梅岭霉素合成基因簇中酮还原酶MeiF在手性芳香醇生产中的应用

摘要

本发明公开了一种表达纯化酮还原酶MeiF生物制备手性芳香醇的方法，及其在以芳香酮为底物生物制备手性芳香醇中的应用。以纯化的该酮还原酶和葡萄糖还原酶GDH作为催化剂，在只需要添加NADP+的条件下实现了以芳香酮为底物高效生物制备手性芳香醇。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)中梅 岭霉素(Meilingmycin)合成基因簇中的酮还原酶MeiF及其编码基因meiF，含有该基因的表达 载体和含有该表达载体的克隆菌株及表达菌株，及酮还原酶MeiF的表达及制备方法，还涉 及酮还原酶MeiF作为催化剂在制备手性芳香醇中的应用。

背景技术

手性制药业是目前医药行业的前沿领域，而手性药物已在世界医药市场占有重要的份额， 成为国内外上新药研究的热点。对于手性药物而言，其中的一个异构体有效，另一个异构体 可能就无效甚至是有害。手性制药具有很多优势：临床上，对映体纯的手性药物既可以排除 无效对映体所引起的毒副作用，也能减少药剂量和人体对无效对映体的代谢负担，提高药物 的专一性。因而具有十分广阔的市场前景和巨大的经济价值。手性药物的前体一般是手性醇， 像手性芳香醇类在药物工业有重要的应用，可分别作为合成(R)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等多种 治疗神经系统、心血管等疾病的手性药物的重要中间体。手性芳香醇一般可以利用从天然产 物中提取、外消旋体拆分法、化学合成和生物合成等方法生成。相对于其他手性芳香醇的合 成方法，生物酶催化的反应条件温和，无需强酸或强碱、极端温度和压力；立体选择性好，可 避免因反应条件苛刻而导致的消旋化、异构化及重排等副反应，也免除了传统有机合成中通常 为了阻断不必要的副反应而需要的基团保护和去保护措施；反应效率高，能大幅度加快反应 速度。同时酶催化反应一般不会产生毒副产物，在环境污染问题上比传统化学合成方法要小 得多，具有广阔的应用前景和商业价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是重组大肠杆菌表达酮还原酶MeiF制备手性芳香醇的方法。

为解决上述技术问题，设计技术方案如下：

用于不对称制备手性芳香醇的重组大肠杆菌，是导入酮还原酶基因meiF的大肠杆菌。用 于提供还原力NADPH的大肠杆菌为导入了葡萄糖脱氢酶GDH的大肠杆菌。

上述酮还原酶基因meiF含有813bp碱基，在Genebank中的收录号是FJ952082.1，其基 因序列如SEQ ID NO：1所示。有该基因编码的酮还原酶MeiF包含270个氨基酸，其氨基酸 序列如SEQ ID NO：2所示。

上述葡萄糖脱氢酶GDH基因含有786bp碱基，其在Genebank中的收录号为D50453.1， 其基因序列如SEQ ID NO：3所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶包含261个氨基酸，其氨基 酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明从南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)基因组中克隆了酮还原酶MeiF编码 基因，将其构建到表达载体pET28a上并在大肠杆菌中表达。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 基因组中克隆了葡萄糖还原酶GDH的编码基因，并将其构建到表达载体pET28a上并在大肠 杆菌中表达。表达所用的大肠杆菌是本实验室保藏的Ecoli BL21(DE3)。

构建上述重组大肠杆菌的方法如下：PCR克隆酮还原酶MeiF编码基因和葡萄糖还原酶 GDH的编码基因，将其构建到pET28a上分别在大肠杆菌中表达，获得制备手性芳香醇的重 组大肠杆菌。

构建的表达酮还原酶的大肠杆菌能以芳香酮为底物合成手性芳香醇，而所构建的葡萄糖 脱氢酶GDH能以葡萄糖为辅助底物，使得NADPH循环再生，所以在反应中加入少量的 NADP+就可以实现NADPH的高效循环利用。

酮还原酶MeiF及葡萄糖还原酶GDH的蛋白诱导表达条件如下：表达温度16度，摇床 转速220rpm，IPTG浓度为0.3mM，表达时间为12-16小时。

酮还原酶MeiF及葡萄糖还原酶GDH的蛋白纯化条件如下：低温离心机4000rpm收集菌 体，Bindingbuffer清洗菌体后4000r／m收集菌体，菌体重悬于Bindingbuffer中进行超声破碎， 然后12000rpm低温超速离心50分钟手机上清。上清过镍柱后收集蛋白。

利用上述重组大肠杆菌表达的蛋白制备手性芳香醇的方法如下：

生物反应中以芳香酮为底物，以NADP+为辅因子，由纯化的酮还原酶MeiF及葡萄糖还 原酶GDH转化生成手性芳香醇。

其中，反应体系是：底物芳香酮0.5mM；Tris buffer(pH7.5)50mM；NaCl100mM：10％ 甘油；NADP⁺100μM；D-葡萄糖200mM；GDH5μM；酮还原酶MeiF20μM；水。

其中，所述反应温度为12-42度，反应时间为1-48小时，反应转速为60-240rpm。

反应产物的高效液相(HPLC)鉴定方法如下：

反应产物利用煮沸加热5分钟终止反应，12000rpm超速离心5分钟后过0.2μm滤膜后 取20μl样品上样高效液相进行分析。

其中，高效液相紫外吸收波长为245nm，液相柱为C-18反相柱，流动相为水和甲醇。

其中，洗脱条件为：0-15分钟10％-100％甲醇；15-20分钟100％甲醇；20-21分钟100％-10 甲醇；21-26分钟10％甲醇。

有益效果：本发明可以利用纯的酮还原酶MeiF作为催化剂合成手性芳香醇，降低了生产 成本和环境污染，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为酮还原酶MeiF催化芳香酮生成手性芳香醇的反应式；图2为酮还原酶MeiF的蛋白表 达SDS-PAGE图；图3为葡萄糖还原酶GDH的蛋白表达SDS-PAGE图；图4为酮还原酶 MeiF以苯丙酮为底物催化生成苯丙醇的反应物的高效液相色谱分析图；图5为酮还原酶MeiF 以苯乙酮为底物催化生成苯乙醇的反应物的高效液相色谱分析图；图6为酮还原酶MeiF以 对氯苯乙酮为底物催化生成对氯苯乙醇的反应物的高效液相色谱分析图；图7为酮还原酶 MeiF以4-氟苯乙酮为底物催化生成4-氟苯乙酮的反应物的高效液相色谱分析图。

具体实施方式

实施例1南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)中梅岭霉素(Meilingmycin)合成基因簇中 的酮还原酶编码基因meiF克隆

利用基因组提取试剂盒(博迈德)提取南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)基因组。

构建表达载体所用的引物加酶切位点，引物由上海生工合成：

meiF-F：ATCGTAATCCATATGacccaaacagctggaaaaaccgcactggtga NdeI酶切位点

meiF-R：TGATTCGATGAATTCatcggctcacctgtggcgcctcatgcggtga EcoRI酶切位点

meiF基因的PCR体系如下(25μl)：

meiF基因的PCR扩增程序如下：

94度预变性4分钟；94度变性1分钟，68-58度退火30秒，68度延伸1分钟，5个循环，每 个循环退火温度将两度进行降落PCR；94度变性1分钟，64度退火30秒，68度延伸1分钟， 25个循环；68度延伸10分钟。

实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中葡萄糖还原酶GDH编码基因克隆

利用基因组提取试剂盒(博迈德)提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组。

构建表达载体所用的引物加酶切位点，引物由上海生工合成：

meiF-F：ATCGTAATCCATATGtatccggatttaaaagg NdeI酶切位点

meiF-R：TGATTCGATGAATTC ttaaccgcggcctgcctgg EcoRI酶切位点

GDH编码基因的PCR体系如下(25μl)：

GDH编码基因的PCR扩增程序如下：

94度预变性4分钟；94度变性1分钟，68-58度退火30秒，68度延伸1分钟，5个循环，每 个循环退火温度将两度进行降落PCR；94度变性1分钟，64度退火30秒，68度延伸1分钟， 25个循环；68度延伸10分钟。

实施例3酮还原酶编码基因meiF表达载体pET28a+meiF的构建

酶切连接：利用NdeI、EcoRI对meiF的PCR产物和载体pET28a在37度酶切3个小时 后按DNA片段与载体3∶1的比例利用T4DNA连接酶进行室温过夜连接。

转化：连接产物转化至大肠杆菌感受态Ecoli BL21中，37度培养箱中过夜培养。

酶切验证：挑取单克隆于LB+Kana中进行培养收取菌体提取质粒，利用NdeI、EcoRI 酶切治理验证meiF基因片段是否连接至pET28a。

测序验证：将酶切验证正确的质粒送至上海生工进行测序验证，序列为SEQ ID NO：1。

实施例4葡萄糖还原酶GDH编码基因表达载体pET28a+GDH的构建

酶切连接：利用NdeI、EcoRI对meiF的PCR产物和载体pET28a在37度酶切3个小时 后按DNA片段与载体3∶1的比例利用T4DNA连接酶进行室温过夜连接。

转化：连接产物转化至大肠杆菌感受态Ecoli BL21中，37度培养箱中过夜培养。

酶切验证：挑取单克隆于LB+Kana中进行培养收取菌体提取质粒，利用NdeI、EcoRI 酶切治理验证GDH编码基因片段是否连接至pET28a。

测序验证：将酶切验证正确的质粒送至上海生工进行测序验证，序列为SEQ ID NO：3。

实施例5酮还原酶MeiF的蛋白诱导表达及纯化

诱导表达：将含有pET28a+meiF表达载体的BL21单克隆挑至100ml LB+Kana培养基中 进行培养，培养至OD值约为0.6时转接至1L LB+Kana中培养至OD值为0.4时加入终浓度 为0.3mM的IPTG，在16度，220rpm的条件下过夜培养。

镍柱纯化：4000rpm收集菌体，菌体利用Binding buffer清洗后重悬于Binding buffer中。 重悬液超声破碎后12000rpm低温超速离心50分钟，上清过镍柱后利用含有咪唑的Elutebuffer 洗脱收集蛋白。

实施例6葡萄糖还原酶GDH的蛋白诱导表达及纯化

诱导表达：将含有pET28a+GDH表达载体的BL21单克隆挑至100ml LB+Kana培养基中 进行培养，培养至OD值约为0.6时转接至1L LB+Kana中培养至OD值为0.4时加入终浓度 为0.3mM的IPTG，在16度，220rpm的条件下过夜培养。

镍柱纯化：4000rpm收集菌体，菌体利用Binding buffer清洗后重悬于Binding buffer中。 重悬液超声破碎后12000rpm低温超速离心50分钟，上清过镍柱后利用含有咪唑的Elutebuffer 洗脱收集蛋白。

实施例7酮还原酶MeiF酶活反应

将纯化得到的MeiF及GDH进行酶活反应。

酶活测定体系(500ul)：底物芳香酮0.5mM；Tris buffer(pH7.5)50mM；NaCl100mM； 10％甘油；NADP⁺100μM；D-葡萄糖200mM；GDH5μM；酮还原酶MeiF20uM；水。22度， 140rpm反应20小时。

实施例8产物检测

反应产物利用煮沸加热5分钟终止反应，12000rpm超速离心5分钟后过0.2μm滤膜后 取20μl样品上样高效液相进行分析，测定产物量及转化率。

高效液相紫外吸收波长为245nm，液相柱为C-18反相柱(4.6mm×250mm)，流动相为水 和甲醇。其中，洗脱条件为：0-15分钟10％-100％甲醇；15-20分钟100％甲醇；20-21分钟 100％-10甲醇；21-26分钟10％甲醇。流速为0.8ml／min。苯丙醇和苯丙酮的保留时间分别为： 18.25min和18.75min；苯乙醇和苯乙酮的保留时间分别为17min和17.25min；对氯苯乙醇 和对氯苯乙酮的保留时间分别为18.8min和19.25min；4-氟苯乙醇和4-氟苯乙酮的保留时间 分别为17.6min和17.75min。其中苯丙酮的转化率大于30％。

核苷酸或氨基酸序列表

中国科学院过程工程研究所生化国家重点实验室

美链霉素合成基因簇中酮还原酶MeiF在手性醇生产中的应用

4

1

813

DNA(meiF)

1

1ctacatgccc ggtggtgtgg gggccagggc catgccgccg gaggcgtcga ccagttgtcc

61ggtgacccag cgggcctcgt ccgaggcgag gagggcgacg acatcggcga tgtcggacgg

121ctgaccgagt cggcgcagtg cggtcatggc ggccacgccc tcggccgccc cgggcatatc

181gtgcagccac gtgttggttt tggtgttgtc ggtgatgccc ggcgcgatgg tgttgacggt

241gattccccgg tgtcccagct cattggccag cctgggcgcc atgatctcga gggcgccctt

301gctcatggcg tagggcagca gcggccaggc gatcctggtg acggcggaag agatgttgac

361gatccgtccg ccgtcggcga ggagcggcag acaccgttgg gtgacgaaaa acggggcacg

421tacattgacg ctgaagatac ggtcgaactc ctcctgagtg acctcggaaa tgcccgccac

481atagccgtcc gcctgcgcgg cggccgggtc gtccgggtcg gcgtagatgg cggcgttgtt

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601gagggcgtcg tcggccgcaa ggtccgccct gatggcgaat gcctgcccgc cggcctgctc

661gatcgacgcg accgtttcct ccgcgtccgc tttgcaccgc ccgtagtgca cggccaccag

721aacaccttcg gcggcgagcc ttcgggcgat ggccgcgccg atgccccgcg acgcaccggt

781caccagtgcg gtttttccag ctgtttgggt cat

2

270

PRT(MeiF)

2

1mtqtagktal vtgasrgiga aiarrlaaeg vlvavhygrc kadaeetvas ieqaggqafa

61iradlaadda ldtlfselat glagrplnil vnnaaiyadp ddpaaaqadg yvagisevtq

121eefdrifsvn vrapffvtqr clplladggr ivnissavtr iawpllpyam skgaleimap

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241llasdearwv tgqlvdasgg malaptppgm

3

786

DNA(GDH)

3

1atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga

61aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt

121aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt

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301tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc

361tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc

421attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca

481agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc

541attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc

601gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa

661ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca

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4

261

PRT(GDH)

4

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