使用针对磷酸化Tyr 1234/1235Met残 基——主磷酸化位点(顶部)的抗Met抗体通过蛋白质印迹测定Met活 化。使用抗Met抗体(底部)再探测相同的印迹。新的分子不显著地活化 Met受体。

图7：DCD-MvDN30分子的对抗活性。使A549细胞饥饿24小时， 并且然后使用指示浓度下的不同分子在37℃下刺激10分钟。使用针 对磷酸化形式的抗AKT或ERK抗体通过蛋白质印迹测定AKT和 ERK-1,2的活化。使用抗黏着斑蛋白抗体(底部)再探测相同的印迹以对 照蛋白加样。新的分子不显著地活化Met依赖性信号传导。

图8：DCD-MvDN30分子处理的细胞中的Met脱落和下调。在具 有指示的分子(500nM)的无血清培养基中温育A549细胞72小时。使 用抗Met抗体通过细胞提取物的蛋白质印迹分析测定总Met水平。两 个Met条带对应于未加工的(p190Met)和成熟(p145Met)形式的受体。 作为加样对照，使用不相关蛋白(肌动蛋白)探测滤纸。使用抗Met抗体 通过条件培养基的蛋白质印迹分析测定Met脱落。新的分子有效地诱 导Met脱落。

图9：DCD-MvDN30分子对HGF诱导的Met活化的抑制。在无 血清培养基加指示的分子(1000μΜ)中温育A549细胞24小时，并且然 后使用HGF(100 ng/ml)刺激10分钟。使用针对磷酸化Tyr 1234/1235  Met残基——主磷酸化位点——的抗Met抗体通过蛋白质印迹测定总 细胞裂解物中的Met活化。使用抗Met抗体再探测相同的印迹。使用 抗磷酸AKT或抗磷酸ERK抗体通过蛋白质印迹测定AKT和ERK-1,2 的活化。使用抗AKT或ERK-1,2抗体再探测相同的印迹。为了对照蛋 白加样，还使用抗黏着斑蛋白抗体探测滤纸。新的分子强烈地抑制HGF 诱导的Met活化和Met依赖性信号传导。

图10：使用DCD-MvDN30.1或DCDMvDN30.2或MvDN30处理 的嗜Met细胞的依赖贴壁生长。A、B、C、D是人胃癌细胞系；E、F 是非小细胞性肺癌细胞系。在Costar 96孔板(1000/孔)中5％的FCS培 养基中铺板细胞。24小时后，使用增加浓度的不同分子处理进一步的 72小时。通过Cell titer-glo(Promega)评估细胞的数目。图代表相对于未 处理的对照存活细胞的百分比。每个点是三个值的平均值。新的分子 有效地抑制了嗜Met细胞的细胞生长。

图11：使用DCD-MvDN30.1或DCD-MvDN30.2或MvDN30处理 的细胞的不依赖贴壁生长。A549细胞在1.5mM的DCD-MvDN30.1、 或DCD-MvDN30.2或MvDN30的存在下在具有或不具有HGF(50 ng/ml)的半固体培养基(5％的琼脂糖)中铺板。21天后，使用四氮唑盐 染色集落。使用MetaMorphOffline Software通过计数每个孔面积中的 像素量化集落。每个点是三个值的平均值。新的分子有效地抑制了HGF 依赖性不依赖贴壁细胞生长。

图12：DCD-MvDN30.1、DCD-MvDN30.2和MvDN30的体内药 代动力学曲线。免疫缺陷小鼠腹腔内注射单剂量(100μg)的 DCD-MvDN30.1、或DCD-MvDN30.2或MvDN30。在不同时间点收集 外周血。通过ELISA测量治疗分子的血清浓度。图表代表循环分子的 量与时间的函数。样品一式三份，短横线代表标准差。

图13：根据本公开内容的抗体片段的第一多肽的第一实施方式的 核苷酸和氨基酸序列。序列相当于衍生自轻链的多肽，VL-CL-CL。在 核苷酸和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划线。

图14：根据本公开内容的抗体片段的第二多肽的第一实施方式的 核苷酸和氨基酸序列。序列相当于衍生自重链的多肽， VH-CHl-CHl-TAG。在核苷酸和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划 线。Strep和组氨酸标签以大写斜体字母。

图15：根据本公开内容的抗体片段的第一多肽的第二实施方式的 核苷酸和氨基酸序列。序列相当于衍生自轻链的多肽， VL-CL-CHl-TAG。在核苷酸和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划 线。Strep和组氨酸标签以大写斜体字母。

图16：根据本公开内容的抗体片段的第二多肽的第二实施方式的 核苷酸和氨基酸序列。序列相当于衍生自重链的多肽，VH-CH1-CL。 在核苷酸和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划线。

图17：DN30轻链可变结构域的核苷酸和氨基酸序列。在核苷酸 和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划线。

图18：DN30重链可变结构域的核苷酸和氨基酸序列。在核苷酸 和氨基酸序列二者中CDR区都标记下划线。

具体实施方式

现在将通过关于抗体片段的非限制性实例详细描述本发明，所述 抗体片段能够特异性结合肝细胞生长因子受体。

清楚的是，本说明书的范围绝不限于这样的靶抗原，因为本文描 述的抗体片段可以具有特异性结合其它靶抗原的特征。

在以下描述中，给出了众多具体细节以提供对实施方式的透彻理 解。可不使用该具体细节中的一个或多个，或者使用其它方法、组分、 材料等实践该实施方式。在其它情况中，没有显示或详细描述众所周 知的结构、材料或操作以避免弱化该实施方式的方面。

贯穿本说明书提及的“一个实施方式”或“实施方式”意为结合 实施方式描述的具体的特征、结构或特性包括在至少一个实施方式中。 因而，短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”在贯穿本说明 书的多个位置中的出现不一定都是指相同的实施方式。此外，在一个 或多个实施方式中，具体的特征、结构或特性可以以任意合适的方式 结合。

本文提供的标题仅是为了方便，并不解释实施方式的范围或含义。

抗体是复杂的四聚体，其中重链和轻链二者都由多个Ig结构域组 成，每一个独立地折叠。在抗体时代刚刚开始的时候，已经显示出， 通过酶促处理，抗体可产生维持原始结构和抗原结合性质的片段。

随后，通过运用蛋白质工程技术，已经生成许多不同的工程化抗 体片段。根据分子设计，每个新的抗体片段由具体的特征(即增加的抗 体亲抗原性、多价、多重特异性、ADCC缺乏的、嵌合的等)表征。

然而，没有一个先前的研究解决了肾清除率的问题以延长抗体片 段的体内半衰期。

为此，本发明人开发了包括第一多肽和第二多肽的重组抗体片段， 所述第一多肽包括轻链可变结构域和两个恒定结构域，所述第二多肽 包括重链可变结构域和两个恒定结构域，其中两个链恒定结构域是轻 链恒定结构域且两个恒定结构域是重链CH1恒定结构域，其以不同组 合融合于可变结构域。

在一个实施方式中，本文所公开的抗体片段在体内比包括所述轻 链和重链可变结构域的Fab分子更稳定。

在一个实施方式中，因为减小的肾清除率，当被施用于人患者时， 抗体片段与包括所述轻链和重链可变结构域的Fab分子相比具有延长 的体内半衰期。

这些抗体片段被命名为‘双恒定结构域Fabs’(DCD-Fabs)。

在优选的实施方式中，本公开内容涉及包括第一多肽和第二多肽 的抗体片段，所述第一多肽包括轻链可变结构域和两个恒定结构域， 所述第二多肽包括重链可变结构域和两个恒定结构域，其中两个恒定 结构域是人轻链恒定结构域且两个恒定结构域是人重链CH1恒定结构 域，其以不同组合融合于可变结构域，其中抗体片段在体内比包括所 述轻链和重链可变结构域的Fab分子更稳定，并且其中抗体片段特异 性结合肝细胞生长因子受体(HGFR/Met)。

在一个实施方式中，轻链可变结构域在其C-末端处融合于一个轻 链恒定结构域，所述轻链恒定结构域在其C-末端处融合于一个轻链恒 定结构域。

在另一个实施方式，轻链可变结构域在其C-末端处融合于轻链恒 定结构域，所述轻链恒定结构域在其C-末端处融合于一个重链CH1恒 定结构域。

在一个实施方式中，重链可变结构域在其C-末端处融合于一个重 链CH1恒定结构域，所述重链CH1恒定结构域在其C-末端处融合于 一个重链CH1恒定结构域。

在另一个实施方式，重链可变结构域在其C-末端处融合于重链 CH1恒定结构域，所述重链CH1恒定结构域在其C-末端处融合于轻链 恒定结构域。

在一个实施方式中，包含在第一和第二多肽中的恒定结构域—— 当在抗体片段中连接在一起时——能够生成二硫键。

在进一步优选的实施方式中，本公开内容涉及如上文限定的抗体 片段，其中通过采用DN30轻链和重链可变结构域或包括来自DN30 单克隆抗体的互补性决定区(CDR)的人源化轻链和重链可变结构域作 为轻链和重链可变结构域而提供了抗原特异性。国际专利申请 WO-A-2007/090807中公开了DN30单克隆抗体。

本发明的抗体片段通常是治疗性抗体。例如，本发明的抗体可以 是拮抗抗体、阻断抗体或中和抗体。

在一个方面，本发明提供了治疗或延缓疾病进展的方法：向患有 疾病的对象施用有效量的对治疗或延缓疾病进展有效的本发明的抗体 片段。

在一个实施方式中，疾病是肿瘤或肿瘤转移。

在另一个实施方式，疾病与肝细胞生长因子-受体信号传导和/或活 化的调节异常相关联。

本发明的抗体片段适于治疗或预防与HGF/HGFR信号传导通路内 的异常相关联的病理状况。

在一个实施方式中，本发明的抗体是HGFR拮抗物。

在一个实施方式中，抗体片段包括来自移植到异种的非人、人或 人源化序列(例如框架和/或恒定结构域序列)的非人供体的抗原结合序 列。在一个实施方式中，非人供体是小鼠。

在一个实施方式中，抗原结合序列包括抗HGFR鼠抗体的全部 CDR和/或可变结构域序列。

在一个优选的实施方式中，鼠轻链可变结构域在其C-末端融合于 一个人κ轻链恒定结构域，所述人κ轻链恒定结构域在其C-末端融合 于一个人κ轻链恒定结构域。在另一个实施方式，鼠轻链可变结构域 在其C-末端融合于人κ轻链恒定结构域，所述人κ轻链恒定结构域在 其C-末端融合于一个人IgG1重链CH1恒定结构域。在一个实施方式 中，鼠重链可变结构域在其C-末端融合于一个人IgG1重链CH1恒定 结构域，所述人IgG1重链CH1恒定结构域在其C-末端融合于一个人 IgG1重链CH1恒定结构域。在另一个实施方式，鼠重链可变结构域在 其C-末端融合于人IgG1重链CH1恒定结构域，所述人IgG1重链CH1 恒定结构域在其C-末端融合于人κ轻链恒定结构域。

在一个优选的实施方式中，本发明的抗体片段包括第一多肽，所 述第一多肽包括轻链可变结构域和两个恒定结构域，所述轻链可变结 构域包括抗HGFR鼠抗体的CDR序列——更优选为DN30的CDR， 其中两个恒定结构域是：两个轻链恒定结构域或者一个轻链恒定结构 域和一个重链CH1恒定结构域。在一个实施方式中，两个恒定结构域 是人恒定结构域。

在一个实施方式中，本发明的抗体片段包括第二多肽，所述第二 多肽包括重链可变结构域和两个恒定结构域，所述重链可变结构域包 括抗HGFR鼠抗体的CDR序列——更优选为DN30的CDR，其中两 个恒定结构域是：两个重链CH1恒定结构域或者一个重链CH1恒定结 构域和一个轻链恒定结构域。在一个实施方式中，两个恒定结构域是 人恒定结构域。

在最优选的实施方式中，本发明提供结合人HGFR的人源化抗体 片段，其中抗体对抑制HGF/HGFR的体内活性是有效的，该抗体i)在 重链可变结构域(VH)中包括DN30单克隆抗体的重链可变结构域的三 个CDR序列(SEQ ID No.:19,20,21)和人重链亚组的基本上人共有序 列，例如基本上人共有框架(FR)残基，并且ii)在轻链可变结构域(VL) 包括DN30单克隆抗体的轻链可变结构域的三个CDR序列(SEQ ID No.: 25,26,27)和基本上人轻链K亚组I(VKI)的人共有框架(FR)残基。

在一个实施方式中，本发明的抗体片段包括第一多肽和第二多肽， 所述第一多肽包括作为轻链可变结构域的SEQ ID NO:12(DN30轻链 可变结构域)中陈述的轻链可变结构域序列，所述第二多肽包括作为重 链可变结构域的SEQ ID NO:4(DN30重链可变结构域)中陈述的重链可 变结构域序列。

在一个方面，本发明提供了本发明的抗体片段(例如本发明的 HGFR拮抗物抗体片段)在制备用于疾病，比如癌症、肿瘤、细胞增殖 性紊乱的治疗性和/或预防性治疗的药剂中的用途。

在一个方面，本发明提供了治疗与对象中HGFR活化的调节异常 相关联的病理状况的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本发明 的HGFR拮抗物抗体片段，借此治疗所述的状况。

在一个方面，本发明提供了抑制表达HGFR的细胞的生长的方法， 所述方法包括使所述细胞与本发明的HGFR拮抗物抗体片段接触，从 而引起所述细胞生长的抑制。

在一个方面，本发明提供了治疗性地治疗患有癌性肿瘤的哺乳动 物的方法，所述癌性肿瘤包括表达HGFR的细胞，所述方法包括向所 述哺乳动物施用有效量的本发明的HGFR拮抗物抗体片段，从而有效 地治疗所述哺乳动物。

在一个方面，本发明提供了治疗或预防与升高的HGFR的表达或 活性相关联的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括向需要这样治疗 的对象施用有效量的本发明的HGFR拮抗物抗体片段，从而有效地治 疗或预防所述的细胞增殖性紊乱。

在一个方面，本发明提供治疗性地治疗哺乳动物中肿瘤的方法， 其中所述的肿瘤的生长至少部分地取决于HGFR的生长增效作用，所 述的方法包括使肿瘤细胞与有效量的本发明的HGFR拮抗物抗体片段 接触，从而有效地治疗所述的肿瘤。肿瘤细胞可以是选自乳腺、结肠 直肠、肺、直肠、胰腺、前列腺、卵巢、宫颈、中枢神经系统、肾脏、 肝细胞、膀胱、胃、头和颈肿瘤细胞、乳头状癌(例如甲状腺)、黑素瘤、 淋巴瘤、骨髓瘤、神经胶质瘤/恶性胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤、 多形性恶性胶质瘤、多形性少突神经胶质瘤、多形性少突神经胶质星 形细胞瘤(oligodendroastrocytoma))、白血病细胞的一种。在一个实施方 式中，在本发明的方法中被靶向的细胞是过度增殖和/或增生的细胞。 在一个实施方式中，在本发明的方法中被靶向的细胞是发育异常的细 胞。在还另一个实施方式中，在本发明的方法中被靶向的细胞是转移 性细胞。在进一步的实施方式中，在本发明的方法中被靶向的细胞是 属于维持肿瘤和/或转移的微环境的HGFR表达细胞。

本发明的方法可进一步包括额外的治疗步骤。例如，在一个实施 方式中，方法进一步包括其中靶向的肿瘤细胞和/或组织暴露于辐射治 疗或化学治疗剂的步骤。在另一个实施方式，除了本发明的拮抗物抗 体片段之外，使用HGF抑制剂(即抗HGF抗体)或其它抗HGFR化合物 (即小分子激酶抑制剂)治疗靶向的肿瘤细胞和/或组织。在进一步的实 施方式中，除了本发明的拮抗物抗体片段之外，使用特异性命中(hit) 在维持转化的表型中相关的其它靶点的分子(即抗EGFR分子)治疗靶 向的肿瘤细胞和/或组织。

HGFR的活化是重要的生物过程，它的失调导致众多的病理状况。 因此，在本发明的方法的一个实施方式中，被靶向的细胞(例如癌细胞) 是如下的细胞，其中HGFR的活化与相同组织起源的正常细胞相比是 增强的。在一个实施方式中，本发明的方法引起靶向细胞的死亡或细 胞生长停滞。例如，与本发明的拮抗物抗体片段接触可导致细胞没有 能力通过HGFR通路传导信号，其导致细胞死亡或细胞生长停滞。

本发明还与免疫连接物或抗体-药物连接物(ADC)有关，其包括缀 合至细胞毒素剂，比如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细 菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素 (即放射性连接物(radioconjugate))的抗体片段。

抗体-药物连接物用于细胞毒素或细胞抑制剂——即在癌症的治疗 中杀死或抑制肿瘤细胞生长的药物——的局部递送的用途允许药物部 分对肿瘤的靶向递送和在其中的胞内积聚，其中这些未缀合的药剂的 全身给药可对正常细胞以及试图消灭的肿瘤细胞产生不可接受水平的 毒性。

通过将具有期望纯净度的抗体片段与生理学上可接受的载体、赋 形剂或稳定剂混合制备用于存储的包括本发明的抗体片段的治疗制剂 (Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.Ed.(1980))， 所述治疗制剂是水溶液、冻干或其它干燥的制剂形式。可接受的载体、 赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受试者是无毒的，并且包 括缓冲剂；抗氧化剂；防腐剂；低分子量(小于大约10个残基)多肽； 蛋白质，比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，比如 聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；单糖、二糖和其它碳水化合物；螯合剂； 糖类；成盐反离子；金属络合物和/或非离子表面活性剂。

本文的制剂还可包含被治疗的具体适应症所必需的超过一种的活 性化合物，优选是具有彼此不会不利地影响的互补活性的那些。这样 的分子以对预期的目的有效的量适合地组合存在。

还可在借助于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.Ed.(1980)中公开的技术制备的微胶囊中包埋(entrap)活性成分。

用于体内给药的制剂必需是无菌的。

可制备缓释制品。缓释制品的合适的实例包括包含本发明的抗体 片段的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质是成型制品的形 式，例如膜或微胶囊。

可在体外、离体、体内治疗方法中使用本发明的抗体片段。本发 明提供了基于使用与常规单价抗体相比具有优异性质的抗体片段的多 种方法。

本发明提供了抗体片段，其可被用于多种目的，例如作为治疗剂、 预防剂和诊断剂。

在治疗中，可单独使用或与其它组合物联合使用本发明的抗体片 段。例如，本发明的抗体片段可与另一种抗体、化学治疗剂(一种或多 种)(包括化学治疗剂的混合物(cocktail))、其它细胞毒素剂(一种或多 种)、抗血管生成剂(anti-angiogenic agent)(一种或多种)、细胞因子和/ 或生长抑制剂(一种或多种)一起共施用。上文记载的这样的联合疗法包 括联合给药(其中两种或更多种药剂包括在同一或分开的制剂中)和分 开的给药，在这样的情况下，本发明的抗体的施用可在辅助治疗或疗 法的施用之前和/或之后发生。

通过任意合适的手段施用本发明的抗体片段(和辅助治疗剂)，所述 任意合适的手段包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内、以及如果 需要局部治疗则损伤区给药。通过脉冲输注(pulse infusion)适当地施用 抗体片段，特别是使用下降剂量的抗体。给药可通过任意合适的途径， 例如通过注射，比如静脉注射或皮下注射，这部分地取决于施用是短 暂的还是长期的。还可借助于病毒载体(即慢病毒载体)通过基因转移递 送局部给药或全身给药的本发明的抗体片段。

将以与良好医疗实践一致的方式配制、定量、施用本发明的抗体 片段。在此背景下要考虑的因素包括被治疗的具体紊乱、被治疗的具 体哺乳动物、个体患者的临床状况、紊乱的原因、药剂的递送位点、 给药方法、给药安排和医师已知的其它因素。抗体不必需但是任选地 与当前用于预防或治疗讨论中的紊乱的一种多种药剂一起配制。这样 的其它药剂的有效量取决于制剂中存在的本发明的抗体的量、紊乱或 治疗的类型、和上文所讨论的其它因素。这些通常以此前采用的相同 的剂量和给药途径或此前采用的剂量的大约1至99％使用。

对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体片段的适当剂量(当单独使 用或与其它药剂比如化学治疗剂联合使用时)将取决于待治疗的疾病的 类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、以预防性还是治疗性目 标施用抗体片段、早期治疗、患者的临床病史和对抗体的应答、和主 治医师的判断。抗体片段适合于以一次或在一系列治疗内施用。取决 于疾病类型和严重程度，大约1mg/kg至15mg/kg的抗体是用于施用 至患者的初始候选剂量，不论例如通过一个或多个单独的施用、或者 通过持续输注。根据上文所提到的因素，一个典型的日剂量可以是从 大约1mg/kg至100mg/kg或更多的范围。对于数日或更久的反复施用， 取决于状况，维持治疗直至发生疾病症状的期望的遏制。抗体片段的 一个示例性剂量将在从大约0.05mg/kg至大约10mg/kg的范围中。因 而，大约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合) 中的一个或多个剂量可被施用于患者。可间歇性地，例如每周或每三 周施用这样的剂量(例如使得患者接受大约二至二十，例如大约六剂量 的抗体)。可施用初始的较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的 剂量。示例性给药方案包括施用大约4mg/kg的初始负荷剂量，然后施 用每周一次的大约2mg/kg的抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案可 以是有用的。通过常规技术和试验可容易地监控此治疗的进度。

结果

嵌合的DN30 Fab的生成和其生物化学与生物学特性的表征。

如同具有治疗潜力的其它单克隆抗体，DN30已经在小鼠中培养。 因而，它在人中用于治疗性目的的直接使用是不适用的，这是由于鼠 分子将被人抗鼠抗体(HAMA)识别，其导致了免疫介导的抗体活性清 除。用衍生自人免疫球蛋白的序列替换该抗体的鼠恒定区(抗体嵌合化 (Chimerization))足以强烈地减少HAMA应答。嵌合的mAb和Fab是临 床中当前使用的。通过经典分子生物学技术，本发明人已经将DN30 Fab 重链和轻链的恒定结构域替换为衍生自人免疫球蛋白的恒定结构域： 轻链恒定结构域被替换为人κ型结构域，其是在天然人抗体中更多表 现的结构域，同时重链CH1恒定结构域被替换为衍生自人IgG1的同 源结构域。此组合是有效的：嵌合的DN30 Fab(MvDN30)以高亲和力 结合Met，诱导Met脱落并抑制嗜Met细胞的增殖，这与相应的鼠分 子的特性重叠(图1和图2)。

双恒定结构域Fab的分子设计。

使用MvDN30序列作为模板，本发明人复制每一轻链和重链中的 恒定结构域(双恒定结构域Fab)。新的工程化分子具有75kD的预测分 子量。本发明人生成两种不同的DCD-Fab。在第一分子中，一前一后 地复制人恒定结构域，因而生成VH-CH1-CH1嵌合重链和VL-CL-CL 嵌合轻链。在第二分子中，末端结构域相互交换，因而生成VH-CH1-CL 嵌合重链和VL-CL-CH1嵌合轻链(图3)。相应的二聚重组分子被命名 为DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2。编码这些新的分子的cDNA 被克隆进表达质粒，并且然后进入真核细胞中表达。由于被插入序列 的C-末端处的StrepTAG，从细胞培养物上清液纯化蛋白质。图4显示 了在还原条件下具有正确分子量大小的纯化的重组分子的SDS-Page分 离。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2以高亲和力结合至Met。

纯化的DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2以其结合Met受体的 能力表征。为此，本发明人使用固相中的Met胞外域和液相中的 MvDN30、DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2执行ELISA测定。使 用抗strepTAG抗体(图5)揭示结合。此分析显示了三个DN30衍生的单 价分子以类似的亲和力结合至Met(MvDN30，K_d＝0.141±0.03nM； DCD-MvDN30.1，K_d＝0.133±0.02nM；DCD-MvDN30.2，K_d＝0.130± 0.03nM)。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2不诱导Met磷酸化。

本发明人测试新的DN30衍生的分子是否能在Met磷酸化测定中 展现Met对抗活性。这使用A459人肺癌细胞进行分析，其代表用于测 定响应于急性配体刺激的Met活化的标准系统。事实上，A549细胞表 达生理水平的Met，其在基础条件下无活性，但是倾向于被HGF或配 体-模拟分子活化(4、10)。使用增加量的MvDN30、DCD-MvDN30.1 和DCD-MvDN30.2刺激细胞15分钟。还使用HGF和DN-30mAb刺 激细胞作为阳性对照。使用抗磷酸Met抗体通过免疫印迹法测定Met 活化。如图6中所示，新的分子不显示任何显著的对抗活性。由于缺 乏任何对抗活性，DCD-MvDN30.1不能与MvDN30区分。 DCD-MvDN30.2保留了最少的残留激动剂活性，其与DN30mAb或 HGF相比在任何情况下都是微不足道的。本发明人还检查了充当Met 的下游效应物的分子的活化。虽然使用HGF的刺激诱导胞外信号调节 激酶1和2(ERK-1和ERK-2)二者和AKT/蛋白激酶B(AKT)的活化， 但是DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2，如同MvDN30，不影响这 些信号传导物的磷酸化状态(图7)。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2诱导Met脱落。

本发明人还调查了衍生自MvDN30的新的分子是否维持促进受体 脱落和下调的能力。使用DCD-MvDN30.1、DCD-MvDN30.2和MvDN30 温育A549细胞。在48小时后，使用针对Met的胞外部分的单克隆抗 体通过免疫印迹法分析条件培养基中Met胞外域的存在。还使用相同 的抗体对细胞裂解物测定Met的总细胞水平。此分析揭示了 DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2二者都有效地诱导了Met脱落和 促进了Met下调，这导致了胞外空间中可溶性Met胞外域的释放和细 胞中降低的Met水平(图8)。因此，新的MvDN30衍生的分子，像 MvDN30一样，在亲代DN-30mAb的拮抗和对抗(agonistic)特性之间 实现完全的解离。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2抑制HGF诱导的Met磷酸化和下 游信号传导。

本发明人调查了DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2是否可以抑 制HGF诱导的Met磷酸化和下游信号传导。使用DCD-MvDN30.1、 DCD-MvDN30.2和MvDN30温育A549细胞24小时，并且然后使用 HGF刺激15分钟。使用抗磷酸Met抗体通过免疫印迹法测定Met活 化。如图9中所示，两个工程化分子，如同MvDN30，有效地下调Met 受体，并且强烈地损害其磷酸化水平。这导致AKT和ERK-1,2活化的 抑制(图9)。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2抑制嗜MET的依赖贴壁细胞生长。

只有在依赖于Met信号传导用于增殖/存活的细胞——所谓的嗜 MET细胞——中，依赖贴壁生长可被Met-抑制剂损害。本发明人分析 完整一组嗜MET肿瘤细胞(GTL-16、SNU-5、Hs746T、MKN-45—— 人胃癌细胞——和H1993、EBC-1——人肺癌细胞)。使用增加浓度的 DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2温育指数生长的细胞。MvDN30 作为阳性对照包括在该测定中。在72小时后，使用基于发光的ATP 测定确定细胞生长。MvDN30衍生的两种分子都以剂量依赖的方式抑 制所有嗜MET的细胞生长(图10)。在测试的所有细胞中，两种DCD 分子的抑制特性比得上MvDN30中的抑制特性。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2抑制不依赖贴壁细胞生长。

本发明人测试DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2抑制A549细胞 的不依赖贴壁生长的能力。将细胞接种在半固体培养基中，温育或不 使用HGF和使用单剂量的DCD-MvDN30.1、DCD-MvDN30.2和 MvDN30处理。在两周后，细胞集落染色并量化。同样在此测定中， DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2以与MvDN30类似的方式减少 HGF依赖性集落形成(图11)。

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2与MvDN30相比显示了改进的体 内药代动力学曲线。

本发明人研究了与MvDN30相比DCD-MvDN30.1和 DCD-MvDN30.2的药代动力学特性。单剂量的上文所提到的分子通过 腹腔内注射被递送至免疫缺陷小鼠。在递送后的不同时间点从治疗小 鼠收集外周血。通过对血清执行的ELISA测定研究的分子的循环浓度。 DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2与MvDN30相比达到更高的循环 水平。而且，两种分子都显示出增加的半衰期，并且在循环中持续更 久，在更长时间内是生物可利用的。DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2 清除与MvDN30相比强烈地改进(与MVDN30相比，DCD-MvDN30.1 和DCD-MvDN30.2的清除减小分别为9.6和13.7倍)(图12和表1)。

表1.不同的DN30衍生的分子的药代动力学参数

tl/2：半衰期；CL：清除；Vss：分布体积；Cmax：最大分子浓度；Tmax：达 到Cmax的时间；AUCtot：曲线下的面积；Kel：消除常数。

材料和方法

细胞培养

EBC-1人肺癌细胞和MKN-45胃癌细胞系获取自Japanese  Collection of Research Bioresources(Osaka，日本)。GTL-16人胃癌细胞 衍生自如上所述的MKN-45(11)。所有其它细胞系获取自ATCC-LGC  Standards Partnership(Sesto San Giovanni，意大利)。所有细胞系都保存 在RPMI中，除了Hs746T在DMEM中和SNU-5在IMDM中。细胞 培养基补充10％(对于SNU-5是20％)的胎牛血清和2mM的谷氨酰胺 (培养基、血清和谷氨酰胺来自Sigma Life Science，St.Louis,Missouri)。

蛋白质工程化

DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2由重链和轻链组成。

DCD-MvDN30.1重链(SEQ ID NO.:l和2)相当于野生型DN30 Fab 的VH结构域(2；SEQ ID No.:3和4)融合于前后重复的人免疫球蛋白 G1的CH1结构域(SEQ ID NO.:5和6)。在C-末端处，添加STREP标 签(ST，SEQ ID NO.:7)和聚组氨酸标签(HT，SEQ ID NO.:8)用于纯化 和检测目的。总体结构相当于(从N-末端至C-末端)： VH-CH1-CH1-ST-HT。DCD-MvDN30.1的重链的核苷酸和氨基酸序列 分别报告在图14A和B中。

DCD-MvDN30.1轻链(SEQ ID NO.:9和10)相当于野生型DN30  Fab的VL结构域(SEQ ID No.:11和12)融合于前后重复的人免疫球蛋 白κ的CL结构域(SEQ ID NO.:13和14)。总体结构相当于(从N-末端 至C-末端)：VL-CL-CL。DCD-MvDN30.1的轻链的核苷酸和氨基酸序 列分别报告在图13A和B中。

DCD-MvDN30.2重链(SEQ ID NO.:15和16)相当于野生型DN30 Fab的VH结构域(SEQ ID No.:3和4)融合于人免疫球蛋白G1的CH1 结构域(SEQ ID NO.:5和6)加人免疫球蛋白κ的CL区(SEQ ID NO.:13 和14)。总体结构相当于(从N-末端至C-末端)：VH-CH1-CL。 DCD-MvDN30.2的重链的核苷酸和氨基酸序列分别报告在图16A和B 中。

DCD-MvDN30.2轻链(SEQ ID NO.:17和18)相当于野生型DN30  Fab的VL结构域(SEQ ID No.:11和12)融合于人免疫球蛋白κ的CL 结构域(SEQ ID NO.:13和14)加人免疫球蛋白G1的CH1结构域(SEQ  ID NO.:5和6)加STREP标签(ST，SEQ ID NO.:7)和聚组氨酸标签(HT， SEQ ID NO.:8)。总体结构相当于(从N-末端至C-末端)： VL-CL-CH1-ST-HT。DCD-MvDN30.2的轻链的核苷酸和氨基酸序列分 别报告在图15A和B中。

编码DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2的cDNA通过服务(Life Technologies，Paisley，英国)化学合成。DN30 Fab轻链和重 链可变结构域的核苷酸和氨基酸序列分别报告在图17A和18中。CDR 区在核苷酸和氨基酸序列二者中都标记下划线，其中重链可变结构域 的CDR具有在SEQ ID No.:19至24中陈述的氨基酸和核苷酸序列， 并且轻链可变结构域的CDR具有在SEQ ID No.:25至30中陈述的氨 基酸和核苷酸序列。

工程化所有构建体以包含5’末端处的BamHI位点和3’末端处 的NotI位点。BamHI-NotI片段被亚克隆进入pUPEX表达载体 (U-Protein Express，Utrecht，荷兰)。DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2 的中等规模生产外包给U-Protein Express，其通过瞬时转染进入 HEK(人肾上皮)细胞实现。使用STREP标签和聚组氨酸标签通过亲和 层析纯化蛋白质。纯化的蛋白被保存在PBS加0.02％的吐温 80(Sigma-Aldrich)中并在4℃下储存。通过还原和非还原条件二者下的 SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色测定纯度。

免疫沉淀法和蛋白质印迹

使用DO-24抗Met mAb(4)如所述的(12)执行免疫沉淀法。使用以 下抗体执行蛋白质印迹：识别位于Met的胞外部分中的结构域的抗人 Met mAb克隆DL-21(4)；抗磷酸酪氨酸mAb克隆4G10mAb(Millipore， Temecula，California)；抗磷酸Met(Tyr 1234/1235)、抗磷酸Met(Tyr  1349)、抗磷酸Akt(Ser 473)、抗Akt、抗磷酸ERK(Thr 202/Tyr 204)和 抗ERK多克隆Ab(Cell Signaling Technology，Beverly，Massachusetts)。

ELISA结合测定

使用固相中的Met-Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis， Minnesota)和液相中的增加浓度的FLAG标记的重组抗体通过ELISA 测定MvDN30、DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2的结合。使用与 辣根过氧化物酶缀合的抗strepTAG II抗体(IBA，Olivette，Missouri)揭 示结合。使用Prism软件(Graph Pad Software，San Diego，California) 分析和拟合数据。Met-Fc嵌合体是融合蛋白，其中衍生自人IgG的Fc 结构域融合在具有Met胞外部分的框架中。

Met活化分析

在无血清培养基中温育分会合A549人肺癌细胞48小时，并且然 后使用指示浓度的重组HGF(R&D Systems)或如所述的(13)纯化的 DN-30mAb、MvDN30、DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2刺激10 分钟。在刺激后，立刻如所述的(12)裂解和处理细胞。使用抗Met抗体 (DO-24)免疫沉淀细胞提取物，通过SDS-PAGE解离，并使用抗磷酸酪 氨酸抗体(Millipore)通过蛋白质印迹分析。使用抗Met抗体(DL-21)再 次探测相同的印迹，以标准化免疫沉淀的Met的量。

对于HGF诱导的Met磷酸化的抑制，使用MvDN30、 DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2在无血清培养基中处理A549细胞 24小时，然后如上所述使用HGF进行刺激。使用Laemmli缓冲液和等 量的总蛋白裂解细胞单层，其通过SDS-PAGE在丙烯酰胺凝胶中分离， 并且使用抗磷酸Met(Tyr 1234/1235)抗体通过免疫印迹法分析。

Met脱落的分析

使用PBS清洗分会合A549单层两次，并且然后使用指示浓度的 DN-30 FAb或mAb在无血清培养基中温育。48小时后，收集条件培养 基并使用Laemmli缓冲液裂解细胞。使用抗Met DL-21mAb通过蛋白 质印迹在50μg的总细胞裂解物和在50μg的细胞培养上清液中测定 Met蛋白水平。

体外生物测定

对于细胞生长分析，将细胞接种在96孔平皿(1,000个细胞/孔)中 包含10％的FBS的培养基中。24小时后，培养基被替换为包含DN30 衍生的分子加5％的FCS抗体的指定浓度下的新鲜培养基。72小时后， 根据制造商的指导，使用CellTiter-Glo发光细胞存活测定(Promega  Corporation，Madison，Wisconsin)评估细胞数目。使用Multilabel Reader  PerkinElmer 2030装置(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Turku， 芬兰)检测化学发光。

对于不依赖贴壁生长测定，将细胞接种在48孔平皿(500个细胞/ 孔)中包含2％的FBS和0.5％的SeaPlaque琼脂(BMA，Rockland，Maine) 的培养基中。每3天在培养基中添加抗体(1.5μM)和HGF(50ng/ml)。 21天的培养后，集落被四氮唑盐(Sigma Life Science)染色并由 MetaMorphOffline Software(Molecular Device LLC，Sunnyvale， California)评分。

药代动力学分析

成年免疫缺陷NOD-SCID小鼠(18和22gr之间，平均20gr的体 重)IP注射100μg的DCD-MvDN30.1或DCD-MvDN30.2或MvDN30。 在不同时间(对于MvDN30：递送后10、20和30分钟、1、2、4、6、 8、10、16、24、48小时；对于DCD-MvDN30.1和DCD-MvDN30.2： 递送后30分钟、1、2、4、6、8、10、16、24、48、72、96、144小时) 收集外周血。在结合测定部分中通过如上所述的ELISA，在由不同的 纯化的分子的连续稀释获取的标准曲线的线性部分上插入该样品的吸 光度值，评估治疗分子浓度。每个时间点是至少3只小鼠的平均值。

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