乙酰水杨酸在预防和/或治疗糖尿病伤口的用途

摘要

本发明涉及乙酰水杨酸或其盐，以200-4800μM的浓度在预防和/或治疗糖尿病伤口的用途。

说明书

技术领域

本发明的主题是乙酰水杨酸以200-4800μM的浓度局部使用，用 于预防和/或治疗糖尿病伤口的新用途。

背景技术

伤口愈合是一种自然的生理病理过程，其中人和动物组织能够通 过其自身修复和再生过程修复局部病变。

自然的伤口愈合主要按照三个主要的时间顺序发生。这些顺序的 每一个由特异性细胞活动表征且由大量共同管理和支持修复过程进 展的调节信号(正性和负性的)控制。因此，区分了以下：

-炎症阶段；

-增殖阶段(包括肉芽阶段和上皮化阶段)；和

–重塑阶段。

第一个阶段，即炎症阶段，在血管爆裂时，一种触发血块(血液 凝集)形成的事件，就开始，所述血块主要由纤维蛋白和纤维连接蛋 白组成且将构成临时介质。这种介质部分填充病变，使募集用来确保 洗净伤口的炎症细胞能够在受损区域内迁移。存在的血小板还释放能 够募集涉及愈合过程的细胞的因子(例如细胞因子和/或生长因子)。 该阶段的特征是在病变位点的大量炎症细胞(多形核中性白细胞、巨 噬细胞)的渗透和活化，所述炎症细胞保护生物对抗任何外来微生物， 并且还清洁或清洗伤口。

第二个阶段对应于肉芽组织的发育。首先，观察到通过成纤维细 胞的迁移和增殖的损伤定植。然后，来自健康血管的内皮细胞的迁移 允许受损组织的血管新生或血管生成。在肉芽组织中，成纤维细胞被 激活并分化成具有明显的由肌动蛋白微丝提供的收缩特性的肌成纤 维细胞，从而使伤口收缩。所述微丝通过一种蛋白，α-平滑肌肌动蛋 白表达。这些肌成纤维细胞在引起病变愈合的肉芽组织的形成和收缩 中具有重要作用。然后，角化细胞从伤口边缘迁移，然后分化，从而 导致表皮重建。

该肉芽组织的发育阶段是在病变的炎症总体状态的先前降低、多 形核中性白细胞的逐渐消失和巨噬细胞，包括“修复”巨噬细胞的出 现之后开始。从炎症阶段到增殖/修复阶段的过渡称为炎症消退阶段。

过程的第三个阶段主要是目的为重建功能性组织的重塑期，使得 新形成的组织呈现原组织的初始特征和性能。部分细胞外介质被蛋白 酶(基本上是介质金属蛋白酶和弹性蛋白酶)消化，并观察到细胞外 介质的重组。在肉芽组织中占主要地位的III型胶原蛋白逐渐被真皮 的主要介质成分I型胶原蛋白替代。在成熟阶段结束时，成纤维细胞、 肌成纤维细胞和血管细胞的增殖和/或活性降低。然后，伴随细胞外介 质的重塑，过量细胞通过细胞凋亡死亡。

然而，尽管已经建立最好的可能的理化和生物条件，某些类型的 伤口不会正确地愈合，因为过程中的3个关键阶段发生异常。实际上， 伤口愈合的速度和质量取决于内在和外在因素。因此，修复过程可能 随着以下被异常地延长：

–伤口的病因；

–伤口的状态和位置；

–由某些传染性病原体，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus  aureus)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的存在造成的感染 的发生；

–之前存在的病理病症的存在(例如糖尿病、免疫缺陷、静脉功 能不全等)；

–外部环境；或

–易患或不易患愈合障碍的遗传因子。

这些伤口中有慢性伤口，例如静脉溃疡、褥疮或糖尿病受试者特 征的伤口，更尤其是糖尿病足伤口。

慢性伤口定义为伤口出现开始后6周时间内没有愈合，不管应用 何种治疗。糖尿病伤口被表征为与慢性伤口不同的特殊类型。

实际上，这些糖尿病伤口没有愈合的主要原因与葡萄糖生物利用 度的增加相关。这引起大量生理和代谢的改变，例如皮肤增厚，或明 显的导致神经病和动脉病的氧化应激。神经病和动脉病是慢性化并因 此延迟糖尿病伤口，更尤其是糖尿病足伤口的愈合的两个主要风险因 子。最有名的其他类型的慢性伤口，例如褥疮或静脉、动物或混合溃 疡，不遵循相同的病理学。例如，静脉功能不足是静脉溃疡的形成、 慢性化且因此延迟愈合的原因。对于褥疮而言，它们是在皮肤组织的 过度和长期的压力和摩擦之后的缺血和再灌注的循环后出现的伤口。

以这种方式，患有伤口的所有糖尿病患者均暴露于经常导致所述 患者发病和死亡的并发症。几个主要问题干扰了该类型受试者中的正 确愈合顺序。愈合的第一次延迟自炎症阶段发生：从炎症阶段到增殖 阶段的通路被干扰。这称为炎症消退中的问题。炎症阶段是愈合中的 必要阶段，但它必须是暂时的。炎症消退是影响其他愈合阶段开始的 关键点。该动态性事件涉及炎症细胞(多形核中性白细胞)的消失以 及巨噬细胞的出现。然后，产生趋化性和血管生成的抗炎介质，其显 著地使作为肉芽阶段中的关键细胞的成纤维细胞能够迁移和分化。

如在上述受试者的情况下，对该炎症阶段的干扰导致炎症阶段的 异常延长，并引起伤口慢性，从而延迟所有随后的愈合阶段。

最后，上皮形成过程中的伤口闭合阶段明显被延迟，或者在大多 数情况下，不会发生。

长期以来，已知阿司匹林，或乙酰水杨酸，被认为是对于各种各 样的症状或病理病症的有效的补救方法。它最普遍的作用模式是旨在 缓解疼痛或退烧的长期建立的活性。它也以低剂量被用于预防心血管 疾病发作(抗血栓作用)。

实际上，抑制聚集的性能使其能够有效防止血管中血块的形成。 然而，似乎这种活性在第一次血管疾病之后的预防作用的范围内更为 有利，而不是作为这种物质的真正功效似乎难以确定的初级预防。

在上述提及的每一种情况中，阿司匹林的口服施用在此是一个问 题。也存在通过局部途径应用阿司匹林。实际上，通过局部应用阿司 匹林已知对增生性疤痕，尤其是改善这些疤痕的外观具有有利作用 (参考Wound Repair Regen.,2012Nov 5.,Epub ahead of print,Topical  application of a film-forming emulgel dressing that controls the release of  stratifin and acetylsalicylic acid and improves/prevents hypertrophic  scarring,by Rahmani-Neishaboor E,Jallili R,Hartwell R,Leung V,Carr  N,Ghahary A,Department of Surgery,Division of Plastic Surgery, University of British Columbia,Vancouver,BC,Canada)。

此外，乙酰水杨酸或阿司匹林或其衍生物对于普通伤口的愈合以 及伤口疼痛的积极作用也是已知的，无论其抑制聚集的活性如何，这 似乎与其意欲的促愈合作用矛盾。

实际上，来自Kimberly Clark公司的专利申请EP 1 581 252描述 了用于刺激细胞增殖，更尤其是成纤维细胞和角化细胞增殖的包含阿 司匹林的组合物。所述组合物通过刺激细胞增殖促进伤口愈合。该文 件揭示了阿司匹林的功效在10^-5至10^-6的浓度是剂量依赖性的，其中 最有效的剂量是最低的浓度。描述的最终组合物包含浓度为1μM至 5mM的阿司匹林。细胞增殖，即成纤维细胞和角化细胞增殖的刺激， 以及胶原蛋白生产的刺激是愈合中的重要过程，发生在增殖阶段和非 常后期的重塑阶段。

对此，来自日本公司Teikoku的专利申请EP 0 784 975方面描述 了用于局部应用的意欲治疗在具有褥疮的大鼠模型中显著模拟的皮 肤损伤的基于阿司匹林的药物制剂。值得注意的是，这些模型是健康 的动物模型。实际上，研究中的大鼠均没有糖尿病类型的任何代谢疾 病。在该申请中，制剂的目的是在具有一个或多个伤口的健康动物中 提高肉芽组织形成的速度以及表皮修复的速度。因此，该申请在其最 后阶段尽力恢复细胞的愈合过程。

这些文件均不涉及愈合的第一阶段，即炎症阶段及其消退，而所 述炎症阶段是必要且不可缺少的阶段，因为它启动了总体的愈合过 程。实际上，糖尿病伤口在愈合过程的动力学中需要更早的治疗或干 预。

因为这些原因，申请人观察到真的需要进行早期、有效和靶向的 糖尿病伤口的治疗。

发明内容

完全出乎意料地，申请人能观察到使用阿司匹林能够重建也可以 描述为正常(没有延长且没有加重)的受控的炎症阶段，也能够加快 炎症消退，从而能够在糖尿病受试者中获得更早和更快的伤口闭合。

因此，本发明的一个主题是乙酰水杨酸或其盐以200-4800μM的 浓度局部使用，用于预防和/或治疗糖尿病伤口的用途。

因此，本发明的一个主题是以200-4800μM的浓度用于预防和/ 或治疗糖尿病伤口的乙酰水杨酸或其盐。

本发明的另一个主题是用于预防和/或治疗糖尿病伤口的包含浓 度为200-4800μM的乙酰水杨酸或其盐的药物组合物。

术语“糖尿病伤口”意欲是指在患有I型或II型糖尿病的糖尿病 受试者中出现的伤口，特别是选自下肢的伤口，优选糖尿病足伤口。

术语“乙酰水杨酸的盐”意欲是指具有药学上可接受的阳离子的 乙酰水杨酸的盐，优选赖氨酸乙酰水杨酸或乙酰水杨酸钠。

在本发明的上下文中，术语“有效量”意欲是指每个伤口乙酰水 杨酸或其盐的量为7.2x 10^-3-0.173mg，优选每个伤口为7.2x 10^-3-0.1044mg，更优选每个伤口为1.08x 10^-2-7.2x 10^-2mg。乙酰水 杨酸或其盐的这个量是置于直接接触伤口的量。所述伤口可以定义为 具有接近1cm²的表面积。然而，乙酰水杨酸或其盐的有效剂量随着 各种参数而改变，例如伤口大小、待治疗个体(人或动物)的体重、 年龄、性别、敏感度以及类型。因此，最佳有效剂量将会根据由本领 域专家评判为相关的参数来确定。

术语“慢性化”意欲是指在所述伤口愈合中的任何延迟。

术语“治疗”糖尿病伤口意欲是指所述伤口的愈合和闭合。

术语“预防”糖尿病伤口意欲是指防止所述伤口延迟愈合或慢性 化。

乙酰水杨酸或其盐在本发明中以其有效浓度使用。实际上，当以 低于200μM，例如低于100μM的浓度使用时，乙酰水杨酸或其盐对 加快糖尿病伤口的愈合速度没有效果。

相似地，在大于或等于5000μM的浓度，乙酰水杨酸对加快糖尿 病伤口的愈合不再具有有利作用，甚至对伤口中存在的某些细胞，例 如巨噬细胞的活力具有有害作用。

根据一个优选的实施方案，乙酰水杨酸或其盐以200-2900μM的 浓度使用。

根据一个甚至更优选的实施方案，乙酰水杨酸或其盐以 300-2000μM的浓度使用。

优选地，定义的乙酰水杨酸或其盐的浓度是与伤口接触的分配浓 度。

优选地，乙酰水杨酸或其盐用于治疗糖尿病伤口的慢性化。具体 地，乙酰水杨酸或其盐能够重建“受控的”(没有延长且没有加重) 炎症阶段，能够加快炎症消退，最后能够加快伤口闭合的动力学。

优选地，根据本发明的乙酰水杨酸或其盐在生理学上可接受的介 质中配制从而获得药物组合物。术语“生理学上可接受的介质”意欲 是指与皮肤、伤口、粘膜和表皮(integument)相容的介质。

优选地，乙酰水杨酸或其盐与脂质或高氧油或它们的衍生物之一 组合。所述脂质或高氧油可以在已经包含乙酰水杨酸或其盐的药物组 合物中配制，或可以独立于乙酰水杨酸或其盐施用。优选地，脂质是 Ω-3或Ω-6脂肪酸，或两者的组合。

术语“Ω-3”意欲是指选自由α-亚麻酸、二十碳五烯酸或二十二 碳六烯酸组成的非限制性列表的任何化合物。

术语“Ω-6”意欲是指选自由亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、 二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸或二 十二碳五烯酸组成的非限制性列表的任何化合物。

术语“高氧”油意欲是指植物来源的任何高氧油，这种油通过 UV分光光度法的定义是其E270因子为10-20，E232因子为8-60。

优选地，植物来源的高氧油的过氧化程度以每千克毫当量表示为 30-300，氧化甘油脂的含量为5-40。

仍然优选地，植物来源的高氧油的过氧化程度以每千克毫当量表 示为50-150。

根据一个优选的实施方案，植物来源的高氧油选自玉米油、甜杏 仁油、红花油、榛子油、花生油、橄榄油、菜籽油、大豆油、月见草 油、葵花油、葡萄籽油、芝麻油，以及它们的混合物，优选玉米油。

乙酰水杨酸或其盐，以及包含它们的药物组合物，优选局部施用， 即通过局部途径。通过局部途径施用涉及活性成分，在本文中是乙酰 水杨酸或其盐，在被皮肤、伤口或粘膜吸收后在局部起作用。存在各 种药学形式，例如溶液、乳剂、霜剂、软膏、洗剂、贴剂、凝胶、敷 料、微胶囊、微纤维、喷雾剂、粉末或纳米纤维。

优选地，乙酰水杨酸或其盐包含于选自敷料、微胶囊、微纤维、 纳米纤维、溶液、洗剂、凝胶、贴剂、乳剂、霜剂、软膏、粉末或喷 雾剂的(药物)组合物中。

当根据本发明的药物组合物是乳剂形式时，它包含至少一种水性 和/或一种油相，和表面活性剂。实际上，传统的乳剂是两种不混溶液 体的不稳定的拟均相体系，其中一种以小液滴(胶束)的形式分散于 另一种中。这种分散体凭借改变界面力的结构和比例的表面活性剂的 作用稳定，因此通过降低界面张力的能量提高分散体的稳定性。

根据本发明的药物组合物也可以是凝胶的形式；在这种情况下， 它包含一种或多种凝胶化合物。

当根据本发明的药物组合物是溶液的形式时，除了乙酰水杨酸或 其盐，它包含水性或油性溶液，以及任选的一种或多种溶剂和/或乙酰 水杨酸或其盐的促渗透剂。

根据本发明的药物组合物还可以包含惰性添加剂或这些添加剂 的组合，例如：

–增稠剂或乳化剂；

–pH调节剂；

–UV-A和UV-B防晒剂；和

–抗氧化剂。

增稠剂或乳化剂可以选自包含尤其是黄原胶或表面活性剂家族 的化合物的非限制性列表。

pH调节剂可以选自包含尤其是碳酸盐的化合物的非限制性列表。

UV-A和UV-B防晒剂可以选自包含化学和矿物防晒剂的化合物 的非限制性列表。化学防晒剂有奥克立宁、二苯甲酮、甲酚曲唑三硅 氧烷、或阿伏苯宗。矿物防晒剂有氧化锌或二氧化钛。

抗氧化剂可以选自尤其是包含醋酸生育酚或抗坏血酸的化合物 的非限制性列表。

当然，本领域技术人员将会谨慎选择待加入这些药物组合物的最 佳化合物，以使与本发明本质上相关的有利性能不会，或基本上不会 被有意的添加改变。

这些添加剂按重量计可以相对于组合物总重量的0.001-20％存在 于组合物中。

以下将以非限制性说明的方式给出实施例。

通过阅读以实施例的方式提供的本发明的优选实施方案的以下 描述，本发明的其他特征和优势将变得更加显而易见。所述实施方案 参考以下图例。

附图说明

图1：“对照”小鼠和糖尿病小鼠(HFD和db/db)中伤口闭合 的动力学。

图2：来自“对照”小鼠和糖尿病小鼠(HFD和db/db)的渗出 物的评估以及渗出物中细胞数的定量。表格的图例如下：

没有渗出物：-

渗出(weeping)：+/-

轻度渗出：+

中度渗出：++

强烈渗出：+++

图3：来自“对照”小鼠和糖尿病小鼠(HFD)的渗出物中多形 核中性白细胞和巨噬细胞总数的定量。

图4：用乙酰水杨酸处理的“对照”小鼠和糖尿病小鼠(db/db) 中伤口闭合的动力学。

图5：用乙酰水杨酸处理的“对照”小鼠和糖尿病小鼠(db/db) 中伤口闭合的动力学。

图6：在乙酰水杨酸存在下的巨噬细胞的体外活力。

图7：用乙酰水杨酸处理的“对照”小鼠和糖尿病小鼠(HFD) 中细胞渗入伤口的动力学。

具体实施方式

材料&方法

db/db小鼠

纯合的db/db小鼠在瘦素受体基因中有一个点突变，瘦素是明显 控制饱胀感的激素。db/db小鼠从其生命的第3/4周开始变得贪食和 自发性肥胖。这些动物的特征是高血糖、抗胰岛素和高甘油三酯血症， 这使得这些小鼠成为遗传来源的糖尿病模型的第一选择。db/db小鼠 的“对照”组小鼠是杂合的db/+小鼠。

HFD小鼠：

HFD小鼠是诱导糖尿病的鼠科模型，产自8周大的C57BL/6小 鼠。这些小鼠进行16周的高热量(高脂肪)饮食。它们由于其脂肪 组织的增加显示高的体重增加，还发展葡萄糖不耐受和抗胰岛素性。 与db/db小鼠不同，这些动物中的糖尿病状况不是来自于遗传。HFD 小鼠的“对照”组小鼠是标准饮食的小鼠，也简称为“NC”。

所有动物均置于22℃下被分为12小时黑暗随后是12h光亮的日 循环中，持续获得食物和水。小鼠中糖尿病的建立通过能够评估葡萄 糖代谢的两种测试验证：葡萄糖耐受性测试(IPGTT)和胰岛素敏感 度测试(IPIST)。

监测愈合动力学：

通过异氟醚(卤化麻醉剂)麻醉小鼠。将小鼠的背部和侧面剃毛、 消毒，并进行接近1cm²的圆形切除。除去肌肉组织界面的连接组织 而不损坏肌筋膜。完全切除远至脂膜(panniculus carnosus)的皮肤。

用例如Laboratoires Urgo提交的专利申请FR 11 62295和FR 11  62344中所述的设备保护由此产生的伤口，所述设备使得能够保护伤 口、观察、评估愈合动力学，以及使得能够收集渗出物。

伤口愈合过程在伤后观察0-30天。对每只动物拍3-5张非常高分 辨率的标准数字照片。伤口闭合的百分比基于在所示时间点对相同小 鼠上相同损伤的计算的表面积的变化。因此，独立获得每组3只小鼠 的伤口愈合的计算平均值(以百分比表示)，从3组的3个独立实验 中计算统计数据。

从伤后D1回收渗出物中的细胞，直到伤口不再分泌渗出物。为 了测定多形核中性粒细胞渗透的动力学，用流式细胞仪和与膜受体 Ly6G、7/4(多形核中性粒细胞)和F4/80(巨噬细胞)相关的免疫标 记表征伤口处渗出物中的细胞。每个样品分析总共10000个事件。所 有结果均以百分比形式表示。

获得的结果

结果以平均值±SEM表示。SEM是指平均值的标准偏差。它代 表样品平均值相对于真实群体平均值的偏差。它通过标准偏差除以样 品大小的平方根来计算。根据与每组至少3个受试者(n＝3)相关的 多重比较法，Bonferroni-Dunnet测试进行统计学分析。

P<0.05(*)被认为是统计学上显著的。

A.监测愈合

伤口闭合的动力学(图1A和1B)：

在“对照”小鼠中，观察到伤口在14天内完全闭合。另一方面， 在HGF小鼠中，这种完全闭合仅在18天的时间之后获得，即有效的 4天延迟(图1A)。

在db/db小鼠中，伤口仅在D26至D28有效地完全闭合，即相对 于它们各自的对照，愈合延迟了10-12天(图1B)。

因此，在糖尿病小鼠(HFD和db/db)中，存在伤口闭合的显著 延迟。

愈合的肉眼观察(渗出物+肉芽组织)(图2)：

在“对照”小鼠中，随着皮肤损伤的生成，观察到伤口处逐渐出 现肉芽组织的铺设。其扩散不是均匀的，而是在伤口边缘的各个点开 始，并在5天内完全填满。该组织随着愈合进展而增厚。

糖尿病小鼠从伤后第二天显示出这种肉芽组织铺设的延迟。在糖 尿病小鼠中，损伤的完全填满仅在伤后7天出现，即与“对照”小鼠 相比多两天。

在糖尿病小鼠中，肉芽组织的铺设伴随渗出现象。这种富含细胞 和介质的液体在生成损伤时就产生。在“对照”小鼠中，在伤后D3 达到最高产量。

另一方面，糖尿病小鼠(HFD和db/db)从伤后D2显示多得多 的渗出物体积，这特别地持续了一段时间(图2)。

因此，糖尿病小鼠中肉芽组织的铺设有显著的延迟，伴随更多且 更持续的渗出。

B.渗出物中存在的细胞群体的分析(图2、3A和3B)

“对照”小鼠通常具有低体积渗出物，且在该渗出物中的细胞渗 透有限。在伤后第2天直至伤后5天观察到渗出物中的细胞渗透。在 伤后D3观察到细胞渗透的峰值(图2)。

糖尿病小鼠渗出物中的细胞渗透动力学与“对照”小鼠中观察到 的不同。实际上，观察到持续长达伤后D7时间的更多的细胞渗透(图 2)。

糖尿病小鼠中损伤位点的多形核中性粒细胞的持续解释了细胞 渗透随时间变化的差异。实际上，在“对照”小鼠中，多形核中性粒 细胞在伤后5天结束时消失，而在糖尿病小鼠中，该细胞群体持续长 达伤后D7时间(图3A)。因此，显而易见糖尿病组中渗透皮肤损伤 的多形核中性粒细胞的百分比远大于“对照”组。

糖尿病小鼠显示多得多的细胞渗透，这是由在损伤位点的多形核 中性粒细胞的持续造成的。

在“对照”小鼠中，巨噬细胞从伤后D3到达损伤位点。相反， 在糖尿病小鼠中，这种细胞渗透在伤后D3几乎不可见，且在随后肉 芽组织的铺设中没有增加(图3B)。

糖尿病小鼠显示更多的细胞渗透，其原因是：

-在损伤位点多形核中性粒细胞的持续；

-募集巨噬细胞的延迟；和

-这些多形核中性粒细胞没有消失。

在用乙酰水杨酸处理的小鼠中获得的结果

A.在各种浓度的乙酰水杨酸存在下监测糖尿病小鼠的愈合动力学

伤口闭合的动力学(图4、5、和6)：

如上所述，通过异氟醚麻醉小鼠。将小鼠的背部和侧面剃毛、消 毒，并进行接近1cm²的圆形切除。除去肌肉组织界面的连接组织而 不损坏肌筋膜。完全切除远至脂膜的皮肤。

同时，制备5mM的乙酰水杨酸参考溶液。该溶液将用来制备浓 度为100μM、200μM、300μM、1mM、2mM、2.9mM、4.8mM和 5mM的溶液。

测试乙酰水杨酸浓度为100μM、200μM、300μM、1mM、2mM、 2.9mM、4.8mM和5mM的溶液。

为了精确，为乙酰水杨酸浓度和在伤口的施用剂量建立查找表- 参见如下。在伤口施用的这些剂量对应于本发明的具体的实施方案。

表1：

取各溶液50-500μl，使其通过例如Laboratoires Urgo提交的专利 申请FR 11 62295和FR 11 62344所述的设备接触伤口。

值得注意的是，所述将预定浓度的乙酰水杨酸与愈合位点接触从 伤后第3天开始进行。实际上，与“对照”小鼠相比，糖尿病小鼠在 这段时间内出现愈合延迟(图1A和1B)。而且，在治疗糖尿病患者 的情况下，被治疗的伤口将已经形成，且将在炎症阶段被阻止。慢性 伤口，更尤其是糖尿病伤口，不会一出现就治疗。而且，炎症阶段是 愈合中不可缺少的阶段，因为它能够凭借炎症细胞，例如多形核中性 粒细胞的渗透来清洁并清洗伤口。因此，有必要保留炎症来启动有效 愈合，从而没有完全阻断该阶段。这就是为什么提出从伤后D3才开 始用乙酰水杨酸治疗。

图4A和4B描述了应用NaCl溶液(对应于我们的“对照”)或 300μM或1000μM或2000μM的乙酰水杨酸溶液后糖尿病小鼠的伤 口愈合的动力学。

用300μM、1000μM和2000μM的乙酰水杨酸处理的糖尿病小 鼠具有与“对照”小鼠完全不同的愈合动力学。在“对照”糖尿病小 鼠中，伤后闭合在26天内完成，而用300μM和1000μM乙酰水杨 酸处理的糖尿病小鼠在大约伤后20天伤口就闭合。类似地，图4B揭 示了2000μM的剂量有相同结果。

此外，从图4可以看出，可能观察到用300μM、1000μM和2000 μM的乙酰水杨酸溶液处理的伤口在愈合早期(炎症阶段)，即伤后 D3-D7，闭合速度增加。这种在伤后D3-D7的愈合加快与炎症消退的 速度加快有关。因此，施用了乙酰水杨酸溶液的小鼠其愈合速度和伤 口闭合速度与“对照”小鼠相比大大加快。

总之，局部施用300μM、1000μM和2000μM的乙酰水杨酸溶 液重建受控的炎症阶段并诱导非常明显的炎症消退加快，从而使伤口 闭合速度(在大约伤后D20)与“对照”糖尿病小鼠相比增加。

图5描述了应用NaCl溶液(对应于我们的“对照”)或100μM 或5000μM的乙酰水杨酸溶液后糖尿病小鼠的伤口愈合的动力学。

“对照”糖尿病小鼠和用100μM和5000μM的乙酰水杨酸处理 的糖尿病小鼠的愈合动力学相似，没有任何显著差异。与“对照”糖 尿病小鼠相比，在引入所述浓度的乙酰水杨酸与伤口接触后，没有观 察到愈合动力学上的效果，尤其是在炎症阶段期间和在肉芽组织的铺 设期间。

总之，对糖尿病小鼠的伤口局部施用100μM和5000μM的乙酰 水杨酸溶液对于重建受控的炎症阶段或加快炎症消退没有效果，因此 不能够增加伤口闭合的速度。

此外，对于各种浓度的乙酰水杨酸在巨噬细胞上进行了细胞活力 测试(图6)。

这种分析方法包含使用人外周血来源的单核细胞，将所述单核细 胞置于添加了10ng/ml M-CSF的RPMI培养基中培养24小时以使其 分化成巨噬细胞。向培养基中添加乙酰水杨酸，使其最终浓度为1000 μM或5000μM。

在孵育72小时后，通过流式细胞仪测量碘化丙啶的胞浆融入分 析细胞死亡率。

进行这种体外细胞活力测试的目的是验证施用剂量对伤口中发 现的细胞无害，优选在巨噬细胞的情况下，所述巨噬细胞被认为是研 究的损伤愈合中的一种效应细胞。实际上，这种研究不能在多形核中 性粒细胞中进行，因为它们体外死亡率的基础水平太高。

图6表明，向细胞体外施用5000μM剂量的乙酰水杨酸72小时 后，细胞活力非常明显地丧失，其中活力值降低了20％，因此可被表 征为有害。

相反，应用1000μM的剂量没有显示细胞毒性。

因此，向伤口施用5mM浓度的溶液不仅对于愈合动力学无效(图 5)，还证明对愈合位点存在的细胞有害(图6)。

B.渗出物中存在的细胞群体的分析(图7)

图7描述了在“对照”糖尿病小鼠或应用了1000μM乙酰水杨酸 溶液的糖尿病小鼠中进行的细胞渗透动力学。

在伤后D7，注意到用乙酰水杨酸处理能够使经处理糖尿病小鼠 中渗入损伤位点的细胞数显著减少。

因此，在阅读所有以上结果后可以总结，基于浓度为100μM至 4800μM的阿司匹林的处理(从伤后D3起施用)能够减少糖尿病小 鼠中的细胞渗透，重建受控的炎症阶段，并加快炎症消退，最后能够 增加伤口闭合的速度。

因此，乙酰水杨酸对于糖尿病个体在炎症消退的过程中以及从而 在伤口闭合的速度上起至关重要的作用。